株蝗虫病原菌的分离鉴定及其毒力研究.doc

一株蝗虫病原菌的分离鉴定及其毒力研究【摘要】：从蝗虫自然病死虫尸中分离到一株病原菌HR-3，其纯培养物的致病性被科赫原理证明；从内地黄脊竹蝗自然病死的虫尸内分离到一种病原菌，其纯培养物经KOCK病症律证明，并按伯杰细菌鉴定手册（第九版）的方法进行了生物学鉴定、生理生化实验，并测定了其DNA中G+C mol含量为63.73%，确定该病原物为类产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）。为确定该菌在分类学上的地位，经生理生化测定和分子鉴定，此病原菌为粘质沙雷氏菌（Seerratia marcescens）。通过口服感染测定了该菌对蝗虫的毒力，毒力回归方程为y=1.067+0.809x，致死中浓度LC50=1.164108cfu/ml。为探讨HR-3对蝗虫致病的作用机理，对HR-3感染蝗虫后的组织病理进行了研究，结果表明感染初期蝗虫的中肠上皮细胞受到破坏，继而出现局部变性坏死。感染48h后，消化细胞层大部分区域被空泡状物充盈。【关键词】：类产碱假单胞菌，粘质沙雷氏菌，鉴定，毒力，病理，蝗虫【Abstract】：from the locusts natural death worm resin separation to the strains of pathogenic bacteria in HR - 3, the pure cultures of pathogenic by Koch principle; From the mainland huang ridge bamboo locust nature and death of the insect in the resin separation to a pathogen, KOCK disease law has proved that the pure cultures, and press berger bacteria identification manual (ninth edition) method to carry on the biology identification, physiological and biochemical experiments, and the determination of the DNA G + Cmol content is 63.73%, determine the disease original object for the class to produce alkali Pseudomonas (Pseudomonas pseudoalcaligenes). physiological and biochemical and molecular identification of the pathogen of serratia marcescens (Seerratia marcescens). With oral infection to determine the bacterial virulence of locusts, virulence regression equation for y = 1.067 + 0.809 x, lethal concentration LC50 = 1.164 x 108 cfu/ml. To study the role of HR - 3 of locusts and pathogenic mechanism of the HR - 3 infection after locusts histopathologic are studied, the results show that early infection of locusts in intestinal epithelial cells were damaged, and then a local degeneration necrosis. Infection after 48 h, digestive cells most floors are filled with air bubbles.【Keywords】：pseudomonas class production base, serratia marcescens, appraisal, virulence, pathology, locusts蝗虫属于直翅目（Orthoptera），蝗科（Locustidae）的昆虫，是一种世界性的有害昆虫，在我国全国性分布和危害，给农牧业带来巨大的经济损失1。尤其以北方最为严重，在北方草原，以其“种类多、数量大、分布广、危害重”等特点成为草地第一害虫2。仅以北方草原和青藏高原草地，每年发生并危害的面积近1000万公顷，严重危害牧草生长，是草地产草量下降3070%3，造成巨大的经济损失。近年来，我国蝗区范围扩大，发生面积增加，暴发频率提高，对农业生产构成了严重威胁。“九五”期间，全国飞蝗Locusta migratoria manilensis(Mey)发生面积累计达1.2亿亩次，特别是2000年飞蝗发生涉及12个省市区的160个县，发生总面积超过3000万亩次。据专家分析，蝗虫发生呈现不断加重趋势4。蝗虫的防治已成为一项非常紧迫的任务。随着化学杀虫剂大量而长期的使用所暴露出的许多缺点，作为一种防治农林害虫的新技术手段，微生物农药在世界范围内受到广泛重视5。在害虫的生物防治中利用昆虫的病原微生物便是很重要的一部分。蝗虫微孢子虫是我国研究生物防治方法控制蝗害的第一个成功例子，但是由于其历时长，不能短时间控制大规模发生的蝗灾。利用昆虫病原真菌包括白僵菌、绿僵菌和黄绿僵菌等开发的真菌灭蝗制剂经过田间实验也显示出良好的发展势头。1991年，刘世贵等从重庆市歌乐山林场黄脊竹蝗自然死亡虫尸中分离鉴定出蝗虫病原菌类产碱假单孢菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes)，并研制成“细菌灭蝗剂”，在草原使用取得了较好的灭蝗效果6。2004年，金虹等又从自然死亡草地蝗虫尸体中分离到蝗虫病原菌粘质沙雷氏菌（Seerratia marcescens）7。2004年陶勇等从土壤中分离到对蝗虫有较高致死率的几丁质酶产生菌C48。本文从一自然病死的周身发红的蝗虫虫尸中分离得到一种病原菌，经回复感染蝗虫，能引起蝗虫致病并死亡，并且从虫尸中分离到同样的病原菌，证明该病原菌为蝗虫自身的致病菌，对该病原菌进行了菌种鉴定和初步的毒力及病理学研究。1刘举鹏，浅谈我国一些重要代表性蝗虫J.生物学通报，1996,31（10）：8102刘世贵，四川大学学报，1992.29:28.3李克夫，马耀，杜文亮。中国草地，1992，(1):5052.4赵文臣.防治蝗虫问题的反思.科技交流，2000，10：3234.5赵文臣，防治蝗虫问题的反思J.科技交流，2000.10:3234.6刘世贵，袁兴，朱文，等. 一株蝗虫病原菌的分离和鉴定 J.微生物学报.1995.35(2):8690.7金虹，葛绍荣，刘世贵，等. 一株蝗虫病原菌的分离鉴定及其毒力和病理研究J. 微生物学报.2005.45（2）：172176.8TAO Yong, LONG Zhang-fu, LIU Shigui.et al. Identification of a Chitinaseproducing Bacterium C4 and Histop Atholodic Study on LocustsJ.Pest Management Science.2005.61:159165.1.材料和方法1.1菌种来源和供试昆虫病原菌HR3分离自一自然病死的周身发红的蝗虫虫尸。供试蝗虫采自四川省盐源县草地和蒲江县等地，虫龄为23龄，虫种为宽须蚁蝗Myreleotettix Polpalis(Zub),试前在室内观察34d后作感染用。1.2试剂Taq酶购自.TaKaRa公司,pGEM-T载体购于Promega公司，其它生化试剂均为国产分析纯。1.3培养基肉汤胨培养基：每升含牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂1820g，PH7.47.6，121。C灭菌30min。发酵培养基：每升含蔗糖10g，蛋白胨20g，NaCl 3g， PH7.47.6，121。C灭菌30min。生理生化鉴定培养基3!1.4病原菌分离和回复感染试验4将采集自田间一自然死亡的周身发红的蝗虫尸体浸入70%乙醇2s，消毒体表后，无菌条件下将其已腐烂的内脏制成匀浆，用无菌水稀释至适当浓度，涂肉汤胨平皿，28。C培养24h，挑取单菌落。将纯化后并经摇瓶发酵的菌悬液（109个/ml）喷洒到玉米苗上，舔食感染23龄蝗虫。每天观察记录染病蝗虫的症状。收集死虫，并进行病原菌分离，方法同前。1.5形态观察1.5.1菌落形态观察：纯化的菌株接种于肉汤胨平皿上，28。C培养48h后观察生长情况及菌落特征。1.5.2细胞显微形态观察：扫描电镜标本采用临界点干燥标本，其制备方法参照文献5,6。用JSM-840扫描电镜在加速电压10-15kV下观察。1.6生理生化试验参照文献3,7的方法进行。1.7 16SrDNA的PCR扩增和产物测序取对数生长期新鲜菌液，离心收集细菌，按文献8的方法提取基因组DNA。依据细菌16SrDNA中最保守的序列设计引物，由北京赛百盛基因公司合成。正向引物：5ATGGATCCGAGAGTrrGATCCTGGCTCAG一3；反向引物：5一TATCTGCAGTGGTGTGACGGGCGGTGT一3。PCR反应体系(50 UL)：10PCR缓冲液(Mg+)5 pL，dNTPs(10 mmol/L)1 UL，混合引物(10umolL)2uL，模板DNA25ul，Taq酶(5UuL)05ul，ddH20 39ul。PCR反应条件：94，4 min；94，1 min，55，1 min，72，1 min，共30个循环；72，10 min。PcR扩增产物经纯化后克隆进入pTA2T载体，送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。1.8系统发育分析测序得到1428bp的16SrDNA序列。结果输入核酸数据库（RDPII）9进行序列比较，将与之同源性最高的14株细菌模式株的16SrDNA序列，采用DNAMAN5.2软件的Multiple Sequence Alignment进行16SrDNA同源性分析，并构建系统发育树，发育树的构型和稳定性用DNAMAN5.2软件取样分析1000次，进行Bootstrap值分析和评价。1.9毒力测定田间采集健壮且个体大小基本一致的蝗虫，菌液（109个/ml.）用无菌水稀释至适当浓度，共设5个测试浓度，每个浓度试虫20头，设3次重复，空白对照用无菌水。口服处理后蝗虫放于特制纱笼中，48h后进行检查，统计死虫数，进行统计分析10,11，采用统计分析软件SPSS(V11.0)，以校正死亡率值法求毒力回归方程。1.10蝗虫感染该病原菌后的组织病理变化12,13,14用分离到的病原菌培养液对供试蝗虫进行滴口感染，以无菌水为对照。分别从菌液处理后12h、24h、48h的蝗虫中取样解剖，取中肠组织浸于固定液中。正常对照于24h后从对照组（无菌水滴口）中取样。按常规石蜡切片方法进行洗涤、脱水、透明、渗蜡、包埋、切片、粘片、染色等操作程序，将封好的玻片在普通光学显微镜下观察并拍照。2 结果2.1回复感染和病死虫特征根据科赫病症律，用分离的病原菌HR-3纯培养物回复感染2-3龄蝗虫，蝗虫于24h后开始死亡，72h达到死亡高峰，幼虫感病后行动迟缓不活跃，基本停食。死亡后躯体逐渐变红，挤出的液体呈红色并有臭味。回复感染原宿主后的病死虫病症与以前相同。并从回复感染致死的虫尸中重新分离到了相同的病原菌，确证U+1为致死蝗虫的病原菌。2.2菌体细胞形态和培养特征HR-3细胞呈短杆状，菌体长1.19-1.77um，宽1.08-1.20um，无芽胞（图1）。在肉汤平皿上培养48h后菌落呈圆形，光滑湿润，边沿整齐，表面隆起，菌落红色。图1 HR-3扫描电镜图(7000X)2.3 HR-3的生理生化特性鉴定结果（表1）表明，HR-3为革兰氏阴性，兼性好氧；V-P(Voges-Proskaner reaction)过氧化氢酶反应阳性；M.R(Methyl Red test，甲基红试验）、氧化酶、苯丙氨酸反应阴性；能利用蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇产酸，不能利用阿拉伯糖、乳糖产酸；能还原硝酸盐，利用柠檬酸盐和使明胶水解；不能在TSI上产生H2S。2.4病原菌的系统发育分析HR-3的16SrDNA序列测定结果表明，扩增的DNA序列全长1428bp，该序列在GenBank中的登录号为AY538657。根据测序结果用Ribosomal Database Project（RDP-II）15核酸数据库进行序列比对，从RDP数据库中选择14个同源性最高的模式菌与HR-3进行进化树分析（图2）。结果表明HR-3与Serratia marcescens和Serratia marcescens subsp .sakuensis形成一个簇群，同源性分别为99.2%和99.3%。因此确定该分离株属于粘质沙雷氏菌（Seerratia marcescens）。!/毒力测定毒力测定结果显示:2菌液对蝗虫有明显的致死作用。BC3时:2B=VC,U+XKY，毒力回归方程为4=NV_VNCVMT，相关系数2VNM（表;）!%组织病理学变化正常的蝗虫中肠细胞（杯状细胞和柱状细胞）排列整齐细密（图A）。经口感染的蝗虫，在=;3后杯状细胞明显增多（图G）；感染;B3后，消化细胞层细胞细胞核浓缩，溶解，局灶性变性坏死，呈丝网状（图W）；感染BC3后，整个消化细胞层完全变性，坏死，大部分区域被空泡状物充盈（图?）1材料和方法11材料111样品来源“细菌灭蝗剂”由四川大学草原生物防治工程国家实验室提供。草地蝗虫(Myrmeleotettix polpalis)采自四川盐源县草地，皆为健康无病的23龄幼虫。采回后在室内观察3 d后作感染用。112主要试剂和仪器主要生化试剂均为国产分析纯，购自四川成都高新区蜀都化验设备厂；Taq酶购白Taraka公司(大连)；pTA2T载体购自TOYOB0公司(日本)； 16SrDNA引物扩增序列由北京塞百胜基因公司合成；离心机为Eppendorf centrifuge5804R低温离心机(德国)；PcR仪为DNA Thermal Cycler 480型(PERKIN ELMER)；电泳仪为PowerPac300型(BIO RAD)；Tu一1800紫外分光光度计(中国北京)；GcMsQP20lO型气相色谱质谱联用仪(日本岛津)；0lympus光学显微镜(日本)；JSM一5900LV型扫描电镜(日本电子)。113培养基分离用培养基()：牛肉膏05，蛋白胨10，氯化钠05，琼脂18，pH=74。发酵培养基()：牛肉膏03，蛋白胨10，氯化钠05，pH=7476。生理生化鉴定用培养基9。9东秀珠，蔡妙英，常见细菌系统鉴定手册M.北京：科学出版社，2001：370398.12病原菌重分离、纯化和回复感染121病原菌重分离、纯化平板划线法和稀释涂布法分离纯化菌株10。1-22回复感染用分离、纯化出的菌株接种液体发酵培养基，48 h摇瓶培养后，喷洒到玉米苗上喂食感染23龄蝗虫，收集具有典型病症的虫尸。将病虫尸体浸入70乙醇中2 s，消毒体表后，移入525的次氯酸钠中35 min，去掉游离氯，用无菌水清洗虫尸35次，将消毒好的虫尸移入无菌水试管中，在无菌条件下将其已腐烂的内脏制成匀浆，用无菌水稀释至适当浓度，涂肉汤胨平皿，35培养24 h，挑取目标菌落，用划线法和稀释涂布法进一步纯化菌种，直到菌落形态和镜检都与菌种一致，保存菌种。13分离菌株鉴定13.1菌株hb形态观察菌落形态观察：将纯化的菌株接种于肉汤胨平皿上，经35培养48 h后，观察其生长情况及菌落特征。细胞显微形态观察：扫描电镜标本采用临界点干燥标本，其制备方法 89。用JsM一5900LV扫描电镜观察。132生理生化试验 6，10一12方法进行。133 16SrDNA的序列分析取hb对数生长期新鲜菌液，离心收集细菌，按 1 3方法提取基因组DNA。依据细菌16SrDNA中保守序列设计引物】，由北京赛百胜基因公司合成。正向引物：5ATGGATCCGAGAGTrrGATCCTGGCTCAG一3；反向引物：5一TATCTGCAGTGGTGTGA