园艺植物育种学实验实习指导.docx

园艺植物育种学实验实习指导目 录实验一 果树植物种质资源调查实验二 园艺植物开花习性的观察实验三 自花授粉植物有性杂交技术实验四 异花授粉植物有性杂交技术实验五 园艺植物花粉生活力测定实验六 园艺植物基因组DNA及总RNA提取技术实验七 化学诱变染色体加倍及其鉴定实验八 果树杂交后代的鉴选实验九 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析园艺植物同功酶实验十 植物抗寒性鉴定实验十一 大白菜的产量构成性状的品种间和品种内变异实验十二 无性繁殖园艺植物选择育种计划的制定实验十三 无性繁殖园艺植物的有性杂交育种计划制定实验十四 有性繁殖园艺植物的常规品种育种计划制定实验十五 有性繁殖园艺植物的杂种一代育种计划制定 实验一 果树植物种质资源调查*一、 *实验目的* * 通过参观果树种质资源圃，学习园艺植物果树种质资源调查的方法，从现有的资源中发掘优良的地方品种和类型，以及本地特色的野生果树资源，为生产提供有直接经济栽培价值的材料，或为育种及利用做砧木或商品提供有价值的原始材料。加深认识种质资源调查对栽培、育种、和科学研究的重要意义。*二、实验说明* *果树种质资源是果树品种选育工作中所采用的原始材料，包括野生类型、半野生类型、栽培类型以及人工创造的育种材料。育种的成就取得很大程度上决定于所收集种质资源的丰富程度，研究是否深入，优良性状是否得到充分利用。种质资源是育种工作的基础，不同的资源有不同的用途。正确地选择和适当地利用当地种质资源对创造新品种具有决定性的意义。因此，提高育种的水平和效能，必须首先进行种质资源的调查、收集、保存，这是育种工作的首要任务之一。果树资源的调查，主要包括地方品种和野生果树。地方品种是在一定地区的栽培品种，它们是在当地自然条件和栽培条件下形成的，没有经过现代育种技术的改进，但它们对当地条件有高度的适应性和抗逆性，适合当地的生产和消费习惯，同时它们有多样的变异类型，是果树选种的重要原始材料。但是，随着品种生产规模化栽培，使得有些具有某些优良性状的果树资源濒临灭绝，因此通过资源调查，挽救保存地方品种是防止种质散失的重要任务。野生果树是在长期进化和自然选择下形成的果树资源，具有高度的适应性和抗逆性，有丰富的抗逆基因，是抗性育种的重要原始资料，有些还可以做砧木，例如：本地的杜梨不仅可以用做砧木还可以将其作为育种的亲本。目前，果树种质资源保存的方法有下列三种：1、种植保存法；2、离体保存法；3、种子保存法。种植保存法，即种质资源圃，是目前的主要保存方法，可以分级分类建立。种质资源圃的建立要考虑到下列几个因素：要适合于所收集材料的生长发育，生态条件具有一定的地区代表性，栽培经验比较丰富，交通较方便、资源圃的材料分类可采用综合类法或植物学分类法，保存的量以便于保存，研究和节省土地为原则。*三、材料和用具*1材料：梨、野生杜梨、杏等果树。2用具：标本夹、采集箱、剪枝剪、标签纸、调查表、照相机、放大镜、天平、折光仪等。*四、方法和步骤*果树种质资源调查的时间，原则上可以在一年内分期进行，而以萌芽开花期和果实成熟期进行调查最好。调查工作的进程可分为准备阶段和总结阶段。（一）准备阶段1建立调查小组 将参加调查的同学划分为若干调查小组，进行分工协作。2拟订调查计划 在调查计划中应包括目的要求、调查内容、地点、方法、途径等项目。果树地方品种与野生果树资源的调查内容不同。野生果树因其是描述在参观中所识别的果树种质资源的主要形态特征、植物学分类和综合分类的类别。3进行试点调查 在进行全面调查之前，可选择有代表性的地点和植株进行试点调查，使各调查小组掌握统一标准，熟悉调查的方法。4收集相关的资料 广泛收集调查地区的有关参考资料，如：地方志、气象、地理等资料。5设计调查记载表格。（二）调查阶段1依靠当地的果农和群众进行走访调查，了解调查树种在当地的生产情况、如：栽培历史、品种、分布范围、面积、适应性、抗性，以及存在的问题等。2选定样株 观察植株的物候期、枝、叶、花、果等特性。3对调查树种的植株形态、果实进行绘图和拍照。4有条件可以做果品的生化分析等工作。（三）总结阶段1整理调查资料 将各类表格和数字资料进行整理统计；将所有调查的图表进行分类、归档。2写出调查总结 在调查报告中，首先要明确调查的目的和要求；说明调查树种和品种的情况：果树种类和品种名称、别名、来源、历史、数量、分布范围和面积、品种的植物学性状、生物学特性、适应性和抗逆性、存在的问题等。*五、作* *业*（一）每人根据调查实践，论述果树资源调查的重要性及其与品种选育的关系。 实验二 园艺植物开花习性的观察*一、 *实验目的*通过观察、了解果树花器结构和开花习性的主要特点及其与坐果的关系，作为制订杂交育种计划、选配杂交亲本和估计杂交进程的依据。从而掌握主要果树花器结构和开花习性的观察项目和记载方法。*二、材料用具*（一）材料 选择当地有代表性的果树树种作为供试株，进行观察。如苹果、梨、桃、葡萄等。（二）用具 镊子、培养皿、放大镜、纸牌、记载板等。*三、实验说明*不同种类果树花器结构和开花习性差别很大，所以杂交技术也各有不同特点，即使同种果树的不同品种类型也存在一定的差别，如葡萄中有具有完全花品种、雄蕊完全退化的雌能花品种、雄花品种（其中砧木较多）。果树花期的早晚和长短因种类、品种、以及气候、土壤等条件而异，开花前和开花期间的天气会影响开花的迟早和花期延续时间的长短。本实验应在萌芽前作好准备工作，如选株，制定表格，记载要求等。随着物候期推进和演变，按照物候期观察项目和标准，进行观察记载。开花期观测取样要注意地点、树龄、生长状况等方面的代表性，一般应选生长健壮的结果树，植株在果园中的位置能代表全园情况。观察株数可根据具体情况确定，一般每品种35株。*四、方法步骤*在确定了观察的品种后，选择具有代表性的植株，进行挂牌标记和编号，同时可以剪取即将开花的枝条插于盛水的瓶中，放置在实验室或温室内进行观察比较，每日定期进行观察。（一）花器的观察 取大的花蕾，观察花器各部分的结构，注意花药的柱头的位置，以便了解去雄的难易和方法，并绘纵剖图。此外，对单性花类型应分别采集雌花和雄花，并做图。（二）开花习性的观察1观察花在枝条上着生的位置。2观察花药开裂情况，散粉时间和花粉量的多少。3观察柱头分泌黏液情况和时间。4观察花序上不同位置花朵的开放情况。5观察记载开花物候期。下面分别介绍几个树种开花习性的观察* *苹果和梨开花习性的观察*苹果的花芽为混合芽，一个花序中有花58朵，为伞房花序，花具萼片、花瓣各5枚，花呈白色或淡红色，雄蕊1520枚，雌蕊的花柱分裂为5，基部合一，子房着生于萼筒内，为子房下位花，子房内有心皮5个，每心皮有2个胚珠，受精后内胚珠发育为种子。苹果花期714天，每花序开放过程26天，中心花先开，渐及四周，称为离心开，多数品种中心花坐果率高，（而梨花序开放的顺序为向心开：边花先开，中心花后开，多数品种中心花坐果率高）苹果开花的先后依次为老短果枝群，年青短果枝群，短果枝，中果枝，长果枝，最后是腋花芽。花器的观察 在苹果或梨的盛花初期，观察不同品种初开花朵的形态特征。花冠大小 测量盛开的10朵花的直径，求其平均值。花朵颜色 白、浅粉红、粉红、红。观察不同品种的花芽膨大期（花芽开始膨大、鳞片错开、以全树有25%左右时为准）；花芽开绽期（鳞片裂开、露出绿色叶尖）；花序露出期 （花芽外层鳞片脱落、中部出现卷曲状莲座叶、花序可观察到）；花蕾分离期 （花梗明显伸长，花蕾彼此分离）。开花阶段可以分为始花期（全树5的花开放）；盛花期（全树25的花开放为盛花始期，50花开放为盛花期，75的花开放为盛花末期）；落花期 （全树有5的花正常脱落花瓣为落花始期，95的花脱落花瓣为落花终期），将观察结果填入表2-1。 *表*2-1*开花物候期记载项目*品 种花芽膨大花芽开绽花序露出花蕾分离始花期盛花期落花期 * *桃花器结构和开花习性的观察*桃树花为完全花，通常有花萼5枚，花瓣5枚，雌蕊1枚，雄蕊多数成三轮着生，花梗很短，花托成杯状，花萼、花瓣及雄蕊着生于花托上，雌蕊与雄蕊的长短依品种而不同，桃的花芽为纯花芽，着生在一年生新梢上，在一株树上开花初期到盛花期大致经过57天， 桃的绝大多数品种是自花能实，因此，在杂交前必须去雄。由于核果类是纯花芽，花芽物候期略有不同。无花芽开绽、花序露出及花蕾分离期，增加露萼期（鳞片裂开，花萼顶端露出）、露瓣期（花萼绽开，花瓣开始露出），其他记载项目和标准与仁果类基本相同。* *葡萄花器结构及开花习性的观察*葡萄花芽为混合芽，着生在结果母枝的叶腋，枝条的中下部叶腋芽能形成花芽，但以基部38节形成的花芽最佳，在结果枝上应选择下部的花序供杂交用。新梢下部的花序比上部花序开放早。花蕾一般在上午611时开放，以910时开放最多，一个花序的花期约35天，柱头花蕾开放后46天内有受精能力。大多数葡萄的栽培品种是完全花，花很小，着生在复总状花序上（园锥花序），花冠绿色。上部合生，开花时下部与子房分离，向外卷曲成帽状脱落，雄蕊56个。在栽培品种中，除了完全花品种外，还有“雌能花”品种。这种花的雌蕊完好，有正常受精能力，而它的雄蕊花粉通常是不育的，没有受精能力。*五、作业*1、绘图说明梨或苹果花的开放过程。2、说明苹果或梨有性杂交最适的枝条和花朵，最适的去雄、采集花粉和受粉的时间。 实验三 自花授粉植物有性杂交技术自花授粉有两种含义，对于有性繁殖植物，是指雌蕊接受同一花朵的花粉；对于营养繁殖的果树等作物，是指同一品种（基因型）内的相互授粉。在自然条件下，以自花授粉为主的植物就叫自花授粉作物，又叫自交植物。自花授粉作物必然是兼有雄蕊和雌蕊的完全花；而且雄雌基本上同时成熟；不存在自交不亲和等特点；在花器结构上具有某些特点使自花授粉在整个传粉过程中占主导地位，其自然杂交率一般在5%以下。大体上可以分为花粉隔离型和花药包围型。1花粉隔离型：有些是整个花冠形成一个隔离空间，使外部花粉不能接触花柱，如小麦、燕麦、冰草等；有些是部分花冠如豌豆、豇豆等豆类蔬菜由两片龙骨瓣合生形成一个隔离空间，不仅使外部花粉难以进入，而且可以使花粉受到保护不易受昆虫吞食和雨水淋湿。2花药包围型：指花柱受到裂药雄蕊群的包围，如番茄等由若干枚雄蕊合生的花药筒紧紧地围裹在中间，在授粉受精前难以接触外来花粉。自花授粉作物群体是由许多遗传组成纯和的个体组成，即使个别植株或个别花朵偶然发生天然杂交，也会因连续几代的自花授粉，而使其后代的遗传组成很快趋于纯和。而且自花授粉作物具有自交不退化或退化缓慢地特点，自花授粉方式是在长期的自然选择作用下产生和保留下来的，具有对物种的生存和繁衍有利的特性。不同科、属的自花授粉植物的有性杂交技术也是不尽相同的，但是，在育种上人工去雄杂交还是一个重要手段。为了提高杂交的结实率，应注意掌握和改进杂交技术，本实验以番茄的杂交技术为例来说明自花授粉作物的有性杂交技术。*一、试材及用具* *1试材：供杂交用的亲本材料为番茄，同时也可根据实验安排，准备葡萄、大豆、芸豆、豇豆等。2用具：镊子、授粉器、放大镜、指形管（或小玻璃瓶）、干燥器、培养皿、剪刀、75%酒精棉球、纸袋、纸牌、铅笔等。*二、方法步骤* *（一）选择亲本并套袋1株选：作杂交亲本的种株，无论是父本还是母本，都应具有该品种的典型性，生长健壮，无病虫危害，选好后进行统一编号并套袋，以防昆虫等传递非目的性花粉。2蕾选（小麦是穗选）：番茄品种多样，有无限生长与有限生长之分，而无限生长型在整枝上多留单杆；有限生长型的则留24杆；这样选择的花序也有所不同：有限生长最好选23穗上的花蕾，每花序选留23个，而无限生长型，则选24穗上的花蕾，每穗留24个花蕾，其余的及已开放的，全部去除。（二）人工去雄番茄是雌雄同花，其正常的花药通常联合成一个筒状，其花粉的散裂方式是由花药先端向内纵裂，散出的花粉触及柱头而自交授粉，因此杂交去雄时必须于蕾期进行。去雄时的花蕾应选择：花冠微露、色泽为绿中泛黄。去雄的最佳方法是：先用左手的大拇指和食指夹住花柄基部，然后用右手持镊子伸到花药筒的基部，夹住后轻轻上提，技术熟练时，可一次将花药筒全部取出。葡萄、豆类多为闭花自交，被认为是最严格的自花授粉植物，要选择花冠由绿转淡绿，第二天要开放的花蕾为好）注意一定要把花药去除干净，并且注意不要损伤柱头。操作完成后，挂上纸牌、填好品种名称、株号、去雄日期及操作人等，然后套上纸袋。（三）花粉采集与贮备通常于晴天早晨露干后，在选定的父本植物上选取当天盛开的花，用镊子将花药筒取出，放入干燥器内干燥，24h后，将花药取出放在培养皿中，压碎后将花粉过筛装入指形管中备用。一般花粉在干燥、冷凉、黑暗的条件下保存寿命较长。用电动采粉器取粉时，一定要在天气晴朗时进行，以防因花器潮湿不利取粉。如果父本的花期晚，则需要进行催花，即将花枝采回室内插瓶，在温暖的条件下提前开花，然后取其花粉备用。（四）授粉通常在去雄的13d内，选择晴朗无风、早晨露干时进行授粉结实率最高。授粉时，动作要轻，用授粉器沾取少量花粉轻擦柱头即可，如果一株上有几个花序留蕾杂交时，可按从下而上的自然位置循序授粉，以防遗漏，为提高结实率，有可能也可重复授粉一次，可由上而下进行。操作完毕，在挂好的标牌上，填好父本名称及授粉次数、具体时间等，然后套好纸袋。在授粉后的810d检查结实情况，并按下表填写有关事项。注意：所有杂交工作一定注意操作用具的消毒及杀死遗留花粉，即每换一个杂交组合，均要消毒杂粉一次，避免混交。（五）授粉后的管理杂交后的最初几天要检查纸袋，如脱落、破碎则可能发生了意外的杂交，这些杂交花就无效了，应重新补做杂交。一周左右，花瓣开始凋谢，幼果渐渐长大时，就可以除去纸袋。以便幼果得到充分发育，同时要防止风、鸟以及病虫的危害。果实达到生理成熟后及时采收，检查结实率。*三、作业思考题* *1交回得到的目的性杂交种子。并将所得结果填于表31，以实习小组为单位汇总结果，并分析成功或失败的经验或教训，提出你的改进意见和建议。*表*3-1*杂交组合去雄日期去雄花数 授粉日期 授粉花数结实数结实率备注 2在自花授粉植物的杂交过程中应该注意的问题有哪些？为什么？ 实验四 异花授粉植物有性杂交技术异花授粉亦有两种含义，对于有性繁殖植物，是指在自然状态条件下雌蕊通过接受其他花朵的花粉受精繁殖后代的植物，对于营养繁殖的果树等作物，是指不同品种（基因型）间的相互授粉，又叫异交植物。异花授粉植物的群体是来源不同、遗传性不同的两性细胞结合而产生异质结合子所繁衍的后代。自花授粉植物和常异花授粉植物限于雌雄同花类型，而且限于被子植物少数几个科、属的草本植物。异花授粉则普遍发生于高等植物所有的科。多数异花授粉作物不耐自交，自交会导致生活力显著衰退。但是雌雄异株和雌雄异花同株类型主要靠其性别分化保证其异花授粉，未发现有特殊的自交不亲和机制。异花授粉作物在花器结构方面有着复杂的多样性，以多种方式适应异花授粉的需要。如开放传粉雌雄蕊异熟有利于异花授粉；风媒花产生大量小、轻而易于飞扬的花粉，雌蕊具有外露表面大而便于捕捉漂浮花粉的柱头；虫媒花具有对昆虫等传粉动物吸引力很强的色泽艳丽、浓郁而特异的气味、发达的花冠和蜜腺；自交不亲和机制以及上述两个或更多特性的联合机制等。因不同科属的异花授粉植物具有不同的花器结构，所以应在进行去雄授粉之前必须了解这些不同之处，十字花科蔬菜是目前品种最多，栽培面积最为广泛的蔬菜，并为典型的异花授粉作物，因此本实验以果树中的苹果和蔬菜中的甘蓝为主来说明异花授粉植物的有性杂交技术。甘蓝开花习性：花序为总状，主茎先抽薹，然后抽出一次枝，一次枝上又抽出二次枝。花的开花次序是先主茎、后一次侧枝、二次侧枝，整株的花是由上而下，而每一花序的花则是由下而上开放。早期开放的花会因温度低、授粉不良而结实率低，高次分枝（二次以后的各分枝）顶端的一部分花因营养不良而结实率低，且结的种子也不饱满，这些部位的花蕾均不宜选作杂交用。通过实验操作，掌握苹果、梨等果树植物、十字花科蔬菜、葫芦科蔬菜、百合科蔬菜、菠菜等异花花授粉作物的有性杂交技术；了解异花授粉植物不同的花器结构和开花动态；根据结果探讨不同杂交组合的结实情况；获得目的性杂交种子以丰富育种的原始材料。*一、* *试材及用具* *1试材：供杂交用的亲本材料。可根据实验要求准备试材，如：苹果、梨、大白菜、甘蓝、黄瓜、西瓜、韭菜、大葱、菠菜等。2用具：镊子、授粉器、放大镜、指形管（或小玻璃瓶）、干燥器、培养皿、花粉筛、剪刀、75%酒精棉球、纸袋、纸牌、铅笔等。*二、方法步骤*（一）亲本的株选杂交前必须慎重地选择亲本植株。所选择的植株，树龄最好1015年生，应当发育良好，在栽培上应给予特殊管理使它们在生长期内新梢长度能达5060厘米，叶片健康无病虫害，杂交时最好选用长果枝上的花，其次是中果枝，多复芽而充实的枝条坐果好，着生在树冠中部和上部的花比在树冠内部和下部的花可靠而又坐果好，一般以在长果枝上杂交45朵花能结23个果为原则，中果枝上杂交34朵花，杂交用花最好在枝条上有一定间隔，同一枝上不作杂交的花应该除去。由于十字花科蔬菜为异花授粉作物，品种内株间的差异较大，所以在选择亲本时一定要选择具有本品种典型性、生长健壮无病虫害的植株，选定后要统一编号，父母本要套袋隔离。（二）花序选择及整枝疏花一般十字花科蔬菜自然生长的种株分枝较多，而作杂交亲本时，为保证营养和种子的饱满，要适当整理植株，去除过多无效的高次分枝，杂交用花序应选主茎和一次侧枝上的为佳。每序留15个左右的饱满花蕾，去除已经开放或多余的幼小花蕾。（三）去雄与套袋除去母体植株花朵中还未成熟花药的操作叫去雄。去雄的目的是为了避免自花授粉和天然授粉，去雄通常在开花前12天，即花苞达最大而花瓣尚未裂开时进行。操作时左手握住去雄花的花梗，右手执着镊子小心的拔开花瓣使雄蕊露出，而后夹去带有花药的花丝；应该避免触破花药和触伤雌蕊。如发现花蕾内有虫或个别花药已裂，说明柱头有可能已接受其它花粉或本身花粉，则应去除不用。如果组合为正反交，可将去雄时取下的花药置指形管中保存，操作时不要损坏柱头，尽量减少破坏花冠。为避免去雄后的花朵天然杂交，在去雄后应立即套袋隔离，袋内要留有适当空隙，使花朵生长良好，袋自上而下套入，袋口用曲别针或细麻线缝在结果枝上，并挂上纸牌。套袋最好采用“袖筒式”套在整个果枝的中央，袖筒大小为27.5厘米9.0厘米，1张报纸做8个袋，也有单个花朵用一个纸袋的。为使柱头仍处在一个适宜的环境之中，十字花科蔬菜的去雄时间一般应在6:008:00和16:0018:00，因这时温度低，花器失水少，也有利于伤口的愈合。操作完毕后，要套以纸袋，以防昆虫等传粉。杏、李等果树作物，可采用将部分萼茼、雄蕊及花瓣一次去掉，授粉后套袋，这样显著的提高了杂交效率，在有限的授粉时间内，获得尽可能多的杂交种子。（四）花粉采集与贮备去除父本的套袋，选当天盛开的花朵，取回室内，将花药取下，集中于培养皿中，放入干燥器中干燥24h，再取出用花粉筛分离，将筛出的花粉盛入指形管中备用。一般花粉在干燥、冷凉的条件下保存寿命较长。如果父本的花期晚，则需进行催花，对果树植物如苹果、梨等可以将花枝采回室内插瓶（称为切枝水培），在温暖的条件下提前开花，然后按照上述方法取其花粉备用。（五）授粉去除母本纸袋去雄12d后的花（即当天盛开的花）用授粉器沾取少量父本花粉轻擦柱头即可，为保证结实率，可重复授粉。授粉的时间可在8:0011:00和15:0017:00为佳。少量花序授粉可用授粉器或毛笔蘸花粉授粉；大量花序进行授粉时可将花粉放在透明纸袋内，套到去雄的花序上，用手指从纸袋外面向花粉集中处弹23下，于是花粉便在纸袋中飞扬，约经半分钟，使花粉均匀的落在每朵花的柱头上以后即可取出；也可用小型喷雾器，当手压橡皮球时，将瓶内花粉喷在柱头，授粉操作完毕后，挂上纸牌，注明：父母本名称、株号、去雄日期、授粉日期、授粉次数、授粉（去雄）人等标记，套上纸袋，挂上标签，标明亲本和授粉日期。（六）授粉后的管理授粉10天后拆除纸袋，将布条扎在授粉花序上，半月后可进行杂交结实情况的检查。杂交后的最初几天要检查纸袋，如脱落、破碎则可能发生了以外的杂交，这些杂交花就无效了，应重新补做杂交。一周左右，花瓣开始凋谢，幼果渐渐长大时，就可以除去纸袋。以便幼果得到充分发育，同时要防止风、鸟以及 病虫的危害。果实达到生理成熟后及时采收，检查结实率。注意事项：1如果不同的杂交组合是在不同的隔离区内进行，应该分别穿用专用的工作服，以防止人为传粉；2杂交工具在每做完一个组合后要用75%酒精棉球消毒，杀死残留花粉。*三、作业思考题*1交回得到的目的性杂交种子。并将所得结果填于表12，以实验小组为单位汇总结果，并分析成功或失败的经验或教训，提出你的改进意见和建议。2异花授粉植物的杂交过程中应该注意的问题有哪些?为什么?3简述如何提高杂交结实率?表41杂交组合去雄日期去雄花数授粉日期授粉花数结实数结实率备 注 实验五 园艺植物花粉生活力测定在正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力，就是花粉的生活力。在育种工作中，有时需要将花粉保存一段时间。虽然人们已经知道，花粉保存以温度较低（015），空气湿度稍干（不能太干）、黑暗条件下为宜。但是各种不同植物花粉寿命长短相差悬殊，这一是由花粉本身的特征决定的，二是由贮藏条件决定的。一般来说，禾谷类作物花粉的寿命较短，自花授粉植物花粉的寿命尤其短，如小麦在花药开裂后30min，花粉即由鲜黄色变为深黄色，此时已有大量花粉丧失活力。在许多特殊条件下，花粉的生活力的测定显的很重要，如：1外地采集来的花粉或杂交时父本花期早于母本时都要将花粉进行短暂贮藏；2自交或远缘杂交时，为了分析结实率或不结实原因时；3为了鉴定雄性不育系时；4了解某些杂交技术时，如测定花粉的刺激等作用，测定受精选择性等。因此，要根据各种植物花粉的特点，采取适当的保存方法。花粉生活力的测定方法很多，其中发芽试验手续较复杂，设备要求较高，需时也较长。为了简易而迅速的测定花粉生活力，也常采用化学染色的方法，但是此法也有缺点，就是染上色的花粉不一定都具有生活力，因为染上色的花粉中也包括了那些生活力弱不能正常发芽的花粉，所以一般常用而且较为可靠的方法仍然是采用花粉发芽实验。要是要求不严格对新采集的花粉还有一个较简便的鉴定方法形态鉴定法。本实验目的是学习花粉生活力测定的方法，进而研究花粉寿命长短与环境条件的关系，以探求保存花粉的合适方法。*一、试材及用具* *1材料：几种植物的不同处理花粉；如：梨、黄瓜、杏、苹果植物的花粉。2试剂：配制好的缓冲液、联苯胺液、过氧化氢液、TTC粉、蔗糖、琼脂等；3用具：显微镜、载玻片、盖玻片、凹面载玻片、玻璃棒、擦镜纸、吸水纸、标签纸、铅笔。*二、方法步骤* *（一）花粉贮藏从发育良好的植株上采下将开的花朵、取出花药放在纸上或培养皿中，放于干燥的室内，令其开裂，花药裂开后将花粉倒入小玻璃瓶或指形管中，口上塞以棉花或橡皮塞，贴上写有品种名称的标签。再把花粉瓶放于干燥器内，使花粉在空气相对湿度较低的条件下（一般040%）保存；为了减少呼吸作用，可以放在低温（04）黑暗的地方贮藏。（二）花粉生活力试验1、直接检验法每个实验小组选定同品种种株去雄。注意：选用的花蕾最好是花前12d，且发育正常、饱满。每天去雄20个花蕾，然后套袋隔离，连续5d，共100朵花。这一实验要和花粉贮藏实验相配合，即花粉贮藏的当天开始去雄。授粉时，每去雄一次，分别授以两种不同贮藏条件下的花粉（各10朵），连续5d，就使得贮藏期分别为当天、第二天、第三天、第四天、第五天的花粉授到了去雄后的花蕾上。实验时，一定要挂牌标好品种、花粉贮藏期、贮藏条件、株号、授粉日期、授粉人。等最后一个处理完后十天，检验结实率和结籽率。将得到的结果填入表16。2、花粉发芽法人为的创造适合于花粉发芽的环境条件，以花粉发芽的情况来鉴定花粉生活力的强弱，此法的缺点是花粉发芽条件与实际不完全相符，所得的结果与实际有一定的差异，但操作方便，能测定出相对发芽率来。（1）培养基的制作与接种常用的花粉发芽培养基有液体和固体两种。以前者最为简便，本实验选用前者。其有效成分主要有：蔗糖、硼酸、柠檬酸、赤霉素等。不同的植物所用的蔗糖培养液的浓度是不同的。先配制520%的蔗糖或葡萄糖，加12%琼脂，溶于蒸馏水中，加热煮沸即可，再加0.1%硼酸数滴。将已配制好的培养基保持在40温度即不凝固，用玻璃棒点一点培养基敷在载玻片的凹坑内，然后用接种针或解剖针沾以少量花粉。取双凹载玻片，滴2滴培养液于槽中，用解剖针挑少许花粉均匀撒于培养液的表面（注意不必搅拌，以防花粉混于液体中因缺少空气而影响发芽，又因花粉深浅不一而在显微镜检查时因光线折射而不易观察。）将载玻片放在垫有湿润棉花培养皿内或倒扣在培养皿上，并贴上标签写明处理、种类、播种日期，将培养皿放于20的恒温箱中培养。（2）观察记数在显微镜下，隔一定时间检查一次（花粉发芽快的经过几个小时即可观察到已经发芽，慢的需24小时以上）若发现花粉已发芽时，便按一定方向，就同一视野中用记数器记录花粉粒总数和发芽数，观察记录35个显微镜视野的数字，求其平均数，即得出花粉发芽百分率。花粉发芽的标准，以花粉管伸长超出花粉直径为准。3染色法（1）过氧化物酶测定法原理：具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利用过氧化物使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉有无活力。a0.2克联苯胺溶于100毫升50%的酒精溶液；b0.15克a-萘酚溶于100毫升50%酒精溶液；c0.25克的碳酸钠溶解在100毫升的蒸馏水中。以上三种溶液分别放入棕色瓶中备用，使用时将这三种溶液等量配成试剂，放入棕色滴瓶中备用，在使用前准备好0.3%的过氧化氢水溶液作为试剂。使用时，先在载玻片上加少量待测花粉，然后在花粉上滴试剂和试剂各一滴，仔细搅匀，盖上盖玻片，经34分钟后，再放在显微镜下检查，有生活力的花粉呈红色或玫瑰色，无生活力的花粉为黄色或无色，为了确定具有生活力的花粉百分率，要连续观察35个视野，求其平均值，将观察结果填入表内。（2）碘-碘化钾染色法原理：正常的花粉积累淀粉较多，而不正常的花粉则少。据此，可用化学物质染色，根据呈色反应来间接测定花粉的正常与否和花粉生活力的差别。通常正常花粉用I-KI染色后呈蓝色，而发育不良畸形花粉则不积累淀粉，当I-KI染色时呈黄褐色。步骤和方法：取花粉撒于载玻片上，加一滴蒸馏水，用镊子使花粉散开，再加一滴I-KI溶液，盖上盖玻片置于显微镜下观察，凡被染色呈蓝色表示具有生活力，呈黄褐色者为发育不良生活力弱的花粉。（3）氯化三苯基四氮唑（TTC）法原理：凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生活力的花粉则无此反应，因此当TTC渗入有生活力的花粉时，花粉中的脱氢酶在催化去氢过程中与TTC结合，使无色的TTC变成三苯基甲（TTF）而呈红色。试剂配制：1磷酸盐缓冲液 在100ml的蒸馏水中，溶解0.832克Na2HPO42H2O和0.273克KH2PO4，调整pH值为7.17。TTC溶液 称取0.020.05克TTC, （不同植物所用的量是不同的）溶解在10ml的磷酸盐缓冲液中,放入棕色滴瓶内,置于暗处。TTC为有毒物质,操作时应注意安全。2步骤和方法：（1）取少量花粉放在载玻片上，并在花粉上滴上12滴配制液，用玻璃棒混合后盖上盖玻片。（2）将载玻片置于恒温箱中（3540）约1520min。（3）在显微镜（1010）下观察：凡具有生活力的花粉呈红色，部分丧失生活力的呈淡红色，无色的是死的和不育的花粉粒。3观察和测定结果：每片观察3个视野，统计具有生活力花粉的百分率，填入表中。4、形态鉴定法对于新采集的花粉来说，还有一个更为简便的鉴定方法形态鉴定法。将花粉用解剖针播于一般载玻片上，然后直接放到显微镜下观察，根据形态特征，判断花粉的生活力状况，一般来说，畸形、皱缩、小形化等均为无生活力花粉，而有光泽、饱满、具有本品种花粉典型特征等性状的均为有生活力花粉。将观察的结果统计后填写下表格。表5-1 花 粉 生 活 力 观 察 记 载 表种类处理时间发芽前花粉形态发芽后花粉形态花粉发芽率（或染色后具有生活力的花粉百分率）重复I重复重复总 计 播种 检查 花粉数未发芽发芽数发芽率%花粉数未发芽发芽数发芽率%花粉数未发芽发芽数发芽率%花粉数未发芽发芽数发芽率% *三、作业思考题 *1测定花粉生活力的意义有哪些?2分析在实验中出现的问题，并找出原因所在。3将四种方法的结果分别记载于表中，并比较结果是否一致，如不一致，分析其原因。* 实验六 园艺植物基因组DNA及总RNA提取技术幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段，核较大而胞质较少，核酸浓度高，且内含物少、次生代谢产物少，蛋白质及多糖类物质相对较少，在SDS或 CTAB物质存在时，经机械研磨，使细胞破裂并释放出内含物，提取的DNA、RNA的产量高，纯度好。提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活DNase。RNase存在于所有的生物中，并且耐沸腾、蒸煮，所以在提取RNA的过程中要防止RNA酶污染，用具如吸头、离心管、水、药品等都要经RNase的抑制剂DEPC处理，即每100mL溶液中加入0.10.2 mL DEPC溶液，37过夜，然后高压灭菌20 min以灭活DEPC。由于RNA容易降解，所有的提取步骤都在冰浴中进行。DNA（RNA）定量分析可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260 nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致表示DNA（RNA）量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA(RNA)样品的完整性来进行，缺点是不太准确。本实验介绍植物DNA、RNA提取及检测的方法步骤。*一、试材及用具* *试材：植物幼嫩组织（如幼叶、花器、幼根）。仪器、用具：离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪、电泳槽等。需配置的药品和缓冲液：提取DNA缓冲液（CTAB法）： 2% CTAB(W/V),100 mmol/L Tris-HCI pH 8.0, 20mmol/L EDTA pH 8.0, 1.4 molL-1 NaCl，2% PVP (灭菌后加入2% PVP ，使之充分溶解）。在研磨叶片前加入1%（V/V）ß-巯基乙醇。CTAB提取RNA缓冲液为：2% CTAB(W/V)，2% PVP(W/V)，25 mmol/L EDTA，100mmolL-1 Tris-Cl pH 8.0，2.0 molL-1 NaCl， 0.5 gL-1 Spermidine（亚精胺）。灭菌后加入2%（V/V）ß-巯基乙醇。SSTE buffer为：1.0 mol/L NaCl，0.5%SDS，10 mmol/LTris-Cl pH 8.0，1mmol/L EDTA。TE(pH 8.0)：称取1.211 g Tris、0.372 g EDTA-Na2 ，先用800 mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH 8.0，再用蒸馏水定容至1000 mL。高压灭菌20 min。氯仿/异戊醇（24:1,v/v）：将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4保存。酚: 氯仿:异戊醇(25:24:1)：按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀，置棕色瓶中，4保存。5 RNA电泳缓冲液的配制：依次加入以下成分：10.46 g MOPS 、1.7 g乙酸钠，0.93 g EDTA，调pH 7.0，定容到500 mL。RNA 加样缓冲液：1 mmol/L EDTA pH 8.0、0.25% 溴酚蓝、0.25%二甲苯青、50%甘油，高压灭菌。*二、方法步骤* *（一）植物基因组DNA提取在提取过程中用到的吸头、研钵、提取缓冲液等先高压灭菌20 min，取出后待用，按照下述步骤提取基因组DNA。（1）在65C水浴中预热CTAB提取液。（2）在液氮中研磨23 g新鲜或 -20C冷冻的样品材料。注意，要研成很细的粉末，动作要快。（3）迅速加入CTAB提取液，混匀，倒入离心管中，65C水浴30 min。其间不断轻轻摇动离心管。（4）加入5mol/L的乙酸钾充分混匀，在冰浴中放置30 min中，4C 12000 rpm离心5 min，吸上清。注意，对于幼嫩叶片此步可以省略。对成熟的老叶片需采用。（5）加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，放置10 min，12000 rpm常温离心10 min。（6）吸上清到新离心管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次。（7）吸上清到新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20C放置1030min沉淀DNA。（8）10000 rpm常温离心10 min。（9）倒掉乙醇，用400 L70%乙醇洗沉淀，然后用400L100%乙醇洗沉淀，吹干后用200500 L TE溶解DNA。（10）溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇抽提一遍。（11）吸上清到新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20C放置1030 min ,沉淀DNA。（12）离心，弃上清液，70%乙醇洗沉淀，再用100%乙醇洗沉淀，吹干后，用200LTE 溶解DNA。用紫外分光光度计测定浓度后，按要求的浓度（如200 gL-1）再向DNA溶液中加入适量TE。在 -20C冰箱中可长期保存。注意，提取的DNA的质量由它的长度和纯度决定。轻轻操作DNA溶液和快速冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切割非常重要，不能振荡，不能使用太细口的吸头，也不能吸得太快。多糖、蛋白质及木本植物中的酚类物质是植物DNA抽提中的主要污染物，提取材料要尽量使用幼嫩叶