重医临床检验免疫学.doc

搬砖超人小明明 2015.1.9临床检验免疫学一绪 论免疫学教学内容1.基础免疫学(Basic immunology) 相关内容：抗原、抗体、补体、细胞因子、HLA、免疫系统、免疫应答。 以免疫应答为中心。2.临床免疫学 (Clinical immunology) 1）抗感染免疫(Infection immunology)2）超敏反应(Hypersensitivity)3）自身免疫(Autoimmunity)4）肿瘤免疫(Tumor immunology)5）移植免疫(Transplantation immunology)3.免疫学实验技术(immunological techniques) 即：免疫学检验，根据免疫学基本理论建立起来的试验方法二抗原抗体反应抗原抗体反应是抗原和相应抗体之间所发生的特异性结合反应，这种结合具有高度特异性，它既可以发生在体内，也可以发生在体外。发生在体内的抗原抗体反应，是机体体液免疫效应的表现方式，具有溶菌、杀菌、中和毒素及调理吞噬的作用。发生在体外的抗原抗体反应，根据抗原的物理性状（可溶性Ag或颗粒性Ag）及参加反应的物质不同,可分为：沉淀反应、凝集反应、中和试验及补体参与的反应等由于抗体都来自于血清，因此，我们将体外的抗原抗体反应又称为血清学反应。本章讲的抗原抗体反应就是指发生在体外的抗原抗体反应 抗原抗体反应原理1.Ag、Ab能特异性结合（内因）：Ag、Ab能特异性结合，是由于Ag表位(抗原决定簇)和Ab V区之间的特异性结合，二者在空间结构上是严格互补的。2.Ag、Ab结合的动力（外因）：静电引力（又称库仑引力）：它是指抗原和抗体分子上带有相反电荷-NH3+或-COO之间的相互吸引力。例如Ab分子上赖氨酸离解层中含有-NH3+，Ag分子上天门冬氨酸离后含有-COO，这两者之间就可相互吸引而产生静电引力。该力的大小与两个电荷间距离的平方成反比。距离越近，静电引力就越强。范得华力（又称电子云力）：该力是原子与原子、分子与分子间所具有的一种吸引力。当Ag、Ab两分子外层轨道上的电子相互作用时，电子云由于偶极摆动而产生吸引力，从而促使Ag、Ab的结合。该力大小小于静电引力。氢键：该力是由于分子中的H原子和电负性较大的O、N、S原子间的相互吸引而形成的。Ag（ -NH2、 -COOH 、-OH 、-SH）、Ab （ -NH2、 -COOH 、-OH 、-SH）可形成氢键桥梁，促使Ag、Ab的结合。氢键对于维持生物大分子（AgAb）的形态和结构有重要作用。它的大小大于范得华力。疏水作用力：Ab是蛋白质，Ag少数是多糖，多数也是蛋白质，那么它们就是胶体物质，在水溶液中就带有-NH3+或-COO极性基团，从而带上正电或负电 ，成为亲水胶体。当Ag表位和Ab Fab段相互靠近时，亲水层消失，排斥掉两者间的H2O分子，促进Ag、Ab的结合。疏水作用力在整个Ag、Ab反应中提供的作用最大。在高浓度电解质（如NaCl等）存在的条件下，NaCl可先与Ab分子结合（在Ab未与Ag相遇时） ，排斥H2O分子，从而使Ab蛋白质优先沉降，称为盐析现象 由于抗原抗体反应不含有共价键，因此抗原抗体反应不为化学反应，不产生新的物质。 AgAb AgAb抗原抗体反应特点1.特异性： Ag、Ab的结合实质上是抗原表位和抗体可变区之间的结合。Ab 可变区可形成一个平穴槽，Ag则楔状嵌入，由于两者在化学结构和空间结构上的互补，使得它们的结合具有特异性。这种结合如同钥匙与锁的关系，一把钥匙只能开相应的一把锁.交叉反应(cross-reaction)-抗体对具有相同或相似抗原表位的不同抗原的反应称为交叉反应。交叉反应并没有违背Ag、Ab特异性结合的原则，其产生的先决条件是不同抗原之间存在共同Ag表位。交叉反应的意义：1. 帮助免疫学诊断：eg 外斐氏反应等:用变形杆菌OX19、OX2、OXk作抗原查血清抗体，诊断斑疹伤寒（立克次氏体感染所致）2.可造成免疫病理损害：eg 链球菌感染后易导致肾小球肾炎，其原因为链球菌与人体肾小球基底膜有共同Ag表位所致。2.比例性： Ag、Ab的结合并不是在任何比例下都进行得充分、完全的。要形成我们肉眼可见的反应（如沉淀、凝集现象等），就涉及到最适比例问题。以沉淀反应为例：在一排试管中加入等量的Ab，然后依次向各管加入递增量的可溶性Ag，根据形成的沉淀物及抗原抗体比例可见：（图）：Ab过剩区，又称前带，此时，上清液中Ab过剩，大多出现的是可溶性抗原抗体复合物。：Ag过剩区，又称后带，此时，上清液中Ag过剩，大多出现的也是可溶性抗原抗体复合物。：是Ag、Ab合适比例范围，又称等价带。在这一带中，Ag、Ab反应充分，形成的沉淀物快而多；其中有一管Ag、Ab反应速度最快、形成的沉淀物最多，上清液中几乎没有游离的Ag或Ab存在。这时候，抗原抗体之间的比例称为最适比（顶点处）。利用沉淀反应对不同来源的抗血清比较后，发现抗体根据等价带范围不同可分为两种类型：R型抗体：它以家兔免疫血清为代表，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只有在Ag过剩时，才出现可溶性抗原抗体复合物。大多数小动物的免疫血清属于该类型。 H型抗体：它以马免疫血清为代表，抗原抗体合适比例范围较窄，在Ag、Ab过剩时，都可出现可溶性抗原抗体复合物。人和多数大动物的免疫血清属于该类型。3.可逆性： Ag、Ab结合形成抗原抗体复合物，这一过程是一个动态平衡，在一定的条件下，反应是可逆的：AgAb AgAb，其主要原因为Ag、Ab结合是非共价键结合，不为化学反应。抗原抗体反应的影响因素自身因素： 1Ag：与Ag的理化性质、抗原表位的数目及种类有关； 2. Ab：与Ab的来源有关：是R型抗体或H型抗体；与Ab的特异性、亲合性有关；与Ab的浓度有关。外界环境条件：1电解质：一般实验室所用电解质都是生理盐水（0.9% NaCl），浓度不能过高。浓度过高，会使Ab蛋白质优先沉淀而出现盐析现象。2PH：一般为PH 6-8,当PH50%饱和度（二）常用的中性盐：硫酸胺硫酸胺盐析的优点：溶解度大（饱和 700800g/1000ml)溶解度受温度影响小蛋白质不易变性操作简便缺点：需除去NH4+，透析时间长含氮，干扰蛋白质定量不纯的硫酸胺含有金属，可与蛋白质结合，因此硫酸胺需用分析纯试剂（三）方法：1.配制饱和硫酸胺溶液2.加入稀释血清3.透析去除 NH4+(奈氏试剂检测）注意：pH：硫酸胺pH应接近蛋白质的等电点，才易形成沉淀（Ig的pI=7.38.2，pH应7.7左右）蛋白质浓度：2.53%为宜，所以血清要稀释温度：室温即可（除特殊要求者）二.离子交换层析法原理：利用不同的蛋白质在缓冲溶液中所带电荷不同，与某一载体上的具有相反电荷的离子基团进行吸附，然后进行解脱，达到纯化蛋白质目的。常用载体是纤维素（DEAE） 例如在PH6.5的醋酸缓冲液中，侵泡DEAE，使DEAE带正电，因此它能吸附带负电的Alb、球蛋白（其PI均6，PH6.5PI，带负电），仅球蛋白PI为7.3，带正电（PH6.5 PI，带正电）不能被DEAE吸附而直接流出，此时收集的第一峰即为提纯的球蛋白。然后通过改变缓冲液PH和离子强度，使Alb、依次洗脱下来。方法：1.用酸处理载体二乙氨乙基纤维素（DEAE），使其带正电荷2.装柱3.加入蛋白质溶液，过柱时带负电的蛋白质吸附于载体上，带正电的蛋白质流出4.然后用碱性溶液洗脱三. 凝胶过滤法原理：凝胶颗粒是网格状结构，当分子大小不同的混合物通过凝胶柱时，分子大的先下来，分子小的则嵌入凝胶颗粒的网状结构中后下来，从而将分子大小不同的物质分离，即为分子筛的作用。常用凝胶：葡聚糖凝胶Sephadex、聚丙烯酰胺凝胶Sephacryl、琼脂糖凝胶Sepharose常用葡聚糖凝胶Sephadex的型号：G10、25、50、75、100、150、200蛋白质孔径愈小，选用型号愈小不同型号分离蛋白质大小不同，分离Ig多用G150方法：1.用缓冲液浸泡凝胶干粉，使其充分膨胀2.装柱3.蛋白质溶液过柱，收集过柱后的蛋白质溶液，一般5ml/小时凝胶过滤分离的优点：1.使用单一缓冲液，不需梯度洗脱2.用后凝胶不需要再生，可连续使用3.重复性好，样品回收率高4.不引起蛋白质变性和失去生物学活性缺点：1.网孔径大小有限，限制分离物2.凝胶可吸附芳香类、脂蛋白等物质，影响分离效果3.过滤速度慢（5ml/h），上样后要走1-2天四. 亲和层析法原理：利用抗原抗体的结合具有特异性、可逆性，将纯化抗原先交联到载体上，制成亲和层析柱，当Ab（Ig）通过时，与抗原在柱上特异性结合，Ab中杂质流出。然后通过改变缓冲液 pH、离子强度，使Ab解脱下来。方法：1.亲和层析柱制备：Sepharose 4B-（溴化氰）-吸附特异Ag装柱2.蛋白质溶液过柱（特异性Ag与相应Ab结合）3.改变缓冲液pH冲洗柱子，使Ag、Ab分离，收集Ab优点：分离的Ig很纯、柱子可反复使用缺点：柱子制备较复杂以上四种方法一般选用123种，或者一种方法反复进行23次思考题：1.分离提纯免疫球蛋白有哪些方法，其原理是什么？九单克隆抗体及应用（monoclonal antibody, McAb or mAb）一.概述 克隆：无性繁殖的细胞株 单克隆：由一个细胞无性繁殖而来的一个细胞株（一团细胞），其中所有细胞特性完全相同（一）单克隆抗体： 针对Ag分子表面某一抗原决定簇（表位）而产生的抗体分子，称McAb。单克隆抗体由一个B细胞克隆产生的识别单一抗原表位的同源抗体。 （二）产生 1. 1975年Kohler and Milstein首创用杂交瘤技术成功制备McAb 2.80年代初用基因工程成功制备McAb（三）制备McAb的方法 1.杂交瘤技术2.基因工程技术二. 杂交瘤技术制备单克隆抗体（一）杂交瘤技术（hibrydoma）制备单克隆抗体的原理B细胞（浆）+瘤细胞-（杂交）-杂交瘤细胞-（分泌）-单克隆抗体 （B细胞：能产生抗体的小鼠B(浆)细胞 瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞）1.B细胞(浆细胞）特点：1)能产生抗体2)但不能在体外长期培养3)细胞内含HGPRT酶（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶）和TK酶（胸腺嘧啶核苷激酶），可通过旁路途径合成DNA2.骨髓瘤细胞特点：1)能在体外长期培养2)不含HGPRT和TK酶3.杂交瘤细胞具有以上两种细胞的共性：既能产生抗体、在体外能长期培养；含有HGPRT和TK酶，可通过旁路途径合成DNA4.HAT培养液筛选出杂交瘤细胞（次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）：氨基蝶呤是抗代谢的药物，能阻断内源性合成DNA（合成DNA的主要途径）。氨甲蝶呤（叶酸拮抗剂）阻止合成DNA杂交瘤细胞（含HGPRT、TK）经旁路途径合成DNA5.B细胞、瘤细胞杂交，经HAT培养液培养数日后，五种细胞的存活情况：（1）B细胞：自然死亡（不能在体外长期培养）（2）瘤细胞：HAT培养液（氨甲蝶呤）阻止细胞合成DNA；同时无HGPRT、TK酶，不能通过旁路途径合成DNA，故死亡（3）B/B杂交细胞：自然死亡（4）瘤/瘤杂交细胞：死亡（5）浆细胞/瘤细胞杂交瘤细胞：可以生长（HAT培养液中氨甲蝶呤阻止 DNA合成；但其含有HGPRT、TK酶，可通过旁路途径合成DNA）（二）杂交瘤技术制备McAb的简要步骤：1.制备能产生单抗的杂交瘤细胞2.克隆化杂交瘤细胞3.筛选杂交瘤细胞 4.扩大培养单克隆杂交瘤细胞5.收集单抗并鉴定6.纯化单抗1.制备杂交瘤细胞（1）制备能产生McAb的小鼠脾（B）细胞：Ag免疫Balb/c小鼠-测抗体-取脾-制备脾细胞悬液-计数（2）细胞融合：脾细胞（B)小鼠骨髓瘤细胞杂交 脾细胞（1-5107/ml） 瘤细胞（107-8/ml） 融合剂：40%聚乙二醇（PEG）(3)筛选：培养过程中加入HAT培养液，培养14天，存活细胞为杂交瘤细胞。2.鉴定：将筛选出的能产生抗体的杂交瘤细胞进行鉴定：方法：采用ELISA、IF 间接法检测杂交瘤细胞培养上清液中有无目的Ab，包被已知Ag杂交瘤细胞培养上清（Ab？）洗涤，酶标羊抗鼠IgG 洗涤，底物根据显色判断有无特异Ab3.克隆化（1）有限稀释法：特异杂交瘤细胞稀释：7-10个/ml,取0.1ml/孔，反复稀释培养、测相关抗体（2）显微操作法：直接在显微镜下取单个杂交瘤细胞培养、测相关抗体 筛选和克隆化应反复交叉进行。 4.冻存或扩大培养（1）在液氮中冻存经鉴定后的杂交瘤细胞备用，需要时复苏（2）扩大培养（增殖），可得到大量单克隆抗体