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血吸虫病诊断技术研究进展摘要： 血吸虫病是诊断在其防治过程中举重若轻，总结了病原诊断技术、免疫诊断技术及其他诊断技术的研究进展，并提出展望。关键词 ： 血吸虫病；诊断技术血吸虫病是我国危害最严重的人畜共患寄生虫病之一。全世界有76 个国家和地区流行血吸虫病, 被感染人口达2 亿, 受威胁人群约5 6 亿, 严重影响人群健康和社会经济发展1。血吸虫病诊断在其防治活动中始终举重若轻，为防治活动的计划、实施和防治效果评价等各环节提供必要的信息和科学依据。寻找快速准确敏捷，且具有评价疗效和防治效果以及疫情的诊断方法是目前亟待解决的问题。本文主要综述前人对血吸虫的诊断技术，主要从病原诊断的进展、免疫诊断的进展及其他诊断方法来扼要介绍血吸虫病诊断技术研究进展，并提出展望。1 病原诊断的进展1.1 粪便中检测血吸虫卵1.11 加藤法2 取粪便置于载玻片上，用浸透甘油透明液的玻璃纸覆盖，轻压。镜检时需特别注意与未受精蛔虫卵的鉴别。此法与常规直接涂片法相比可提高虫卵的检出率。1.12 改良加藤法3、4 将筛网覆盖在粪标本上，刮取从筛孔挤溢出的粪便；将定量板紧贴于载玻片上，把刮棒上取得的粪便填满模孔，刮去多余部分，掀起定量板，在粪样上覆盖含孔雀绿甘油的玻璃纸条，展平后用压板加压，粪样即在玻璃纸和玻片之间铺成椭圆形；在3037温箱中透明0.51h后镜检并作虫卵计数；每克粪便虫卵数（EPG）为每板虫卵总数乘以24，再乘以粪便性状系数。此法操作简便，操作的过程中虫卵不会散失，效果好。1.13 过滤集卵镜检法 （1）定量集卵直检法5：取粪便置于网兜内搅拌荡洗后，移去网兜，将粪液倒入接有滤菌器的塑料针筒内滤过，然后取出尼龙网片置载玻片上直接镜检观察虫卵特征并统计虫卵数。定量集卵直检技术的敏感性高，虫卵检出率明显高于加藤法，与集孵法相当；并且该法检出的虫卵形态不变，结构清晰，很容易辨认，诊断准确。（2）改良滤纸集卵法6,：用福尔马林和水将粪便稀释，然后取此稀释液在滤纸上过滤，冲去粪渣，将滤纸置于培养皿中，用水将滤纸打湿后镜检虫卵。检出的毛蚴呈紫色，卵壳不着色。该法可以保存滤纸留作记录，并可避免虫卵的散失，但其检出率较低。1.14 孵化法 孵化法就是将除去粪渣后的粪便沉淀进行孵化，使毛蚴在短时间内孵出，以达到检测血吸虫目的的一种方法。具体又分为：尼龙袋法7、顶管法8、集孵法与促孵法9等。该法检出率高于常规方法，但用时太长，工作量大。1.2 组织内冲虫卵检测法 1.21 直肠粘膜活体组织检查 ：（1）组织钳夹取粘膜法：用直肠镜观察肠壁粘膜情况，选择有黄点或组织病变部位钳取组织粘膜.（2）刮检法：用直肠粘膜刮来刮取组织粘膜，刮检后仅有少量渗血，一般不需止血处理!与直肠粘膜活检法相比，该法阳性检出率虽略低，但检出活卵或近期变性卵的机会要高得多。（3）直肠显微镜检：用直肠显微镜的前后触夹住肠粘膜，在原位对肠粘膜进行检查。此法的优点为不损伤组织，安全方便。慢性及晚期血吸虫病人肠壁组织增厚，虫卵排出受阻，故粪便中不易查获虫卵，可应用直肠镜检查。1.22 肝活组织检查 穿刺取得的标本长12cm直径约1mm先放在吸水纸片上然后放入10的甲醛中固定。此法与直肠粘膜活体组织检查相比，给病人带来了较大的痛苦，出血时难以控制，故相对使用频率不高。但此法操作方法比简单快捷，也相对安全。2 免疫诊断进展2.1 常规检测方法2.11 皮内实验ID是一种检测受试者对血吸虫抗原的速发型超敏反应实验。若受试者曾经感染过血吸虫，那么机体内则有相应的抗体（皮肤致敏性抗体 IgE），当受试者皮内注射少量血吸虫抗原时，抗原与皮内肥大细胞表面的相应抗体结合，导致宿主局部毛细血管扩张，血管通透性增高，产生局部丘疹现象，即为阳性。若未曾感染过血吸虫，则注射后不会引起局部红肿现象，即为阴性10.ID便、快速、通常用于现场筛选可疑病例，与粪检虫卵阳性的符合率为90%左右，但可出现假阳性或假阴性反应，与其他吸虫病可产生较高的交叉反应；并且病人治愈后多年仍可为阳性反应11。故从20世纪90年代开始ID已经很少现场使用。2.12 尾蚴膜反应血吸虫活尾蚴与血吸虫病患者血清共同孵育，其体表能产生一个透明的套膜。将新鲜逸出的尾蚴或冰冻干燥尾蚴的排泄-分泌物作为抗原，加入受试者血清，盖上玻片，放入孵箱。若在尾蚴周围形成明显的透明膜或套膜，则为阳性反应。反则为阴性反应12。此法敏感性和特异性较高，具有早起诊断价值，可用于临床辅助诊断。但动物实验表明，在无再感染机会的情况下，尾蚴膜反应抗体可自然下降，因此易造成假阴性，在现场也基本不使用此种方法。2.13 环卵沉淀实验12成熟虫卵内毛蚴渗出的抗原ESP与血吸虫感染者的血清抗体结合时，在虫卵周围形成特异性沉淀物，即为阳性反应。反则为阴性反应。Oliver-Gonzalez13最早用环卵沉淀实验诊断曼氏血吸虫病，阳性率为100.0%，假阳性率为8.3%,嗣后的一些报道都证明该法具有较高的特异性和敏感性。因此，上世纪80年代被国内外公认为有效的血吸虫病血清学诊断方法之一14，广泛用于疫区。但其操作复杂，强度较大，检测耗时长，目前在疫区也基本不再使用。2.14 间接凝集实验IHA是将可溶性抗原（抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体（红细胞）的表面作为试剂，来检测标本中的相应抗体或抗原的一种血清学方法。将一系列倍比稀释血清加到血凝板上，并分别加入致敏细胞悬液，振荡，静置。以出现凝集反应的最高稀释度为阳性反应终点。IHA大致可分为4类：（1）IHA用抗原致敏红细胞以检测样品中的相应抗原；（2）反向间接凝集试验用特异性抗体致敏红细胞，以检测标本中的相应抗体；（3）间接血凝抑制试验；（4）反向间接血凝抑制试验15 。IHA操作简捷，快速有效，并且具有高度的敏感性和特异性，在临床检验中被广泛应用。但其诊断抗原的稳定性较差，交叉反应率稍高，且致敏红细胞存在着批间差异，反应易受客观因素的影响16 ，故仍待进一步研究。2.2 循环抗体的检测2.21 酶联免疫吸附试验（ELISA）17 Engvall等首先建立了酶联免疫吸附试验，他们把抗体或抗原吸附于聚苯乙烯试管壁上制成固相免疫吸附剂，用以测定抗原或抗体。Voller等改用聚苯乙烯微量反应板代替塑料管作为固相免疫吸附剂获得成功后，ELISA开始迅速得到推广和应用18。ELISA方法简易，试剂用量少，比较经济，适宜于自动化和大规模应用19.2.22 改进的ELISA检测方法 包括微波酶联免疫吸附实验、斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）20、金黄色葡萄球菌A蛋白-酶联免疫吸附试验（SPA-ELSA）21、动力学-酶联免疫吸附实验（K-ELISA）22、亲和素-生物素酶联免疫吸附试验(ABC-ELIA)23、快速-ELISA(FAST-ELISA)24等。2.23 酶标记抗原对流免疫电泳（ELICIEP）25：将虫卵抗原标记上辣根过氧化物酶，然后将此抗原与受检血清进行常规的对流免疫电泳，最后用能产生沉淀的相应底物系统处理，产生有色的反应，借以检测标本中特异抗体的存在!当抗原与抗体孔间呈现明显的棕红色沉淀线为阳性反应.ELCIEP除对血吸虫病具有辅助诊断价值外，还具有与环卵沉淀反应相似的疗效考核价值.2.24 胶乳凝集试验（LA）26 以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体，将抗原通过物理吸附或化学结合方法连结在颗粒表面，作为抗原试剂!将此胶乳试剂1滴加入待测血清中，如有抗体存在则出现清晰凝集颗粒即为阳性反应!早期采用物理吸附法，制成的抗原批间差异大，反应重复性不佳，未能广泛应用.最近改用化学交联方法制成虫卵抗原胶乳试剂，克服了上述缺点，测试结果证明有较好的敏感性和特异性.2.25 金标免疫渗滤法金标免疫渗滤法是近几年来从固相免疫测定法发展起来的新技术,它的特点是以微孔膜作为载体,用胶体金代替酶标记物,省略底物反应步骤,阳性反应呈红色斑点,肉眼清晰可见,操作简便快速,整个实验过程在数分钟内完成,且试剂稳定、易长期保存。2.26 胶体染料试纸条法（DDIA） 27将待测血清和标记染料加入PVC小杯中，用试纸将其吸干后，观察结果。当检测带与对照带均出现紫蓝色条带则为阳性28。DDIA是近年研制的用染料标记的日本血吸虫可溶性虫卵抗原检测日本血吸虫病人血清抗体的方法，其操作简单、快速，价格低廉，不需要专门设备，并且具有较高的敏感性和特异性，因此，该法适合进行大规模的血吸虫病人群普查的筛选.292.3 循环抗原的检测目前认为，循环抗原的存在是现症感染的依据，治疗后，宿主体内的循环抗原迅速消失。在感染的宿主体内，可检测出的循环抗原有肠相关抗原（GAA）包括循环阴极抗原（CCA）、循环阳极抗原（CAA）、卵相关抗原（EAA）、膜相关抗原（MAA）。从理论上讲，检测循环抗原有其自身的优越性，它不仅能反映活动性感染，而可以评价疗效和估计虫荷。 目前一般采用双抗体夹心法检测循环抗原,使用的抗体以针对抗原重复表位的单抗和多抗为佳 31 。最近也有用单链抗体的,但敏感性不高30 。使用的检测方法多种多样,有反向间接血凝(R IHA ) 、EL ISA、Dot -EL ISA、时间分辩免疫荧光、免疫磁珠分析、试纸条法、免疫渗滤法、杂交瘤细胞凝结实验和免疫传感器技术等。由于血吸虫循环抗原共有多糖表位,没有种属特异性 31 ,因此这些方法不能区分感染的虫种。一般认为,循环抗原水平与虫卵计数、甚至与临床损害程度有相关性 32, 33。用双抗体夹心EL ISA检测曼氏血吸虫CAA 的敏感性与kato - katz (一片法)相当 34 。曾有报道,血清中曼氏血吸虫循环抗原检测达到与粪检10 EPG相当的水平 35 ,但总的看来,循环抗原检测的敏感性一般不会高于常规kato - katz涂片法。2.4 循环免疫复合物的检测血吸虫抗原持续释放于宿主的血液促使循环免疫复合物（CIC）的形成。有学者认为：CIC形成可能是CAg转阴的原因，由于检测CIC相当于检测到结合的抗原，因而具有与CAg检测相同的检测意义。2.41 双抗夹心ELISA 法 宋文剑用双抗夹心ELISA 法检测日本血吸虫病 人特异性31/32kDa 循环免疫复合物, 阳性率为92.2%, 低感染度病人阳性率为90%, 中度感染及高度感染病人血清中CIC 阳性率为95.5%, 两者间无 显著性差异36。该法采用了直接检测过程, 免去了PEG 沉淀环节, 显示了较高的敏感性。2.42 抗KLH- ELISA法 汪世平等利用抗KLH- ELISA (Keyhole Limpet Haemocyanin,KLH, 钥孔蓝蛋白)检测免疫复合物, 显示慢性血吸虫病人血 清中循环免疫复合物阳性率达90%以上, 显著高于正常人血清对照组的7.4%37, 说明血吸虫病人体内确实存在免疫复合物。2.43 免疫印渍技术 国内外学者曾尝试检测解离后非游离抗原(NF- CAg), 以求达到较好地诊断病人和疗效考核效果。陈悦等采用免疫印渍技术对免疫复合物解离后组份进行检测, 发现不同试剂处理后免疫复合物的最终解离组份在含量上不相同38。2.44 125ICIq法检测循环免疫复合物 用血清与巴比妥缓冲盐水混合，加入125lClq和PEG孵育，离心，测沉淀中的放射性.本法属非特异性诊断方法.测定循环免疫复合物水平对免疫病理研究有参考价值.2.5其他免疫诊断方法2.51 尿液及唾液检测 传统诊断多使用受试者血清，受试者常不愿接受。而检测尿液和唾液中血吸虫循环抗原和特异性抗体的方法取样方便，易操作，无损伤，已经越来越引起研究者的重视。张恩英等 39 用单克隆抗体夹心-ELISA 检测日本血吸虫病患者尿液中的循环抗原, 间接法ELISA 检测尿液中的特异性抗体, 受检的10例急性血吸虫病患者和61例慢性血吸虫病患者, 尿液中循环抗原的阳性率分别为60.0%和40.0%, 特异性抗体的阳性率分别为80.0%和61.7%, 两者联合检测的总阳性率分别为100.0%和71.7%, 100例健康对照者尿液中仅3. 0%出现假阳性。目前用于尿液检测的多为单克隆抗体,普遍存在敏感性偏低或敏感性差异较大的问题, 因而研制敏感性较高的M cAg, 是尿液检测方法急需解决的首要问题。王兆军等 40 用ELISA 检测日本血吸虫病患者唾液中的特异性抗体, 唾液检测的敏感性为90. 6% ,特异性为94.4% , 与血清检测相比, 两者差异无统计学意义。但唾液标本的收集比尿液更为方便, 易为患者接受, 经标准化后, 在血吸虫病的诊断中具有一定的应用前景。2.52免疫传感器检测法39 该法是将高敏感的生物传感技术与高特异性的免疫反应相结合, 构建的新颖诊断血吸虫病方法。用柱层析法纯化S j31 /32 组分抗原, 经溴化氰活化的石英晶振包被, 与感染兔血清孵育, 测定其频移值, 结果用0.5mg /m l S j31 /32组分抗原包被压电膜晶体, 检测了不同感染度兔血清。当感染度增强时, 检测的血清频移值有明显上升趋势, 如感染度为500 条尾蚴时, 频移值分别为97Hz、142 Hz、202H z。表明压电免疫传感器对血吸虫病的血清样本具有较高的识别能力, 还能定量测定血清中的抗体水平。这一研究将为快速定量自动化检测血吸虫病抗原或抗体打下基础。3 其他诊断技术进展3.1 血吸虫DNA检测技术 1991年以色列学者Hamburguer等41在曼氏血吸虫基因组中发现了一个121bp的高度重复序列;并以该重复序列为检测靶设计引物,建立了检测水中血吸虫尾蚴DNA的PCR技术42。Sandoval43等利用小鼠血吸虫病模型,创立了通过尿液检测非疫源地区是否感染曼氏血吸虫的PCR技术。3.2 血吸虫RNA检测技术 Hung 44 等报道了检测血液中和水源中的日本血吸虫尾蚴的微量检测方法- Real - Time PCR:设计一对日本血吸虫特异的引物,采用TaqMan探针技术,实时定量检测血吸虫的量,该法的检测灵敏度高于DNA检测技术,与光镜检测的结果显著相关。该法作为检测贫血发作地区水源中血吸虫的一种快速、特异、灵敏的检测手段。3.3 超声诊断45超声诊断起源于世纪40年代，血吸虫病的超声诊断发展史也大致相同.判断超声诊断日本血吸虫病异常的标准有：肝实质回声的改变、肝脾大小的测定、门静脉系统的测量。超声检查是非损伤性诊断方法，操作简便，能准确发现肝脏血吸虫病的病理改变可评估病情的严重程度在现场短期内可检查大量人群，立即可获结果若使用标准化方法，具有可比性。4 展望随着分子生物学和免疫化学等新技术的渗入，经过了国内外学者不懈的努力，我国对血吸虫病的诊断技术有了长远的进步。虽然，我们对血吸虫病诊断技术的研究取得了突破性的进展，但还须进一步解决一些关键的技术性问题，具体表现在：（1）寻求简捷快速有效敏感性好的检测方法；（2）寻求能区别现症感染、既往感染和鉴定虫期的诊断方法（3）联合诊断，以解决单一诊断不足；（4）解决诊断试剂存在批间差异和没有标准化的问题。有关血吸虫病的诊断试剂种类繁多，水平参差不齐，试剂质量才能在这批间差异，并且没有标准化。因此要解决检测试剂的标准化问题。（5）寻求疗效考核价值理想的血吸虫病检测系统。可以预见，随着研究深入，随着新技术的渗入，不久的将来定会取得突破性进展，随之出现一系列更为高效、简捷、特异性强、敏感性好的诊断方法。参考文献1Pan Handing, Huang Desheng,Wang K, et al. 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