细菌抗药性认知与思考.doc

细菌抗药性的认识与思考【摘要】：随着抗生素的广泛使用，细菌的抗药性问题正在变得日趋严重和突出。本文就细菌抗药性的认识，以及对抗药性分子机理和防止对策进行了探讨。【关键词】：细菌，抗药性，机制，对策【正文】：自1929 年亚历山大弗莱明发现青霉素以来, 在对抗生素的研究和应用过程中人们发现了抗生素和细菌相互作用的两个现象:(1) 某些抗生素对某些菌种没有活性, 如青霉素之于大肠埃希菌; (2) 某些抗生素在使用过程中, 对某些菌种的活性逐渐减低, 临床治疗由有效逐渐无效, 如青霉素之于金黄色葡萄球菌,在1941 年青霉素刚刚用于临床时, 几乎100%的金葡菌对之敏感, 而今天则近100%耐药。我们把这两种现象称为耐药。1.耐药的简史1929 年亚历山大弗莱明在有青霉菌生长的肉汤的过滤液中发现青霉素, 该滤液对革兰阳性球菌(包括链球菌和葡萄球菌) 有体外杀菌活性。当时亚历山大弗莱明进行了动物实验乃至初步的人体实验; 实验证明该滤液有治疗效果。1940 年有研究者通过化学方法获得了青霉素纯品, 还阐明大肠埃希菌可以产生“青霉素酶”(准确名称应该是B2内酰胺酶) 破坏青霉素。1980 年, S. B.L evy 等阐明: 大肠埃希菌对四环素的耐药基于外排泵机制。1984 年,B. J. Hartman 等阐明: 金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药性和该菌产生的低亲和力青霉素结合蛋白(PBP) 有关。其他标志性事件2 包括: (1) 1946 年, 在磺胺临床应用11 a 后出现了耐药株; (2) 1959 年日本发现了可移动的耐药质粒(R 质粒) ;(3) 1961 年报道了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA ) ; (4)1974 年发现细菌转座片段中有耐药基因; (5) 1988 年在肠球菌中发现质粒介导的万古霉素耐药现象; (6) 1989 年发现了整合子和耐药基因盒等。2.耐药的起源和进化目前关于耐药起源的猜测包括: (1) 突变的管家结构调节基因如糖激酶、乙酰转移酶; (2) 天然耐药基因如ampC; (3) 产抗生素的菌株: 其耐受自身产生抗生素的机制被其他菌种获得。基于目前的实验条件难以完全验证这些设想。学者们推测自然界中耐药“基因池”(即和耐药相关的全部基因组合) 的遗传生态十分复杂。耐药作为一个自然现象, 在人类应用抗生素之前就已经存在, 有一个自然进化的过程。而目前已经发表的临床试验和荟萃分析证实1 : 人类对抗生素的应用作为选择压力加速了耐药的进化。同时, 人类应用抗生素形成的选择压力已经部分地改变了微生物的生态(包括对自发突变的选择; 在单个细菌菌体内累积耐药基因; 耐药亚群在该菌种整个菌株中的比例的改变等)。比如1983 年有研究证明3 : 多重耐药质粒是在近50 a 左右形成, 这种含有多个耐药基因的质粒的形成和抗生素临床使用时间的吻合有力地说明了人类应用抗生素对生态的影响。3耐药的传播耐药的传播可以基于三个层次: 菌株、质粒、基因。3. 1菌株传播又称克隆传播, 如MRSA 的传播MRSA 的遗传基础是该类菌株携带mecA 基因, 该基因编码PBP2a, 导致耐酶青霉素的结合力下降。有研究4 表明金黄色葡萄球菌获得mecA 基因在自然界可能只发生一次, 亦即目前世界范围流行的MRSA 菌株可能都是一个克隆的传播结果。而人的行为(如集体生活、旅游、抗生素应用等) 在克隆传播中扮演了重要角色。3. 2质粒或基因水平传播即水平基因转移(Ho rizontal genet ransfer,HGP) HGP 对微生物的进化很有意义5 。HGP 的主要机制6 包括: 接合、转化、转导。耐药基因播散涉及的片段包括: (1) 自主接合性质粒(Self2t ransm issible p lasm id) ; (2) 接合性转座子(Conjugat ive t ranspo son) ; (3)Mobilizable p lasm id;(4)NBU : nonrep licat ing Bactero ides units; (5) 转座子(T rans2po son) ; (6) 整合子和基因盒( Integron and gene casset te) 等。3. 2. 1质粒包括自主接合性质粒(Self2t ransm issible p las2m id) 和Mobilizable p lasm id 等。其中自主接合性质粒呈环状, 可以自主复制, 含有接合所需的基因和接合起点; 而Mobilizablep lasm id 除呈环状、可以自主复制和含有接合起点外, 不含有接合所需的基因。质粒接合的机制: (1) 接合性质粒以自主接合(self2t ransfer) 的方式完成接合, 即利用质粒自身携带的接合基因编码相应蛋白, 组合成接合器, 完成接合。(2)Mobilizablep lasm id 采用反式接合(T rans2mobilizat ion) 方式, 即由其他接合性质粒提供接合器。(3) 顺式接合(Cis2mobilizat ion) : 和其他质粒整合在一起形成整合质粒。(4) 逆向接合(Ret ro t ransfer) :有接合性质粒的供体菌通过接合向受体菌传递质粒的同时, 获得了受体菌内的质粒。自然发生的接合见于7 : 同菌种不同菌株间, 不同菌种间, 需氧菌和厌氧菌间, 革兰阳性和阴性菌间,细菌和酵母间, 细菌和植物间。后二者被称为跨域水平基因转移( t rans2k ingdom HGP)。3. 2. 2接合性转座子(Conjugat ive t ranspo son) 一般长18150 kb, 大多整合在细菌染色体上, 可以自切割环化, 自接合, 整合到受体染色体。耐药相关接合性转座子对耐药基因播散很重要, 尤其是在革兰阳性菌和拟杆菌。如tetM、tetQ、ermF、ermG基因的播散。3. 2. 3NBU (nonrep licat ing Bactero ides units) 一般长1012 kb, 可通过位点特异性重组整合在染色体上, 由接合性转座子通过反式接合完成移动。目前发现的NBU 多数无内容, 部分携带耐药基因, 可见于拟杆菌属, 大肠埃希菌。3. 2. 4整合子( integron) 含有两部分结构: (1) 基因盒: 含有一个开放阅读框架的非自主复制性DNA 片段, 一般整合到整合子内; (2) 整合子: 含有整合酶基因、启动子、基因盒整合位点的DNA 片段。整合子是一种特殊的转座子, 可以通过位点特异性重组完成移动。3. 2. 5抗生素可以作为信息素(pheromones) 诱导表达和接合, 诱导表达如阴沟肠杆菌中ampC 基因表达; 目前发现抗生素可以诱导质粒接合、接合性转座子接合、转座, 甚至该质粒或转座子携带相应抗生素耐药基因。3. 2. 6转化指微生物直接摄取游离DNA 自然转化见于: 链球菌属、嗜血杆菌属、奈瑟氏菌属、莫拉菌属、不动杆菌属、假单胞菌属等9 个菌属, 在耐药中扮演的角色相对较轻。3. 2. 7尽管转导是HGP 的一个主要方式, 但就耐药而言, 目前尚未发现自然存在的通过转导完成的播散。综上可见: (1) 质粒、接合性转座子、转化导致耐药基因在不同菌株间移动; (2) 转座子导致耐药基因在菌体内不同遗传位点间移动; (3) 整合子可以有效整合不同耐药基因, 形成多重耐药; (4) 耐药涉及的遗传片段有多种相互作用, 使得耐药的播散机制趋于复杂。4耐药的机制耐药的机制包括累积减少; 靶位改变; 酶灭活等1 。4. 1累积减少具体包括进入减少和增进外排(即外排泵机制)。多数是非特异性机制; 可介导多重耐药。4. 1. 1进入减少如亚胺培南对铜绿假单胞菌的活性基于一个通道:Op rD, 通过突变菌株失去该通道导致对亚胺培南耐药。该机制是一个特异机制。进入减少机制单独存在时很少引起明显的耐药, 如头孢噻肟对大肠杆菌孔蛋白突变株的M IC 仅比非突变株升高1 倍, 而产生超广谱B2内酰胺酶机制可使M IC 升高8 32 倍。4. 1. 2外排泵机制8 即菌株细胞壁细胞膜上有主动的外排机制。目前共发现五个家族的外排泵:M FS (majo r2facilitato rsuperfam ily )、RND ( resistance2nodulat ion2division fam ily )、SMR ( small mult idrug resistance fam ily)、ABC (A TP2bindingcasset te fam ily)、MA TE (mult idrug and toxic compound ext ru2sion fam ily) , 都是能量依赖的外排系统(基于电化学梯度能势或A TP 直接供能)。4. 2靶位改变是特异性机制。新的靶位形成如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌获得了mecA 基因, 该基因编码的PBP2a, 是一个新的靶位。该靶位对B2内酰胺类抗生素的亲和力很低。又如DHFS 和DHFR 介导的磺胺耐药。而原靶位形成变体如对红霉素的耐药, 红霉素的作用位点23S rRNA 甲基化, 导致其和大环内酯类抗生素的亲和力下降。该机制同时导致对林可酰胺( lin2co sam ide)、st rep togram in B、p rist inamycin 的耐药。又如对万古霉素的耐药, 革兰阳性球菌如肠球菌或葡萄球菌的细胞壁中形成交联桥的D2A la2D2A la 改变, 被D2A la2D2L ac 替代, 该变化不影响交联效率, 却使万古霉素亲和力下降1 000 倍。4. 3酶灭活属于特异性机制, 是对B2内酰胺类、氨基糖苷类和氯霉素类的主要耐药机制, 对复方磺胺和利福平至今未见该种机制导致的耐药。(1) B2内酰胺酶每个分子每秒可破坏103 个青霉素分子, 每菌株一般可产生105 个酶分子, 所以每菌株每秒可破坏108 个分子, 效率惊人。该酶的种类数以百计9 , 是阴性杆菌尤其是肠杆菌科细菌的主要耐药机制。(2) 氨基糖苷类抗生素的耐药酶包括: 腺苷转移酶(A denylyl t ransferase) : 在氨基糖苷类抗生素分子加上腺苷一磷酸(AM P) , 使其失活; 磷酸转移酶(Pho spho ryl t ransferase) : 加磷酸根使其灭活; 乙酰转移酶(A cetyl t ransferase) : 乙酰化使其灭活。氯霉素也是通过乙酰转移酶方式被灭活。(3)Robiscek 等10 在2006 年证实质粒介导的氨基糖苷类抗生素乙酰转移酶AAC (6) 2Ib2Cr 对喹喏酮类药物有活性。该发现不仅找到了第二个质粒介导的喹喏酮类药物耐药基因, 而且首次发现了由一种基因编码的酶对两类结构不同的抗生素底物同时有活性的现象。4. 4耐药的协同( synergy) 包括由单一机制(包括靶位重叠和外排泵) 引起的交叉耐药(Cro ss2resistance) 和多个机制引起的协同耐(Co2resistance)。4. 5耐药机制的相关影响因素包括(1) 累积突变(即量变) :如菌株对氟喹喏酮类抗生素的耐药通过gyrA 或parC 的逐步突变, 使耐药水平逐渐升高。由此研究者提出了突变抑制浓度(mutants p revent ion concent rat ion,M PC) 的概念11 , 将该研究进一步引向深入。(2) 生物膜(B iofilm) 12 : 生物膜是多个细菌个体形成的整体, 表现了其“社会性”。处于生物膜中的菌株个体,其耐药性和单个菌株个体有不同, 一般而言前者更能耐受抗生素的打击; 而生物膜是细菌在人体内存在的常见方式。5耐药的防止和控制防止耐药现象恶化, 控制其进化速度需要多个相关部门(包括医疗系统, 农业部门, 药物疫苗研发销售部门和决策机构等) 的协作。5. 1医疗系统13 需要完成的任务(1) 对耐药进行检测和监测: 有研究显示:WHO 药敏试验外部质控系统之一: 青霉素对肺炎链球菌的敏感性: 质控菌株M IC= 0. 06 Lgm l, 汇报范围在0. 007 2 Lgm l, 有40. 5%的实验室监测失败。所以我们需要合适的监测系统对抗生素的使用和耐药同时监测; (2) 减少耐药:包括抗生素使用环节(合理应用, 遵从指南, 避免耐药)、感染控制措施(手卫生, 隔离) ; 应用疫苗等; (3) 形成防止和控制耐药的指南, 并定期更新。有临床试验和数学模型支持: 减少抗生素使用和改变使用模式可以减少耐药的程度和频率。具体措施包括限制使用、轮转使用、改变处方模式。这些措施要求医生对抗生素的使用要基于对病原的比较准确的推测或明确的诊断, 即基于当地抗生素应用指南的经验治疗和基于抗生素敏感实验的有针对性治疗的同时要有意识的避免耐药; 同时要求患者提高防止耐药的意识: 有研究显示14 约11% 的患者就诊时会夸大症状以获得抗生素处方, 每4 例患者中就有1 个会省下抗生素以备将来, 同时还有国家至今没有将抗生素列为处方药。5. 2抗