栀子果实中环烯醚萜苷类护肝解毒功效研究.doc

栀子果实中环烯醚萜苷类护肝解毒功效研究摘要：环烯醚萜苷类是栀子果实中的主要有效成分，随着现代医学的发展，其在护肝养肝中的功效逐渐引起人们的关注和重视。栀子是一种常用中药，是一种茜草科植物，其别名又叫做黄栀子、山栀等。栀子适应性较强，在我国很多地方都有种植，在南方主要以野生为主，大多分布在江西、湖南、浙江、福建以及四川等地。最早在神农本草经中就有栀子作为药用植物的记载，随后其在药学上的功效被不断补充和完善。本草经集注中记载“栀子性寒，味苦，归心、肝、肺、胃三焦经”，主要治疗黄疸、烦心、目赤肿痛等热性症状疾病。现代对栀子化学药用的研究开始于上个世纪，从研究成果上看，现代科技已经分离鉴定出栀子中的几十种化学成分，其中有40多种化合物具有明显的化学药用特性，比如黄酮类、环烯醚菇类、有机酸酷类、d-甘露醇、幽醇类及色素等。而栀子果实中的有效成分环烯醚萜苷类物质，更是在治疗肝脏疾病方面有很好的疗效，能起到保肝利胆、清热解毒、抗菌消炎的作用。1.栀子果实中的环烯醚萜苷类有效成分栀子果实中的环烯醚萜苷类有效成分主要有：栀子苷、京尼平-1-、龙胆双糖苷、山桅苷甲酯、鸡矢藤次苷甲酯、经异桅子苷、去乙酞基车前草酸苷甲酯、桅子苷酸、山桅酯、桅子新苷、去乙酞基车前草酸等几种。2. 栀子果实中的环烯醚萜苷类的鉴定2.1仪器与材料本研究中用到的仪器主要是：SB-3200超声波清洗器、Eeppendorf高速离心机、ephadexTMLH-20、HKM-电热恒温干燥箱、DZF-6020真空干燥箱、waters半制备型高效液相色谱仪、1000ul定量环、2487检测器、反相硅胶RP-18、SENCO旋转蒸发仪（1000ml/10L）、大孔吸附树脂D101、Dionex分析型高效液相色谱仪、DJ-04B中药粉碎机材料：色谱纯乙腈、分析纯甲醇、分析纯乙醇、自制去离子水（Hi-tech的去离子水水机进行去离子水经过微孔滤膜）、桅子。2.2有效成分萃取用100ml 50%的酒精对3000g栀子干燥粉进行萃取，回流两次，2h/次；获得的萃取液进行过滤处理，然后用离心机离心10min，3000rpm；对其进行压力释放并浓缩，进行温度为60的真空干燥，获得的提取粉的质量为798.99g,计算物质的得率为26.63%。2.3大孔吸附树脂的准备大孔吸附树脂顾名思义不是利用阴阳离子交换集团进行吸附，而是利用本身的大孔构造，通过这种大孔有选择性的从水溶液中吸附有效物质。这种大孔物质吸附性好，比常规的交换树脂好解析，另外这种树脂的强度大，还可以重复使用，因为孔结构，其流体阻力相对的较小等。本研究利用大孔吸附树脂将环烯醚菇贰类化合物从栀子中萃取，达到初步纯化。将150g萃取物溶解在2000ml水溶剂中，充分混匀，利用1500g已经准备好的D101大孔吸附树脂进行层析，层析萃取的过程为2h，然后再用1500ml洗脱液进行洗脱，之后用有机溶剂600ml酒精进行冲洗，60行真空干燥乙醇洗脱后的部分，最终获得总环烯醚菇苷类物质50.48g，计算得率是9.3%。2.4葡聚糖凝胶柱层析上世纪60年代发展起来的一种新型的层析技术葡聚糖凝胶色谱技术。该技术操作没有难度，最大的优点是整个层析的过程不需要有机溶剂，利用其本身具有分子筛原理进行层信息，从而达到萃取的作用。本研究利用初步提取的环烯醚菇苷粉末3.0g,充分溶解于水，将样品加入到LH-20葡聚糖凝胶柱上柱。完成上柱后，用30%甲醇作为洗脱液进行洗脱，50ml作为一个流份，一共收集了20份。根据高效液相色谱图进行合理的整理，高效液相色谱的采用梯度洗脱，用LichrosPherC18column。高效液相色谱的流动相是CH3COOH:CH3CN=0.1:100，CH3COOH:H2O=0.1:100。将20份流份分成5种粉末，具体如下：粉末1是将获得的2-4合并的流份进行干燥，最终得到的粉末，对这些粉末进行检测，发现其含有的主要是H和J，一共270mg；粉末2是将5-7合并的流份进行干燥，最终得到的粉末，对这些粉末进行物质含量检测，粉末总重687mg，B、C、D和F是其主要含有的化学物质；粉末3是将获得的8-9合并的流份进行干燥，最终得到的总重789mg粉末，对这些粉末进行检测，A是其主要含有的物质。然后利用MS-HNMR和.3cNMR进行波普分析，获得的数据为桅子苷；粉末4是将流份10-11合并，然后干燥共获得112mg，经过检测分析，该粉末含有的化合物主要是G物质。粉末5是将流份1-2合并，然后干燥共获得278mg，经过检测分析，该粉末含有的化合物主要是E物质和I物质2.5反相硅胶柱层析用10%乙腈溶解经过大孔树脂提取，葡聚糖凝胶柱层析获得的粉末2，乙腈-粉末2溶液在离心机进行高速离心，离心10min,15000rpm，然后将所得的离心上清液体作为上样液，在反相硅胶中压柱上柱，该层析用正常的流速，流动相为乙腈一水(10:90,v/v)进行洗脱，一个流份10min，共获得50份。将HCLP分析合并，色谱条件同上，最终得到的粉末6是11-20流份合并，进行干燥，对这些粉末进行检测，F和少量D是其主要含有的物质。计算物质F的纯度为79%（峰面积归一化法计算）；粉末7是21-25流份合并，进行干燥，对这些粉末进行检测，D和少量F是其主要含有的物质。计算物质D的纯度为81%（峰面积归一化法计算）；粉末8是26-30流份合并，进行干燥，对这些粉末进行检测，C是其主要含有的物质。计算物质C的纯度为87%（峰面积归一化法计算）；粉末9是34-O流份合并，进行干燥，总重为185mg，对这些粉末进行检测，B是其主要含有的物质。计算该物质的纯度为98%（峰面积归一化法计算）；利用MS-IHNMR和-3CNM波普分析，将分析的数据进行整理，最终确定为京尼平-1-p-龙胆双糖苷。2.6半制备型反相高效液相色谱把经过大孔吸附树脂-葡聚糖凝胶处理后得到的粉末与5%的乙腈混合，使其充分溶解，并用半制备型反相高效液相色谱仪对其进行分离纯化。可得到化合物H和J，含量分别为92mg和25mg。通过高效液相色谱对其进行纯度检测，可知两种化合物纯度均在99%以上，对其进行MS、1HNMR和13CNMR分析，可知，H化合物为山栀苷，J化合物为乙酰基车前草酸。 把经过大孔吸附树脂-葡聚糖凝胶处理后得到的粉末与6%的乙腈当中，使其充分溶解，并用半制备型反相高效液相色谱仪对其进行分离纯化。通过高效液相色谱对其纯度进行检测，检测结果大于99%，对其进行MS、1HNMR和13CNMR分析，可知，改化合物为栀子苷酸。把经过大孔吸附树脂-葡聚糖凝胶处理后得到的粉末与5%的乙腈混合，使其充分溶解，并用半制备型反相高效液相色谱仪对其进行分离纯化。可得到化合物I和E，含量分别为41mg和118mg。通过高效液相色谱对其进行纯度检测，可知两种化合物纯度均在99%以上，对其进行MS、1HNMR和13CNMR分析，可知，I化合物为栀子新苷，E化合物为羟异桅子苷。把经过大孔吸附树脂-葡聚糖凝胶-反相硅胶柱层析处理后得到的粉末与8%的乙腈混合，使其充分溶解，并用半制备型反相高效液相色谱仪对其进行分离纯化。通过高效液相色谱对其进行纯度检测，可知该化合物纯度在99%以上，对其进行MS、1HNMR和13CNMR分析，可知，该化合物为去乙酰基车前草酸苷甲酯。把经过大孔吸附树脂-葡聚糖凝胶-反相硅胶柱层析处理后得到的粉末与8%的乙腈混合，使其充分溶解，并用半制备型反相高效液相色谱仪对其进行分离纯化。通过高效液相色谱对其进行纯度检测，可知该化合物纯度在99%以上，对其进行MS、1HNMR和13CNMR分析，可知，该化合物为去鸡屎藤次苷甲酯。把经过大孔吸附树脂-葡聚糖凝胶-反相硅胶柱层析处理后得到的粉末与8%的乙腈混合，使其充分溶解，并用半制备型反相高效液相色谱仪对其进行分离纯化。通过高效液相色谱对其进行纯度检测，可知该化合物纯度在99%以上，对其进行MS、1HNMR和13CNMR分析，可知，该化合物为山栀苷甲酯。3.栀子果实中的环烯醚萜类护肝养胃药理作用在栀子植物类中，包含着多种环烯醚萜类化合物成分，其中的环烯醚萜烷类、环烯醚萜苷类、环烯醚萜二缩醛酯类和裂环烯醚萜苷类是应用较多。国际上已经确定了环烯醚萜类的基本骨架，并通过对其环氧化、烃基化或者借助莽草酸能将其转换成各种不同的芳香酸酯，得到多种化合物，丰富其药理活性的研究成为未来发展的主要趋势。3.1对消化系统的作用3.1.1利胆作用 栀子能起到很强的胆囊收缩功效，具有明显的利胆排石效果，其药理作用明显高于水的效果，可以达到高脂餐所起的效应。这主要是栀子果实中的环烯醚萜苷类在起作用。在实验中，通过大鼠给药，可以发现大鼠的胆汁分泌明显。而京尼平苷的利胆机理是借助水解成京尼平来起作用的。实验中通过静脉注射京尼平可出现利胆功效。3.1.2对急性胰腺炎的作用人的机体可以借助生物酶的作用产生大量的氧自由基，这些自由基能够与多不饱和脂肪酸发生化学反应，从而形成一种脂质过氧化物。脂质过氧化物可以将活性氧作用到机体中产生出非自由基性的脂类分解产物，同时还可以发生链式反应，让活性氧发挥更大的作用。因此,初始的活性氧能导致多种脂类分解产物的形成。而这些产物有些对机体有害，可能引起机体功能障碍，有些则作为其他媒介继续发挥作用。栀子提取液对SAP(重症胰腺炎)大鼠具有明显降低血清及组织中脂质过氧化物活性水平的作用,这对维护机体自身的抗氧化能力,减轻SAP时氧自由基及其级联反应对机体造成的损伤,减轻胰腺损伤具有明显的正向影响。酸性磷酸酶为线粒体，琥珀酰脱氢酶(SDH)为溶酶体，细胞色素P450为线粒体标志酶，分析栀子对急性胰腺炎的治疗效果。其结果显示：胰腺腺细胞中的线粒体在急性胰腺炎后会出现功能障碍，此时施加栀子对其进行作用后，线粒体有氧代谢可以得到回复或者达到正常状态。琥珀酰脱氢酶(SDH)溶酶体中释放的酶可以促进胰腺自身消化。栀子对其作用后，其酶释放减少，膜流动恢复正常。另外，栀子作用 ，细胞色素P450含量也有所提高，说明此时细胞的代谢功能有所恢复。因此，栀子具有增强胰腺炎时胰腺的抗病能力。3.2护肝作用栀子提取物可以有效的增强动物的Y、Z蛋白量，提高结扎总胆管的GOT。同时，用不用炮制方法制成的栀子，其保肝效果也不完全相同，其中，生栀子的保肝效果最高，而炒炭制品则完全不具有保肝作用。说明栀子的护肝作用与其加工温度有关，当温度过高时，其护肝成分受到影响，当温度高于200时，其护肝成分被彻底破坏，护肝功效消失。研究发现，栀子中的有效护肝成分主要为栀子苷。在实际中，以生栀子作为治疗急性黄疸性肝炎的主要药品。栀子中的熊果酸还具有降低血清转氨酶的供销，对抑制肝癌细胞具有很好的治疗效果。3.3对胃功能的影响通过灌胃的方式，将栀子生药或者炮制品的水煎物作用于小鼠，来测试小鼠在饥饿状态下胃酸分泌以及胃蛋白酶活性的变化。实验结果说明栀子生品能有效抑制这两者生成，而炮制品的效果相对要弱，但是如果是姜制品反而能促进胃酸的分泌。栀子中的京尼平苷也可以抑制胃酸分泌，而在各种引起胃酸分泌亢进的药物中，京尼平苷对抑制碳酰胆碱有很好的效果。对大鼠注射京尼平，可以发现其能有效抑制毛果芸香碱所致的亢进运动,并使胃张力减少。因此认为京尼平对胃机能呈抗胆碱性的抑制作用。4. 栀子果实中环烯醚萜苷类其他药理作用4.1对心血管系统的作用4.1.1降压作用 栀子的水性提取物或者醇提取物在心血管降压效果上也比较明显，实验中不论是通过口服还是静脉注射都可以达到降压的效果。两种方式相比较，静脉注射起效快，但持续时间较短。另外，在实验中，发现栀子针对肾上腺素的升压以及抑制颈动脉血流的加压反射无法起到降压的作用，表明其降压作用与组胺释放无关。当栀子与普鲁卡因同时注射时，两者不会相互干扰，表明栀子的降压作用也不受传入神经纤维影响。而一旦切断双侧迷走神经，则降压效果会随之降低或不再起作用。说明栀子所起的降压主要是作用在中枢神经部位。4.1.2防治动脉粥样硬化及抗血栓作用 在临床手术中，经常会出现血管损伤愈合时细胞生长而造成的血管阻塞，进而引起动脉粥样硬化或者血栓形成。试验中可发现栀子果实中的一种提取物能有效缓解与防治动脉粥样硬化，并能起到抗血栓形成的作用，这主要是由于该提取物能够促进血管损伤部位的细胞原始纤维组织的生长，从而让内皮细胞发挥一定的作用。另外，对牛动脉内皮细胞层酸不溶性部分的结合研究中，利用生物测定而分离出的甘油和D-甘露醇可以刺激不溶性物质的结合，说明栀子提取物中有很好的活性成分。但是这种活性成分对牛动脉血管平滑肌无效果。4.2对中枢神经的作用4.2.1 镇静作用 通过对小鼠用栀子生品及炮制品的水煎液、异戊巴比妥注射液，等体积生理盐水研究镇静效果进行对比，发现栀子生品及炮制品的水煎液的镇静效果明显强于其它两种，能有效延长小鼠的睡眠时间，而水煎液的镇静效果在200以下时与温度的高低呈正向线性关系。4.2.2 镇痛作用 为了加强对比，实验对象选择了雄性昆明小鼠，并对小鼠禁食16小时，期间可以饮水。然后将小鼠分成4个实验组，并注射0.16%醋酸溶液，观察一刻钟内小鼠的扭体数，将结果与模型组对比，最后做t检测。实验结果说明1g的栀子浸膏可以有效减少小鼠扭体反应的次数，说明栀子浸膏对醋酸诱发的疼痛反应有抑制作用。4.2.3解热作用 临床治疗发热症状时，利用栀子生品与各种炮制品的提取液分别通过灌胃与皮下注射方式，都可以起到较好的降热效果，而栀子生品提取液的治疗效果更好，临床中的应用也证实了实验效果。4.3抗炎和治疗软组织损伤作用在软组织损伤方面，栀子对小鼠与家兔具有不同效果的抗炎消肿作用。在治疗小鼠耳壳肿胀以及甲醛导致的脚趾炎症中，分别用栀子醋酸乙酯提取物和90%乙醇提取物，都可以起到一定的抗炎效果，但是乙醇提取物的效果更好。对于软组织损伤，两者也有较好的治疗效果，但是乙醇提取物的效果稍显不足。其次，它们也可以治疗淤血损伤。4.4抗微生物作用在抗菌效果方面，栀子所表现出的抗菌作用并不是很好，针对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、卡他球菌