应用化学毕业论文-马铃薯中绿原酸的提取.doc

编编 号号 本本科科生生毕毕业业设设计计（ 论论文文 ） 题目：题目： 马铃薯中绿原酸的提取 化学与材料工程 学院 应用化学 专业 学 号 0501070115 学生姓名 王新荣 指导教师 孙培冬 副教授 II 二一一年六月 摘要 I 摘摘 要要 马铃薯是一种重要的粮菜兼用作物，同时它营养成分全面，营养结构合理，易于消 化吸收，是世界十大营养食品之一.在马铃薯的块茎中含有淀粉、蛋白质、脂肪、粗纤维 等营养成分以及胡萝卜素、抗坏血酸、酚酸等抗氧化物质.本文研究了马铃薯中酚酸物质 绿原酸的提取和纯化工艺.得到了相应的工艺参数. 采用超声波提取法对马铃薯中的绿原酸进行提取.适宜的提取工艺参数：pH = 2，70%的 乙醇溶液；料液比为1：8；提取温度：40；提取时间：30 min；提取次数：2 次；提取 功率：160 W. 利用紫外-可见吸收光谱法（Ultraviolet and Visible Spectrometry，UV-VIS）对马铃薯 中的绿原酸进行定性、定量检测.通过扫描标准品的紫外光谱曲线，确定绿原酸的最大吸 收波长是330 nm；在不同的提取条件下，测定绿原酸提取液的吸光度可以确定最佳提取 条件. 利用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）进行绿原酸 的定性分析.通过观察粗提液以及粗提液与标准品混合溶液的保留时间，得到的实验结果 为：粗提液中确实存在绿原酸，且两种溶液的保留时间几近相同，绿原酸峰两侧的杂峰 很小，可忽略不计. 采用树脂吸附法进行纯化.分别采用3种树脂：NKA-9型树脂（强极性）、AB-8型树 脂（弱极性）以及 D101型大孔树脂（非极性）.通过静态吸附和解吸附确定了NKA-9型 树脂具有较好的吸附和解析附效果，饱和吸附量为：6.85 mg/g，解吸率为：70.8%.；通 过动态吸附和解吸附描绘出的动态饱和吸附和解吸附曲线，可以知道，NKA-9型树脂能 够达到较好的饱和吸附与解吸附效果. 关键词：马铃薯；绿原酸；超声提取；树脂纯化关键词：马铃薯；绿原酸；超声提取；树脂纯化 Abstract II ABSTRACT The potato is a kind of important food dish saut and industrial crops, at the same time, it has the comprehensive nutrients as well as the reasonable structure of nutrition, the potato is one of the worlds top ten nutrition food which is easy to digest and absorb. There are starch, protein, fat, crude fiber nutrients in the potato tuber. Also, carotene, ascorbic acid, phenolic acids and other antioxidants were included. This paper studies the matter- the extraction and purification process of chlorogenic acid from potato phenolic acids. Through the experiment, I have got the corresponding technological parameters. We use the ultrasonic wave assisted extraction to extract the chlorogenic acids. The best technological parameters as follows: pH = 2, 70% ethanol as extraction solvent; tatio of material to liquor 1:8, the ultrasonic wave power 160W, the extraction temperature 40, the time for 30 min, to extract 2 times. Using the Ultroviolet and Visible Spectrometry (UV-VIS) to determine the qualitative and quantitative detection on the chlorogenic acid of the potato, we conform the maximum adsorption wavelength of chlorogenic acid is 330 nm through the Ultroviolet spectrum curve.In different extraction conditions, we can determine the best extract conditions by assaying the absorbency from the extract of chlorogenic acid. We use the High Performance Liguid Chromatography (HPLC) to determine the qualtitative analysis on the chlorogenic acid. Through the observation about the retention time of coarse extract fluid to determine whether there will be repetitivet peak after mixing the coarse extract fluid and the standard solutions, in addition, whether the retention time is nearly identical between the mixture solution and coarse extraction fluid. Experimental results show that: the coarse extraction fluid possess the chlorogenic acid. And we can see that there are merely miscellaneous small peaks which can negligible on both sides of the mixture solutions rentention time. Adopt the resin adsorption method to proceed purifying, we use three resins: NKA-9 (strong polar) type resin, AB-8 (weak polar) type resin and D-101 (nonpolar) type resin. We conform the NKA-9 type resin is the best resin of the three which possess the good adsorption and analytical effect through the static adsorption and desorption, the saturated adsorption is: 6.85 mg/g, the desorption rate is: 70.8%; we get the saturated adsorption and desorption rate about the NKA-9 type resin by dynamic adsorption and desorption. We can know that the NKA- 9 type resin can achieve good adsorption and desorpton effects. Keywords: Potato; Chlorogenic acid; Ultrasonic wave assisted extraction; Adsorption and purifying of resin 目录 i i 目目 录录 第 1 章 绪论.1 1.1 马铃薯概论.1 1.2 绿原酸的研究进展.2 1.2.1 酚酸类化合物.2 1.2.2 绿原酸的分布、结构及性质 .2 1.2.3 绿原酸的生物活性3 1.2.4 绿原酸的制备.4 1.2.5 绿原酸的分析检测方法5 1.3 绿原酸的发展趋势.5 1.4 本课题研究的内容、目的及意义.6 第 2 章 材料与方法.7 2.1 原料、药品和仪器.7 2.1.1 原料及预处理7 2.1.2 实验仪器7 2.1.3 实验药品试剂7 2.2 实验方法.7 2.2.1 马铃薯中绿原酸的定性、定量分析7 2.2.2 马铃薯中绿原酸的提取及提取工艺优化.8 2.2.3 马铃薯中绿原酸的纯化9 2.2.4 储藏条件对绿原酸含量的影响10 第 3 章 结果与分析.11 3.1 马铃薯中绿原酸的定性、定量分析.11 3.1.1 紫外分光光度法.11 3.1.2 高效液相色谱法.11 3.2 马铃薯中绿原酸的提取及最佳提取工艺14 3.2.1 提取剂的选择14 3.2.2 超声波辅助提取绿原酸的单因素实验14 目录 ii 3.2.3 正交实验.18 3.3 马铃薯中绿原酸的纯化.19 3.3.1 利用 HPLC 分析不同树脂的纯化能力19 3.3.2 吸附与解吸.20 3.4 储藏条件对马铃薯中绿原酸含量的影响22 第 4 章 结论与展望.24 4.1 结论24 4.2 不足之处及未来展望.24 参考文献.25 致 谢.27 马铃薯中绿原酸的提取 1 1 第第 1 章章 绪论绪论 1.1 马铃薯概述马铃薯概述 马铃薯（solanum tuberosum）又名洋芋、土豆、山药蛋，属于茄科一年生草本植物， 它以肥大的块茎供食用.马铃薯是一种营养成分全面、营养结构较合理、生产周期短、耐 旱、耐瘠薄、高产、适应性广的重要的粮菜兼用作物，同时它也是世界十大营养食品之 一1 .在全世界粮食作物中，马铃薯的总产量排名第四，仅次于水稻、小麦和玉米，马铃 薯已成为世界性重要的农业资源和多种工业加工原料2 .全世界马铃薯种植面积 1800 万- 1860 万 hm2，而我国常年种植面积约 500 万 hm2，居世界之首3 .我国的马铃薯主要分 布在黑龙江、吉林、内蒙古和云、贵、川等地，我国 1.3 亿 hm2的耕地资源中，有 60% 以上的耕地为旱地，靠天然降雨进行农业生产，而占我国耕地面积 60%的西部地区土地 多是瘠薄的旱地、山坡地，这些地方非常适宜发展马铃薯种植2 . 马铃薯营养丰富，是世界各国人民喜爱的主食之一.据分析：马铃薯的含水量很高， 达到近 80%；淀粉含量达到 18%，占干物质中的 80%以上；马铃薯的蛋白质含量也较高， 达到鲜薯中的 1.8%左右，而马铃薯干粉中的粗蛋白达到 9%左右；马铃薯块茎中无机盐 的平均含量约为 1.其中，每 100 g 鲜马铃薯中含钾 568 mg，含钙 10-40 mg，含磷 58 mg，含钠 28 mg，含铁 l mg，含铜 0.08 mg，含锰 0.5 mg，含硒 0.4 mg.上述这些元素的 总量占马铃薯块茎总干重的 4.4%左右.马铃薯中含有丰富的维生素 C，每 100 g 鲜薯含量 达 20-40 mg 左右，另外，马铃薯还含有维生素 A、B1、B2、B3、B6、K 等，其种类之多 是许多粮食和蔬菜所不及的4.另外，马铃薯具有调中、健脾益气、消炎解毒等保健作用. 可以看出，马铃薯是“十全十美的食物”. 马铃薯不但营养价值高、具有广泛的药用价值，而且还具有重要的抗氧化物质.如酚 酸、类胡萝卜素、类黄酮等5.马铃薯中具有如此多的有益物质，尤其是酚酸强大的抗氧 化功能以及应用的广泛性，所以引起了科研工作者对其比较大的兴趣.马铃薯果实可加工 成食品、淀粉、发酵产品，薯渣可制成醋、饲料等产品，然而马铃薯的皮却被人们在日 常生活和生产中丢弃掉，殊不知马铃薯的皮和渣中含有高价值的功能性生物活性成分.绿 原酸是马铃薯酚类物质中最重要的抗氧化成分，其研究和应用也逐渐被人们所认识.利用 马铃薯皮这种废弃材料进行绿原酸的提取将会降低其生产成本，扩大其应用范围. 1.2 绿原酸的研究进展绿原酸的研究进展 马铃薯是酚类化合物（Phenolics）和一系列抗氧化剂（Antioxidants）的主要食物来源 之一7.酚类化合物属于植物次生代谢产物，是多羟基酚类化合物的总称,它存在于包括马 铃薯等许多植物的组织中.酚类化合物按结构可分为酚酸类（Phenolic Acids） 、类黄酮类 （Flavonoids） 、1.2 二苯乙烯(Stilbenes)和木酚素类（Lignans）4.在马铃薯中，酚类化合 物主要分布在皮和皮层之间，约有 50%存在于皮及邻近的组织中. 酚类化合物具备抗菌、抗诱变、清除自由基的功能.自由基能够诱导氧化应激，氧化 应激会损害 DNA、蛋白质和脂肪，导致慢性疾病例如癌症，心血管疾病和炎症的引发.而 酚类化合物能够抑制自由基-诱导氧化应激和慢性疾病的引发.这些酚类化合物中的各种物 江南大学学士学位论文 2 质之间的协同作用要比单一的营养补充剂提供更好的保护能力5.其中，酚类化合物中约 90%是绿原酸，它属于酚酸类物质.由于酚酸类物质是功能强大的抗氧化剂，所以，以绿 原酸为主的酚酸类物质由于其潜在的健康效益在过去的几年中逐渐被关注. 1.2.1 酚酸类化合物酚酸类化合物 酚酸类化合物（Phenolic Acid）多为对羟基苯甲酸和对羟基肉桂酸的衍生物.由于其 分子结构羟基的高反应性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活性.酚酸类化合物主要 包括绿原酸(Chlorogenic Acid)、咖啡酸(Caffeic Acid)、没食子酸(Gallic Acid)、原儿茶酸 (Protocatechic Acid)、芥子酸(Sinapic Acid)、香草酸(Vanillic Acid)、丁香酸(Sringicy Acid)、 阿魏酸(Ferulic Acid)、对香豆酸(Coumaric Acid)、水杨酸(Salicylic Acid)等多种成分6. 酚酸是马铃薯中含量较高的一类生物活性物质，研究表明酚酸与植物的生长发育及 抗逆性、医疗保健、人体健康和食品质量等都有着密切的联系8. 1.2.2 绿原酸的分布、结构及性质绿原酸的分布、结构及性质 绿原酸在可溶性酚酸类化合物中是最为重要的物质，绿原酸广泛存在于高等双子叶 植物和蕨类植物中，主要存在于忍冬科忍冬属（Lonicera） 、菊科蒿属（Artemisia）植物 中.其中含量较高的植物主要为杜仲、金银花、向日葵等.另外，在蔬菜（如马铃薯、胡 萝卜、茄子9）等日常食用品中都含有绿原酸类物质. 绿原酸（Chlorogenic Acid）是由咖啡酸（Caffeic Acid）与奎尼酸（Quinic Acid）组 成的缩酚酸、异名咖啡鞣酸，化学名 3-O 咖啡酰奎尼酸（3-O-caffeoylquinic acid） ，分子 式：C16H18O9，分子量：354.30，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯 丙素类化合物10.绿原酸的半水合物为白色或微黄色针状结晶，在 110时变成无水化合 物，与稀盐酸共热产生咖啡酸.绿原酸在 25时水中溶解度约为 4%，易溶于乙醇、甲醇、 丙酮等极性溶剂，极微溶于乙酸乙酯，难溶于氯仿、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂11.绿原 酸的吸收波长约为 330nm，对紫外光有较强的吸收性.绿原酸的水溶液遇三氯化铁呈绿色. 绿原酸是由咖啡酸和奎尼酸缩合而成，为极性有机酸，性质不太稳定，这主要是由 于其特殊的分子结构，其分子结构中有不饱和键、酯键及多元酚三个不稳定部分.在从植 物的提取过程中，通过水解和相继分子内酯基迁移而发生异构化.绿原酸中含有的邻二酚 羟基结构不稳定，导致绿原酸受热、见光易氧化；高温加热易氧化分解.绿原酸是一种对 热敏感的化合物，在提取的过程中，应注意温度的控制，尤其是不能在高温、强光及长 时间加热的条件下操作.绿原酸的供试液要放置在棕色瓶、冰箱（2）保存时最为稳定 11、12. 图 1-1 绿原酸的化学结构图 马铃薯中绿原酸的提取 3 3 Fig.1-1 Chemical structure of chlorogenic acid 1.2.3 绿原酸的生物活性绿原酸的生物活性 绿原酸具有广泛的生物活性，现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、保 健、医药和日用化工等多个领域.绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、 增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等 作用.绿原酸的主要药理作用有： 1.2.3.1 降压作用 经多年临床试验证实的，绿原酸有明显的降压作用，而且疗效平稳，无毒、无副作 用.美国威斯康星大学等13研究发现杜仲绿降血压的有效成分是松酯醇二葡萄糖苷，桃叶 珊瑚甙，绿原酸，和杜仲绿原酸多糖类. 1.2.3.2 抑制突变和抗肿瘤 现代药理实验证明绿原酸有抗癌和抑癌之功效，日本学者研究了绿原酸的变异原性 抑制作用(antimutagenicity)，发现该作用与绿原酸等抗变异原性成分有关，揭示了绿原酸 对肿瘤预防的重要意义14.15. 蔬菜、水果中的多酚类如绿原酸、咖啡酸等可通过抑制活化酶来抑制致癌物黄曲霉 毒素 B1 和苯并a-芘的变异原性；绿原酸还可通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中的 运输来达到防癌、抗癌的效果.绿原酸对大肠癌、肝癌和喉癌具有显著的抑制作用，被认 为是癌症的有效化学防护剂16. 1.2.3.3 抗氧化作用 绿原酸是一种有效的酚型抗氧化剂，其抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏 酸、丁香酸、丁基羟基茴香醚（BHA）和生育酚.绿原酸之所以有抗氧化作用，是因为它 含有一定量的 R-OH 基，能形成具有抗氧化作用的氢自由基，以消除羟基自由基和超氧阴 离子等自由基的活性，从而保护组织免受氧化作用的损害17. 1.2.3.4 清除自由基、抗衰老、抗肌肉骨骼老化 绿原酸及其衍生物具有比抗坏血酸、咖啡酸和生育酚 （维生素 E） 更强的自由基清 除效果，可有效清除 DPPH 自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基，还可抑制低密度 脂蛋白的氧化.绿原酸对有效地清除体内自由基、维持机体细胞正常的结构和功能、防止 和延缓肿瘤突变和衰老等现象的发生具有重要作用18.杜仲绿原酸含有一种可促进人体的 皮肤、骨骼、肌肉中胶蛋白的合成与分解的特殊成分，具有促进代谢、防止衰退的功能， 可用来预防宇航员因太空失重而引起的骨骼和肌肉衰退，同时发现杜仲绿原酸无论在体 内还是体外，均有明显抗自由基作用. 1.2.3.5 抗菌、抗病毒作用 绿原酸和异绿原酸对多种致病菌有较强的抑制和杀灭作用，对急性咽喉炎症及皮肤 病有明显疗效，临床上用于治疗急性细菌性感染疾病.德国 Free 大学 E.Eich 教授在研究有 些植物次生代谢物作为抗逆转录病毒剂时，认为绿原酸是有希望成为抗艾滋病病毒 （HIV）的先导化合物 19. 这与英国专利报道的杜仲树皮或叶的碱性提取物治疗和预防 艾滋病毒感染者很有效果的结论相一致20. 江南大学学士学位论文 4 1.2.3.6 对心血管保护作用 绿原酸作为一种自由基清除剂及抗氧化剂已被大量的试验证明，绿原酸的这种生物 活性，对心血管系统能产生保护作用.异绿原酸 B 对大鼠具有较强促进前异绿原酸 B 对大 鼠具有较强促进前列腺环素（PGI2）的释放和抗血小板凝集作用；对豚鼠肺碎片感应的抗 体诱导 SRS-A 释放抑制率达 62.3%.异绿原酸 C 也有促进 PGI2释放作用.另外，异绿原酸 B 对血小板学栓素的生物合成和氢过氧化无诱发的内皮素损伤有极强的抑制作用16. 1.2.3.7 其它生物活性 由于绿原酸对透明质酸（HAase）及葡萄糖-6-磷酸酶（Gl-6-Pase）有特殊的抑制作用， 所以绿原酸对于创伤的治愈、皮肤健康湿润、润滑关节、防止炎症以及体内血糖的平衡 调控等都有一定得疗效21；绿原酸具有预防糖尿病、显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌 等药理作用；对月经过多，子宫功能性出血有良好的止血效果；对急性咽喉炎症有明显 的疗效.研究表明，口服绿原酸能够显著的刺激胆汁的分泌，具有利胆保肝的功效；它还 可有效抑制 H2O2引起的大鼠红细胞溶血作用10、12. 1.2.4 绿原酸的制备绿原酸的制备 1.2.4.1 绿原酸的提取方法 目前国内外对绿原酸的提取方法研究上主要有石硫醇法、铅盐沉淀法、醇沉法、有 机溶剂浸提法、回流提取法、索氏提取法、微波提取法、超声辅助提取法以及超临界流 体萃取法等. 靳学远22等研究了超高压提取菊花中绿原酸的最佳工艺条件为：40%乙醇、超高压压 力 300 MPa、超高压力时间 5.5 min，粉碎度 60 目，绿原酸得率达到 0.46%. 张凌裳23等利用酶解和超声相结合的方法得到的最佳工艺条件为：溶剂 pH 为 5.0， 酶解温度为 40，料液比为 1：10，超声时间为 30 min.在此最佳条件下绿原酸提取率可 达 3.05%.从与酶法和超声波法的比较试验得出，绿原酸提取得率比酶解高出 5.54%，比 超声波提取高出 16.68%. 王贤萍24等研究了超声波处理条件下超声波的设备参数和提取操作参数对苹果酚类 物质的提取作用效果.得到的最佳工艺条件为：功率 200 W，超声频率 40 KHz,提取温度 70，超声提取时间 30 min，pH 为 3，料液比为 1: 10 的条件下，提取率达 2375.60 mg/kg. 于基成25等以绿茶为材料，采用超临界 CO2萃取技术提取绿茶中的茶酚类物质.实验 结果表明：提取时间为 1h，提取温度为 60，压力在 25 MPa 时，茶酚类物质的萃取率 为 43.68%.当加入 65%的乙醇作为夹带剂时，茶酚类物质萃取率可提高到 56.37%. 1.2.4.2 绿原酸的合成 1.绿原酸的生物合成 植物体内绿原酸的生物合成包括一系列的酶促反应.在酶的催化条件下，葡萄糖转化 成莽草酸（Shikimic Acid） ，莽草酸转化成苯丙氨酸 PHE(phenylalanine)，后者经合成酶作 用得到绿原酸.绿原酸可能的生物途径为11.18： 马铃薯中绿原酸的提取 5 5 图 1-2 绿原酸可能的生物合成途径 Fig.1-2 Possible biosynthetic pathway of chlorogenic acid 2.绿原酸的化学合成 关于绿原酸化学合成的报道很少，已合成的绿原酸因未保护易水解基团，产率不到 5%. 近年 Michael11改进了这种方法：通过以奎尼酸起始的四步化学反应合成了绿原酸，总产 率达到 65%.该方法的关键中间产物是选择性修饰得到的双缩醛化奎尼酸，在其 3 号位上 与被保护的咖啡酰氯酯化，所得产物在酸性条件下水解去除保护性基团就得到了绿原酸. 1.2.5 绿原酸的分析检测方法绿原酸的分析检测方法 酚酸的分析检测方法有紫外分光光度法（UV） 、高效液相色谱法（HPLC） 、高效毛 细管法（HPCE）等.目前，应用较多的是紫外分光光度法和高效液相色谱法.本次实验主 要应用这两种方法进行马铃薯中绿原酸的分析检测. 于华忠26等在紫外可见分光光度法测定茶叶中绿原酸的含量具有快速、简便、易于 操作等特点，其线性方程为 C = 0.4625 A + 0.0017，相关系数 r = 0.9998，回收率高达 98.1%. 兰小艳27等在杜仲叶中绿原酸含量检测的研究结果表明：紫外分光光度法测定的结 果重复性好，精密度较高，相对标准偏差较小.绿原酸的测定波长为 324 nm,标准曲线相 关系数为 0.9989，加样回收率达到 100.646%，样品中平均含量为 1.839%. 彭密军28等在制备型高效液相色谱法分离纯化绿原酸中的最佳操作条件为：采用流 速梯度进行洗脱，流速先为 28 ml/min，然后为 45 ml/min；流动相为 15%的有机酸 B 和 0.1%的有机酸 E（体积分数） ；测定波长为 254 nm；进样体积为 10 ml；进样量为 2500 mg.通过该工艺分离纯化，制备回收率为 83.3%，相对标准偏差为 3.1%，绿原酸纯度达 98.61%. 张建华29等在高效液相色谱法测定马铃薯块茎的绿原酸含量的实验中得到的最佳工 艺是：C18色谱柱，250 nm*4.6 mm 5 um；流动相：水-甲醇-冰醋酸（30:70:2） ；流速： 1.0 ml/min；柱温：室温；进样体积：5 ul.得到的加样回收率为：97.5%. 刘淼文30等利用高效液相色谱法测定金银花提取物中绿原酸的含量的实验中，方法 是：国产 C18柱(4.6 mm*250 mm，7 um)；流动相为乙腈：0.4磷酸(12：88)；检测波长 为 327 nm；流速 1 ml/min；进样量 10 ul；柱温 25.结果：绿原酸在 0.071 6-0.6444 ug 范围内线性关系良好，r=0.999 6；平均回收率 99.99，RSD=1.61(n=6). 糖酵解 磷酸烯丙醇式丙酮酸 奎尼酸 D-葡萄糖 5-脱氢奎尼酸 磷酸戊糖支 4-磷酸-赤藓糖 5-脱氢莽草酸 奎尼酸 莽草酸 L-苯丙氨酸 反-肉桂酸 香豆酸 咖啡酸 绿原酸 江南大学学士学位论文 6 1.3 绿原酸的发展趋势绿原酸的发展趋势 绿原酸的主要来源是从天然植物中提取.国外（美、日、德等）大多是从咖啡豆中提 取.欧洲很多专利中提到将绿原酸用于抗脲酶化妆品、皮肤防晒霜和防止紫外线和染发剂 对头发损伤的洗发水中.日本将葵花籽粨中提取的绿原酸开发成水溶性天然抗氧化剂并且 利用绿原酸的抗氧化特性研制出了抗衰老化妆品12.德国已有通过四步化学合成绿原酸的 科学研究，使得绿原酸总产率达到 65%11.我国一直是从金银花、杜仲叶中提取绿原酸. 对于绿原酸的纯品我国主要依靠进口，价格十分昂贵. 目前，我国对于绿原酸的提取纯化以及开发利用水平远远落后于发达国家.因此，合 理利用丰富的植物资源以及大力开展绿原酸的提取纯化和绿原酸产品的化学合成工艺是 该领域的发展方向. 1.4 本课题研究的内容、目的及意义本课题研究的内容、目的及意义 近年来，随着抗氧化、抗衰老研究的不断深入以及消费者对天然抗氧化剂需求的急 剧增加，从植物中提取抗氧化、抗活性成分的研究倍受关注.酚类物质尤其是酚酸类物质 作为具有独特生物活性的天然抗氧化剂有着很高的商业价值.马铃薯是一种粮菜兼用作物， 营养成分全面，含有丰富的淀粉、蛋白质、维生素、无机盐成分以及类胡萝卜素、酚酸 等抗氧化物质，酚酸具有抗氧化、清除自由基等功能.马铃薯的酚类物质中约 90%是绿原 酸，绿原酸作为植物的一种次生代谢物，具有清除自由基、抗菌、抗病毒、增高白血球、 降血脂、保肝利胆等作用.因此绿原酸被广泛应用于医药、食品、日用化工等行业. 本课题拟从以下几个方面进行对马铃薯中绿原酸的研究: 一、绿原酸的分析：用紫外吸收光谱法和高效液相色谱法进行定性、定量分析. 二、绿原酸的提取：利用超声波提取法，得到最佳提取条件. 三、绿原酸的纯化：利用不同种类的树脂进行吸附，选取最优纯化绿原酸用树脂. 四、创新实验环节：探讨储藏条件对马铃薯中绿原酸含量的影响. 马铃薯中绿原酸的提取 7 7 第第 2 章章 材料与方法材料与方法 2.1 原料原料、药品及仪器、药品及仪器 2.1.1 原料及预处理原料及预处理 马铃薯 将马铃薯清洗干净并晾干，用不锈钢刀具削皮，厚度约 1cm，取皮层部分于 50热 风干燥 24 h 至干，粉碎过 60 目筛，装入密封袋置干燥器中备用. 2.1.2 实验仪器实验仪器 BX3300LH 超声波清洗器：上海新苗医疗器械制造有限公司 JA1003 电子分析天平：上海精科天平有限公司 SAEG PHS-3C 酸度计：上海埃依琪实业有限公司 101 型电热恒温鼓风干燥箱：上海锦昱科学仪器有限公司 JFSD-100-粉碎机：上海嘉定粮油仪器有限公司 SHZ-D（）循环水多用真空泵：巩义市英峪子华仪器厂 R-201 旋转蒸发器：上海申顺生物科技有限公司 恒温水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂 HZS-H 型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 TU1901 双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司 Waters 2487515 型高压液相色谱仪：美国 Waters 公司 2.1.3 实验药品试剂实验药品试剂 绿原酸标准品( 分析标准品， 98% )，甲醇(色谱纯)，无水乙醇（分析纯） ，丙酮， 盐酸，冰醋酸 2.2 实验方法实验方法 2.2.1 马铃薯中绿原酸的定性、定量分析马铃薯中绿原酸的定性、定量分析 本次课题用紫外分光光度法和高效液相色谱法进行对绿原酸的定性、定量分析. 2.2.1.1 紫外分光光度法 1最大吸收波长的确定 精确称取 4.628 mg 的绿原酸标准品，用纯甲醇溶解定容至 50 mL.得浓度为 92.56 ug/mL 的标准液，备用. 将标准液进行紫外光谱扫描，得到紫外光谱扫描曲线，确定最大吸收波长. 2紫外标准曲线的制作 分别称取上述 92.56 ug/ml 的标准液 1、2、4、6、8 mL 于 10 mL 容量瓶中，纯甲醇 定容至 10 mL，以空白试剂为对照，330 nm 条件下测定吸光度，建立紫外标准曲线. 2.2.1.2 高效液相色谱法 1. 色谱条件 色谱柱：Pro.No3C18，4.6 * 250nm；流动相：水-甲醇-冰醋酸 = （70:30:2；60:40:2；80:20:2） ；流速：0.8 mL/min ；柱温：室温；进样体积：20 uL 江南大学学士学位论文 8 ；检测波长：330 nm(使用紫外吸收分光光度计对绿原酸标准品溶液进行 300-400 nm 的扫 描，发现绿原酸在 330 nm 有最大吸收峰，因此检测波长为 330 nm). 2 流动相的选择 对甲醇-水-冰醋酸 = 30:70:2 ； 20:80:2 ；40:60:2 共 3 种流动相选择，确定合适 的流动相. 3 HPLC 对绿原酸的定性检测 分别向高效液相色谱仪内注射绿原酸粗提液和绿原酸标准品，通过比较粗提液与粗提 液+标准品的高效液相色谱图分析，如果二者的保留时间几近相同，那么可以证明在提取 液中存在绿原酸. 4 HPLC 对绿原酸的定量检测 精确称取 4.909 mg 绿原酸标样于 50 mL 容量瓶中，用超纯水溶解、定容.将其作为 贮备液，低温下保存. （1）方法 精密度实验：精密吸取 98.18 ug/mL 的绿原酸标准品溶液 20 uL，注入液相色谱仪， 连续进样 3 次，考察每次进样的峰面积. 稳定性实验：吸取同一浓度的绿原酸标准品溶液 20 uL,每隔 2 h 测定一次，连续进样 3 次，考察每次进样的峰面积. 重复性实验：将同一浓度的绿原酸标准品溶液重复进样 3 次，考察每次进样的峰面积. （2）HPLC 标准曲线的制作 精密吸取上述低温保存的贮存液并配制成 9.818、19.636、39.272、58.908、78.544、98.18 ug/mL 绿原酸标准品溶液，采用最佳 液相色谱条件，以绿原酸标准品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作图得绿原酸 的 HPLC 标准曲线. 2.2.2 马铃薯中绿原酸的提取及提取工艺优化马铃薯中绿原酸的提取及提取工艺优化 2.2.2.1 提取剂的选择 精确称取 2.0g 马铃薯干粉,按 1:10 料液比分别加入 pH = 3，体积分数分别为 50%、60%、70%、80%的甲醇、乙醇、丙酮溶液，混匀并浸泡 30 min，在 40 KHz，160 W，提取温度为 40条件下超声辅助提取 30 min，提取上清液放置在干净烧杯中，剩下 的沉淀再以 1:10 料液比分别加入提取剂，再超声提取 30 min，将得到的提取液与上清液 混合抽滤，将滤液定容至 50 mL，从 50 mL 溶液中吸取 1 mL 并定容至 10 mL 的容量瓶中， 将得到的提取液进行紫外吸光度测定，比较吸光度大小，确定最佳提取剂. 2.2.2.2 超声辅助提取绿原酸的单因素实验 按照 2.2.2.1 的实验步骤以下述单因素水平在 40 KHz，160 W 的条件下分别超声辅助 提取，每次改变一个单因素的水平，其它条件不变.所得提取液定容至 50 ml.按标准曲线 制作方法测样品中绿原酸的含量（所有处理均做 3 组平行）. 1.料液比为 1：4， 1：6， 1：8，1：10，1：12； 2.乙醇体积分数 50%，60%，70%，80%； 马铃薯中绿原酸的提取 9 9 3.提取温度 20，30，40，50； 4.提取时间 10, 20, 30, 40, 50 min； 5.提取次数 1， 2， 3 次； 6.pH 值为 2， 3， 4， 5； 2.2.2.3 绿原酸的正交实验 在单因素的基础上，选定因素水平，以提取次数 A，提取温度 B，乙醇浓度 C 和 pH 值 D 为因素，设计 4 因素 3 水平 L9（34） ，进行正交试验，优化组合.所选水平如表 2-1 所示. 表 2-1 正交实验因素水平表 Table2-1 Factor levels of orthogonal test 2.2.3 马铃薯马铃薯 中绿原酸的纯化中绿原酸的纯化 2.2.3.1 树脂的预处理 在室温下，分别将 AB-8 型、NKA-9 型以及 D101 型大孔树脂用无水乙醇浸泡 24 h， 让其充分溶胀，用蒸馏水洗去乙醇（直到取少量乙醇浸液以蒸馏水稀释至无混浊为止） ； 然后用 5%的盐酸溶液浸泡 24 h，用蒸馏水洗至中性；最后用 5%的氢氧化钠溶液浸泡 24 h，用蒸馏水洗至中性，然后浸泡于蒸馏水中备用31、32、33. 2.2.3.2 利用 HPLC 分析不同树脂的纯化能力 向 1.6 cm * 40.0 cm 的玻璃层析柱内分别装进一定量的 AB-8、NKA-9 及 D-101 大孔 树脂，然后向柱内缓慢倒入绿原酸粗提液 50 mL，调节上样流速，收集经纯化后的绿原酸 溶液.将收集到的绿原酸提取液分别进行 HPLC 测定，每次分别注入绿原酸提取液 10 uL，记录并分析不同树脂纯化后的 HPLC 色谱图. 2.2.3.3 吸附与解吸 1.树脂的筛选与静态吸附、静态解吸实验 称取处理后的 AB-8、NKA-9 和 D101 大孔树脂各 5 g，准确加入一定浓度的马铃薯绿 原酸提取液 25 mL，在 25,140 r/min 条件下恒温振荡 24h，充分吸附后，过滤，再用 25 mL70%乙醇解析 24 h，分别测定滤液及解析液中绿原酸的浓度，计算树脂的吸附量 （mg/g）及解吸率（%）. 吸附量 Q（mg/g）= (C0 Ce) * V0 / M 解吸率 B (%) = C1* V 1/ (CO-Ce)*V*100% 其中：C0 =吸附前供试液中绿原酸的浓度（mg/mL） Ce = 吸附后供试液中绿原酸的浓度（mg/mL） V0 =供试液体积（mL） A（提取次数） B（提取温度，） C（乙醇体积分数，%） D （pH 值） 1 20 60 2 2 30 70 3 3 40 80 4 江南大学学士学位论文 10 M = 树脂湿重(g) C1 解析液中绿原酸的浓度（mg/mL） V1解析液体积（mL） 2.动态吸附与动态解吸实验 称取 4 g 马铃薯干粉，按料液比 1:8 加入 pH = 2，70%的乙醇溶液，密封浸泡 30 min，然后超声提取 30 min，提取上清液后，剩余沉淀按上述再提取一次，然后将两次提 取的粗提液进行抽滤，最后将得到的澄清液定容至 100 mL，将其中 80 mL 溶液倒入分液 漏斗中，然后用 5 mL 的量筒于层析柱下进行接收，调节上样流速，每 4 mL 接一次，直 到 80 mL 溶液完全接完为止.将收集到的量筒进行紫外吸光度测定，记录数据并描绘动态 吸附曲线. 向分液漏斗中倒入 80 mL 的 pH = 2，70%的乙醇溶液，然后调节好分液漏斗与层析 柱的开关，确保流速一致，用 5 mL 的量筒于层析柱下进行接收，每 4 mL 接一次，直到 乙醇溶液完全流出即可.将收集到的量筒进行紫外吸光度测定，记录数据并描绘动态解吸 曲线. 2.2.4 储藏条件对马铃薯中绿原酸含量的影响储藏条件对马铃薯中绿原酸含量的影响 选择 20 颗新鲜、表皮无损伤、具有 2-3 个芽眼的马铃薯，2 颗为 1 组共分为 10 组， 每组中马铃薯形状和质量（约 150 g）基本相同.将 10 组马铃薯置于 20无光照条件下储 藏，每隔 3 天取一组测定绿原酸的含量变化并观察马铃薯表皮颜色的变化. 将马铃薯清洗干净并晾干，用不锈钢刀具削皮，厚度约 1cm，取皮层部分于 50热 风干燥 24 h 至干，粉碎过 60 目筛，装入密封袋置干燥器中备用.称取 10 g 马铃薯干粉， 按照料液比 1:8 用 pH = 2，70%的乙醇溶液进行提取，混合均匀后密封浸泡 30 min,然后 在 160 W，40 KHz,温度 40，时间 40 min 的条件下进行提取，抽滤减压，然后浓缩再 稀释定容到 25 mL.将得到的提取液分别标记并做 HPLC 进行定量测定. 马铃薯中绿原酸的提取 1111 第第 3 章章 结果与讨论结果与讨论 3.1 马铃薯中绿原酸的定性、定量分析马铃薯中绿原酸的定性、定量分析 3.1.1 紫外分光光度法紫外分光光度法 3.1.1.1 紫外光谱扫描曲线 图 3-1 绿原酸光谱扫描曲线 Fig3-1 Chlorogenic acid spectral scanning curve 由图 3-1 可知：绿原酸的最大吸收波长是 330 nm. 3.1.1.2 紫外标准曲线 01020304050607080 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Absorbency Abs Concentration of Chlorogenic Acid ug/mL 图 3-2 紫外标准曲线 Fig.3-2 The standard curve of UV 按标准曲线制作方法得出数据，用 Origin 处理得标准曲线得图 3-2.绿原酸标准曲线 回归方程为：Y = 0.05159 X + 0.0174，相关系数 R2 = 0.9996.结果显示，绿原酸在 10 ug/mL-80 ug/mL 浓度范围内呈良好线性关系. 3.1.2 高效液相色谱法高效液相色谱法 3.1.2.1 流动相的选择 1. 甲醇：水：冰醋酸 = 30:70:2 江南大学学士学位论文 12 Mv -10.00 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 分分 2.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.00 3.617 5.472 8.900 图 3-3 流动相 1-甲醇：水：冰醋酸 = 30:70:2 Fig.3-3 Mobile phase1-Methanol: Water: Glacial acetic acid = 30:70:2 2. 甲醇：水：冰醋酸 = 20:80:2 Mv -10.00 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 分分 2.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.00 3.808 4.114 5.260 6.046 图 3-4 流动相 2 甲醇：水：冰醋酸 = 20:80:2 Fig.3-4 Mobile phase1-Methanol: Water: Glacial acetic acid = 20:80:2 3. 甲醇：水：冰醋酸 = 40:60:2 Mv 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 分分 2.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.00 3.607 4.235 5.382 6.159 图 3-5 流动相 1-甲醇：水：冰醋酸 = 40:60:2 Fig.3-5 Mobile phase1-Methanol: Water: Glacial acetic acid = 40:60:2 甲醇：水：冰醋酸 = 20:80:2 以及 甲醇：水：冰醋酸 = 40:60:2 的流动相没有把峰很 好的分开，并且峰值最好出现在 5min 后，如果出现太早，绿原酸和杂质峰不能有效分离， 马铃薯中绿原酸的提取 1313 因此不能对样品中的绿原酸进行精确测定.甲醇：水：冰醋酸 = 30:70:2 流动相基线平稳， 能够达到基线分离，而且绿原酸峰没有干扰的杂质峰. 3.1.2.2 绿原酸的定性检测 1.粗提液的高效液相色谱图 Mv 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 分分 1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.00 3.109 3.350 3.532 3.913 4.386 4.883 6.594 7.208 7.819 8.805 9.911 10.841 11.861 12.534 13.684 图 3-6 高效液相色谱图粗提液 Fig.3-6 High perf