课题申报书-胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭.doc

二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。重症肝炎（又称暴发性肝功能衰竭）发生多与肝炎病毒感染、化学药物中毒等因素有关，我国又是病毒性肝炎发生大国，每年都有相当一部分病人患重症肝炎，每年仅重医大附二院传染科收治的重症肝炎病人就近几十例。重症肝炎以起病急、病情进展快、病死率高为特点，目前对它的发生机制仍未搞清，因此它严重威胁着人们的生命健康。国内现主要以综合疗法治疗重症肝炎，此疗法虽对改善疾病的某些症状有一定帮助，但并未从根本上改变该病的预后。国外多以肝移植来治疗本病，其近期疗效明确而肯定，但远期疗效因受免疫排斥反应的制约而不容乐观。近两年国内几家大医院也相继开展了肝移植手术，但受手术复杂性、器官来源以及接受肝移植者需长期服用免疫抑制剂来避免排斥反应发生所造成的高昂药费和长期使用免疫抑制剂可能造成肾损害等因素的制约，仍限制了此疗法的开展。人和哺乳动物的肝脏具有强大的再生功能，2/3肝切除后的动物在10-15天左右残存肝脏可恢复到术前体积，而重症肝炎患者多表现为缺乏这种再生能力。究其原因除了残存肝细胞不能为机体代谢提供足够的肝功能支持外，激活的免疫细胞及其产生的炎症因子仍不断造成残存肝细胞坏死，甚至杀伤新生肝细胞，从而严重阻碍了肝脏的再生。近年来越来越多的研究证实肝内和浸润的单核巨噬细胞及其产生的炎症因子在造成肝细胞大量坏死、杀伤新生肝细胞方面起了极其重要的作用（1，2）。如果抑制或删除肝内的单核巨噬细胞，或中和炎症因子就能大大改善肝脏的再生能力（3，4，5）。在这些研究中人们多使用相应的单克隆抗体来删除或中和单核巨噬细胞和它们产生的炎症因子。但单克隆抗体多来自小鼠杂交瘤细胞，用于人体治疗受到限制。急性肝功能衰竭时如能提供一定数量的外源性肝细胞和某种能抑制肝内单核巨噬细胞功能的物质，起到既阻止残存肝细胞进一步坏死和杀伤新生肝细胞，又能避免外源性肝细胞遭到排斥，同时还能支撑机体代谢需要，减轻残存肝细胞的负担，使它们有足够时间再生，达到治愈肝功能衰竭的目的。众多的动物实验已证明肝细胞移植加免疫抑制剂可满足这一目的（6，7，8），但免疫抑制剂都是非特异地抑制机体的整个免疫系统，在降低免疫反应的同时也降低了机体的抵抗力，常常引起严重的继发感染，而且免疫抑制剂多有严重的毒副作用，如临床常用的环孢霉素A就有严重的肾毒性，这些在重症肝炎常是导致病人死亡的危险因素。1994年Hagiya从乳鼠肝脏中分离出一种能促进肝脏再生的物质，并克隆了它的cDNA，为它取名为肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration，ALR）（9）。我们已从人胎肝组织中克隆出人ALR cDNA，成功构建了它的真、原核重组表达质粒，并进行了高效表达（10，11）。新近的研究发现ALR能通过抑制肝内NK细胞的活性来促进肝细胞再生（12，13）。在胎胰岛细胞移植加ALR治疗糖尿病大鼠的研究中也发现，凡在移植细胞部位加注ALR的大鼠血糖都恢复到正常水平，而单独接受胎胰细胞移植治疗的大鼠无一只血糖恢复正常，说明ALR使移植的胎胰细胞避免了排斥反应，能存活并发挥功能（14）。基于这些最新研究成果，我们拟探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制，期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效，又经济可行的治疗方法；同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法；并通过本研究观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-、IL-1等炎症因子的变化关系，进一步阐明ALR的作用机理。本课题如获成功必将为重症肝炎患者带来福音，产生巨大的社会效益及经济效益。1 顾长海，王宇明。急性肝衰竭。成都；四川科学技术出版社，1997；11-21 2Nikola LV, Lorenzo P, Alessandro A, et al. Changes of liver-resident NK cells during liver regeneration in rats. J Immunology 1995; 154:6324-63383Blazka ME, Elwell MR, Holladay SD, et al. Histopathology of acetaminophen-induced liver changes: ole of interleukin 1 alpha and tumor necrosis factor alpha. Toxicol Pathol 1996; 24:181-189 4Tamura F, Masuhara A, Sakaida I, et al. FK506 promates liver regeneration by suppressing natural killer cell activity. J Gastroenterol Hepatol 1998; 13:703-7085 Boulton RA, Alison MR, Golding M, et al. Augmentation of the early phase of liver regeneration after 70% partial hepatectomy in rats following selective kuffer cell depletion. J Hepatol 1998; 29:271-2806 Takeshita K, Ishibashi H, Suzuki M, et al. Hepatocellular transplantation for metabolic support in experimental acute ischemic liver failure in rats. Cell Transplant 1993; 2:319-3247 Demetriou AA, Reisner A, Sanchez J, et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatectomized rats. Hepatology 1988; 8:1006-10098 Mito M, Susano M, Sawa M, et al. Hepatocyte transplantation for hepatic failure. Transplant Rev 1993; 7:35-439 Michio Hagiya, Antonio Francavilla, Lorenzo Polimeno, et al. Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration(ALR) gene: Expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:8142-814610. 中华肝脏病杂志。1999; 7(3)11. 中华肝脏病杂志 2000；8（1）12. Francavilla A, Vujanovic NL, Polimeno L, et al. The in vivo effect of hepatotrophic factors augmenter of liver regeneration, hepatocyte growth factor, and insulin-like growth factor-II on liver natural killer cell functions. Hepatology 1997; 25:411-41513. Tanigawa K, Sakaida I, Masuhara M, et al. Augmenter of liver regeneration (ALR) may promote liver regeneration by reducing natural killer (NK) cell activity in human liver diseases. J Gastroenterol 2000; 35:112-11914. Adams GA, Maestri M, Squiers EC, et al. Augmenter of liver regeneration enhances the success rats of fetal pancreas transplantation in rodents. Transplantation 1998; 65:32-36 3 三、研究方案1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题（1） 研究目标：通过本研究探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制，期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效，又经济可行的治疗方法。同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时通过观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-、IL-1等炎症因子的变化关系来进一步阐明ALR的作用机理。（2） 研究内容：a：D-氨基半乳糖制造大鼠急性肝功能衰竭模型；b：型胶原酶灌注消化胎鼠肝脏制备胎肝细胞；c：电转化带有HBV-S基因的重组真核表达质粒pCDNA3.1-S入胎肝细胞；d：ELISA法或免疫组化法检测含pCDNA3.1-S的胎肝细胞体外培养时表达HBsAg的情况；e：比较经不同冻存条件、不同冻存时间处理后，胎肝细胞复苏存活率；f：用ELISA法和免疫组化法检测造模组和正常鼠血及肝组织中的ALR，了解ALR的变化情况；g：用组氨酸亲和层析柱纯化大肠杆菌BL21（DE3）表达的大鼠ALR；h：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间动物存活率的差别；i：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肝脏生化指标、常规病理变化；j：免疫组化法检测不同治疗组存活动物肝组织内HbsAg的表达及分布，以判断移植细胞的存活情况；k：用ELISA法和Northern blot检测不同处理组动物血中和肝组织内TNF-、IL-1水平及它们的mRNA表达情况，探讨ALR的作用机理；l：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肾脏生化指标、常规病理变化。 （3） 拟解决的关键问题：重症肝炎的高死亡率一直困扰着临床医生，除肝移植外至今仍无有效治疗方法。我们拟通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，希望能为重症肝炎的治疗找到突破性方法。探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时可进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律以及明确它在肝脏的细胞来源。42. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析（1）研究方法、技术路线、实验方案： D-氨基半乳糖制备 胶原酶消化胎鼠肝 冻存、复苏 大鼠急性肝衰竭模型 制备胎肝细胞 纯化的大鼠ALR 电转化质粒 pCDNA3.1-S 至胎肝细胞 对照组 FLCCsA FLCALR FLC ALR 比较各项检测指标 如果FLCALR组有效， 再与冻存细胞进行治疗比较 注：图中FLC为胎肝细胞；CsA为环孢霉素A；ALR为肝再生增强因子。 （2）可行性分析：本课题的难点是消化分离胎肝细胞、胎肝细胞的冻存复苏、获取大量纯品ALR和鉴定移植的胎肝细胞存活状况。对于前两项相信通过反复摸索实验条件一定能获得满意结果。由于本课题是我们前一自然科学基金项目的延续。我们已构建了人和大鼠ALR的真、原核重组表达质粒，并成功地将其在真核和原核表达系统中进行了表达，获得了高效表达菌株，只要将表达产物用带镍离子的层析柱分离就可得到大量纯品ALR。我们研究所已构建了一系列含HBV-S基因的重组真核表达质粒，只要将这些表达质粒转入胎肝细胞再用于移植，就能区判定移植细胞的存活情况。此外我们还完成了人和大鼠ALR的多克隆和单克隆抗体的制备，为检测血和肝组织中的ALR提供了检测手段，要完成本课题研究应不成问题。3. 本项目的创新之处（1） 首次探讨胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝功能衰竭的可行性；（2） 首次观察急性肝损伤时血和肝组织内ALR的表达变化情况及它对TNF-、IL-1等炎症产生的影响；（3） 首次探讨胎肝细胞低温保存和复苏条件，以及作为移植供者细胞的可行性。54. 年度研究计划及预测进展2002年112月：完成动物肝损伤模型建立的预实验、ALR表达的肝内定位； 完成胎肝细胞的制备、胎肝细胞的转化、HbsAg表达的鉴定； 完成大鼠ALR的表达及纯化； 完成不同保存条件、不同保存时间胎肝细胞复苏存活率比较；2003年112月：完成胎肝细胞移植与ALR联合治疗大鼠急性肝衰的疗效评价； 完成新分离与冻存胎肝细胞与ALR联合治疗大鼠急性肝衰的疗效评价； 完成不同处理组动物血及肝组织内TNF-、IL-1变化的比较； 2004年1 6月：完成所有的研究工作。 612月：总结资料，发表文章及申报成果。5 预期研究成果 通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，如能成功将为临床治疗重症肝炎找到了突破性方法，这必将产生巨大的社会效益和经济效益。同时探索出胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。通过本研究还进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律，为重组人ALR今后的临床应用前景作出科学评估并提供实验依据。研究成果将以论文形式发表在中华系列或国际刊物上（预计完成论文4-7篇），并申报相应的科技成果奖。6 四、研究基础1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩本课题为我们前一“自然科学基金项目“的延续。在前一课题中我们已完成人ALR读码框的cDNA克隆及测序，与国外报道的大量鼠ALR读码框的核苷酸及氨基酸序列比较，其同源性分别为86.5%和85.6%，构建了人ALR的真、原核重组表达质粒，并成功地将其在真核和原核表达系统中进行了表达，获得了高效表达菌株和重组的人ALR。此后又完成了大鼠ALR读码框的cDNA克隆和真、原核表达质粒的构建及表达。去年我们又进一步完成了由重庆市卫生局资助的针对人和大鼠ALR的多克隆和单克隆抗体的制备。此外，我们研究所已构建了一系列含HBV-S基因的重组真核表达质粒。这些成果的取得为本课题的研究提供了可靠的物质保障。课题申请者长期从事病毒性肝炎的发病机理及治疗的研究。作为课题的主研人员之一曾参加过研究所承担的国家“六.五”、“七.五”、“八.五”有关病毒性肝炎防治的攻关课题研究，多次荣获国家科委、卫生部、四川省和重庆市的科技进步奖。9093年底作为访问学者赴英国伯明翰大学医学院附属医院肝病中心从事免疫抑制药物FK506作用机理的课题研究，回国后又承担了国家教委优秀青年教师基金和国家自然科学基金资助的“肝细胞生长多肽基因克隆及其对免疫系统影响”的课题研究。申请者具有扎实的分子生物学和免疫学理论知识，极强的科研能力和实验技能，课题组主要成员均有长期从事实验研究的工作经历，这为本课题能顺利进行提供了可行的人员和技术力量的保证。2. 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况） 我所为国家教委重点学科，我所为卫生部临床药理实验基地和重庆市分子生物学重点实验室，拥有良好的工作条件和许多精密仪器。其主要设备有：超速离心机、液相闪烁计数仪、高速冷冻离心机、台式高速冷冻离心机2台、全波长分光光度仪、-射线能谱仪、CO2培养箱3台、PCR仪2台、超净工作台、多功能电泳仪、核酸测序仪、低温冰冻离心机、超低温冰箱、电转化仪、凝胶成像系统、高压和常压层析系统、超声破碎仪、蛋白质电泳装置、荧光显微镜、细胞收集器、倒置显微镜、多功能扫描仪等。73. 申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录*和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务；青年科学基金申请者还应注明学位论文名称及导师姓名与工作单位8篇* 论文：作者题目刊名年份卷（期）页码 专著：作者书名出版者年份8 五、经费预算支 出 科 目金 额（万元）计 算 根 据 及 理 由1. 合 计200（一）科研业务费25实验动物0.8大白鼠、胎鼠各200只(15元/只)及饲料等文献检索,资料复印0.3论文发表,会议,成果鉴定0.8临工费0.6300元/月20月 (二)实验材料费158生化试剂40D-氨基半乳糖、IV胶原酶、组氨酸亲和柱等免疫学试剂25IL-1、TNF-检测Kit，ELISA和免疫组化检测试剂分子生物学试剂45DIG-标记、总RNA提取Kit，引物合成, Taq酶, dNTP,细胞培养25DEME、RPMI-1640培养基、胎牛血清、液氮、CO2等其他常用试剂15细菌培养基、Hank氏液、常用试剂等低值易耗物品08细胞培养板、酶标检测板、细菌培养瓶、培养皿等（三）协作费07病理切片制作、病理诊断等（四）项目组织实施费10占总经费的5% 注: 预算支出科目按下列顺序填写: 1. 科研业务费 2. 实验材料费 3. 仪器设备费 4. 实验室改装费 5. 协作费 6. 项目组织实施费。开支范围详见国家自然科学基金资助项目财务管理办法第二章。9 六、申请者正在承担的其它研究项目 （攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情况） 作为课题负责人正在执行教育部骨干教师基金教技司（2000）65文资助的研究。起止日期：2000.12002.12。此研究属ALR系列研究之一。七、申请者承担（负责或参加）国家自然科学基金资助项目的情况批准号项目名称起止年月负责或参加进展或完成情况1996年1月1998年12月负责已完成10 对申请者负责的前一个已结题科学基金资助项目（项目名称及批准号）完成情况，后继研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（300字）及已发表主要相关论文首页复印件（限三篇）。申请者负责的由自然科学基金资助的已于98年12月结题。现已构建大鼠ALR的原核表达系统，为进一步研究ALR的生物学功能和作用机理打下基础。ALR是近年才发现并克隆的一种新的促肝细胞生长因子，人ALR是最近两年由国内学者率先克隆成功的，所以对它的生物学功能才刚刚起步。从在体内的广泛分布来看，它的生物学功能应远不止限于促肝细胞生长，其作用部位也不应限于肝脏。目前即使是它在肝脏损伤后再生时的作用机理的研究也少有报道。我们希望通过本课题研究进一步阐明它的作用机理以及与临床肝损伤后肝再生的关系，为它今后的临床应用提供切实可靠的实验依据。结题项目研究工作总结摘要：以人胎肝总RNA为模板，用RT-PCR和基因重组技术克隆了人ALR阅读框cDNA，它全长378个核苷酸，编码125个氨基酸。与大鼠ALR和人ALR阅读框的核苷酸序列同源性分别为86.5和99.2。将克隆片段分别装入pET-11a和pcDNA3质粒中，构建了原核表达质粒pET-11a-hALR和真核表达质粒pcDNA3-hALR，并在大肠杆菌BL21（DE3）和COS-7细胞中进行了表达。在BL21（DE3）中的表达量占菌体蛋白量的20%，分子量约为15KD，用转染的COS-7细胞培养上清和细胞匀浆测活，仅细胞匀浆有刺激活性。在体外它能刺激HepG2、QGY等肝源性细胞增殖，不能使L929细胞增殖。首次观察了重组人ALR在体外对人外周血淋巴细胞在PHA刺激下产生IL-2和T13细胞（NK细胞系瘤株）在LPS刺激下产生IL-1、TNF-的影响，发现它对以上两种细胞产生的细胞因子均无影响。 八、申请者承诺 我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。 申请者（签章） 年 月 日11 九、推荐意见 （不具有高级专业技术职务的申请者，须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐。推荐时，请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、研究能力、科研态度及研究条件等。项目组成员不能做推荐者） 推荐者（签章） 专业技术职务 专长 所在单位： 推荐者（签章） 专业技术职务 专长 所在单位：12十、申请者所在单位及合作单位的审查与保证1. 申请者所在单位学术委员会的审查意见（包括：对项目的意义、特色和创新之处及申请者的研究水平与学风签署具体意见）重症肝炎的高死亡率一直困扰着临床医生，除肝移植外至今仍无有效治疗方法。申请者拟通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，希望能为重症肝炎的治疗找到突破性方法。并探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律以及明确了ALR在肝内的细胞来源，为重组人ALR今后的临床应用前景作出科学评估并提供实验依据。肝再生增强因子（ALR）是近年从新生大鼠肝脏内发现和克隆的一种新的促肝细胞生长因子。而人ALR又是最近两年才克隆成功，对它的生物学功能的研究才刚刚起步。它与临床各种肝脏疾病关系的报道尚少见。本研究通过探讨免疫性肝损伤时ALR对肝内免疫细胞的功能及炎症因子产生的影响、观察与乙型肝炎病情及预后的关系，进一步阐明ALR的作用机理，并为重组人ALR今后的临床应用前景提供很有价值的实验依据。制备的人ALR抗体除可供临床检测用外，还能广泛应用于其它有关ALR的研究中。申请者已完成了人ALR的cDNA、真核和原核表达及活性的初步研究，并已完成大鼠ALR原核表达质粒构建和表达，以及制备了相应的多克隆和单克隆抗体，这些都为本课题的完成提供了可靠的物质物质保障。本课题是上一课题的延续，选题新颖，将基础研究与临床应用很好地结合起来，为临床疑难病的治疗寻找新疗法，研究方案可行，预算合理。课题申请者思维活跃，学风严谨，具有相关学科扎实的理论基础和极强的研究能力。由他负责本课题可行、可靠，建议给予资助。主任或副主任（签章） 年 月 日13 2. 合作单位的审查意见与保证同意参加合作研究，保证对参加合作研究人员时间及工作条件的支持、督促其按计划完成所承担的任务（及需要说明的其它问题）合作单位1（公章）合作单位2（公章）合作单位3（公章） 3. 申请者所在单位领导的审查意见与保证已按填报说明对申请人进行了资格审查，对申请书内容进行了审核，同意学术委员会的审查意见，并保证在项目获得资助后做到以下几点：(1) 保证对研究计划实施所需的人力、物力和工作时间等条件给予支持。(2) 严格遵守科学基金委员会有关资助项目管理、财务等各项规定。(3) 督促项目负责人和本单位项目管理部门按科学基金委员会的规定及时报送有关报表和材料。需要说明的其它问题：单位负责人 （签章） 单位（公章） 年 月 日14登记序号： 项目编号：中医药、中西医结合科研项目课题设计书课题名称：痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究申报单位： 江苏省中医院课题负责人： 朱萱萱计划年限：邮政编码： 210029 联系电话： 8661714130306申报日期：江苏省中医药局制填写提纲一、立项依据：与选题直接相关的国内外现状、水平和发展趋势；选题的理论和实践依据；研究目的、意义；本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。二、科研假说或技术构思，主要研究内容、关键技术、目标（达到的主要技术指标或技术经济指标），技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。三、研究试验方法及技术路线（工艺路线）。四、现有工作条件和基础：开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等；已有工作基础，预试验情况。五、计划进度：根据总的研究期限、年度计划进度，分别列出具体的目标和进度的考核指标。六、参加（协作）单位意见及具体分工（附协议书）。七、经费概算（包括其他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的自主）和核算依据，以及分年度使用计划。填写说明一、内容填写自备附页，用纸大小和封页一致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。二、填写提纲所列内容，要全面详细、如实填写。三、封面上“登记序号”“项目编号”请勿填写。1、 立项依据1.1 研究目的、意义骨关节炎（osteoarthritis，OA）又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群，是多见于中年以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调查，在美国目前2亿多人口中，就有骨关节炎4500万，发病率占总人口的20%，在老年人中所占比例更高，50岁以上人群中，OA的患病率仅次于心血管疾病，位居第二位。在我国，根据流行病学调查显示，5564岁的人群中发病率达40%，而65岁以上人群的患病率达60%90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，OA的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活、健康，对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而OA引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对OA的研究颇多，在发病机制、检测手段以及治疗方法上均取得较大进步，但总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。西药治疗OA的主要手段是非甾体药，但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗OA也取得了一些经验，但对其具体的作用机制有深入研究的却很少，因此在中医理论的指导下，运用现代科学技术，对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究，使中药治疗OA的疗效在国际先进行列中占一席之地，是摆在我们面前非常重要的课题。1.2 国内外现状水平和发展趋势近十年来，国内外对OA进行了较深入地研究，大致归纳如下：1.2.1 流行病学研究已广泛开展在近100种不同类型的关节疾病中，OA是影响人类健康最常见的关节疾患之一，没有明显的种族和地域差异，本病的患病率随年龄增加而增高，故随着人类平均寿命的延长，患病率也有增高的趋势。Felson等报道70岁以下人群膝OA患病率为7%（男6.4%，女11.4%），80岁以上为11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射学膝OA70岁以上为27.4%（男30.4%，女25.1%），80岁以上为43.7%。Butter等报道，44岁以下、4559岁、60岁以上人群中，放射血OA 患病率各为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示，症状性OA患病率2.2%；无症状性OA患病率53%，其中3039、4049、5059岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计551例，结果40岁以下、4049、5059和60岁以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同关节OA易感性不同。美国在卫生统计中心调查结果，OA患病率以手最高，以下依次为足、膝、髋。国内陈顺乐等调查结果OA是颈椎最多，以下依次为腰椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大，但手、膝、髋OA均以女性较多，且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在Framingham的研究中，Felaon等发现女性体重减少11磅，骨关节炎形成的风险相应减少50%。 Saase等调查结果，膝OA患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为155亿美元，约为类风湿关节炎的3倍，其中一半以上消耗缘于工作丧失。在我国虽未作全国大范围的普查，但随着老龄化社会进程的不断加快，OA的发病率会越来越高，这必将给家庭、社会带来沉重负担。1.2.2 病因、发病机制有了巨大突破目前基础研究认为软骨的损伤与退变是OA的根本，随着分子生物学免疫学的发展，近年来众多学者对OA关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大量研究，其发病机制仍未完全明了，又提出了许多学说，如软骨下骨内高压学说：由于骨血液动力学的改变，在骨髓腔容积不变的前提下增加内容物引起压力增高，即表现为骨内压力增高。骨内高压持续增高存在下关节滑液pH值下降，成分改变，干扰并破坏了软骨细胞的正常代谢导致细胞变性坏死，胶原纤维解聚，蛋白多糖分解，软骨下骨破坏、修复，最终产生骨性关节炎。自由基学说：认为自由基对软骨细胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用软骨细胞后，引发膜脂质过氧化，使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多，丙二醛可与DNA发生交联，自由基也可直接攻击软骨细胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA链断裂、碱基损伤从而影响了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障碍。骨关节炎时，滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润，其表面受免疫复合物、补体等作用能释放大量O2-和H2O2；细胞因子学说：细胞因子对骨关节炎的发生、发展起了重要作用，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子（TNF）等在OA中水平明显增高。IL-1具有刺激软骨细胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎症和疼痛，同时IL-1也是软骨基质降解的主要驱动因子；软骨酶降解学说：OA软骨细胞的基质降解酶类的合成与分泌率明显增加，并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分子的降解酶类可以增加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质金属蛋白酶，尤其是基质溶素和胶原酶，参与关节软骨的降解过程，这些酶类可以降解细胞外基质的所有成分，与循环系统中的纤维蛋白溶酶和局部合成的纤溶酶原一起，快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的IL-1和TNF的作用下，软骨细胞以酶原的形式分泌大量的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制剂无影响，使二者失衡从而增加对软骨主要成分型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使软骨进行性破坏；一氧化氮学说：NO是一种细胞间信使分子，可介导许多生物学现象。NOS可催化重要炎性介质NO的产生，OA患者血清、滑液中NO含量明显高于正常。NO可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能，同时使软骨细胞分泌透明质酸减少，滑膜粘蛋白解聚，抑制软骨细胞合成软骨基质，促进软骨细胞糖酵解，使软骨破坏。细胞凋亡学说：细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，许多正常组织均可发现凋亡，但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病，在骨关节炎患者软骨中软骨细胞的凋亡有异常表现，且凋亡细胞数目与骨关节炎严重程度明显相关。凋亡小体存在于软骨细胞小孔或间隙内，其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙，有NTPPH（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨细胞修复过程失败，而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。OA软骨细胞凋亡主要通过两种相互独立的途径完成，一种是同滑膜炎症无关的途径,由NO介导;另一种是同滑膜炎症相关的途径,由Fas介导。典型的OA不存在明显的炎症反应,此时软骨细胞凋亡以NO途径为主;当产生炎症反应时,则通过as途径加剧软骨细胞凋亡和关节破坏。NO通过两种方式造成组织及细胞损伤。一是高浓度的NO能抑制多种与线粒体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶,从而抑制线粒体呼吸,造成组织损伤;二是NO与超氧化阴离子2-反应,生成氧化亚硝基阴离子ONOO-,在酸性条件下(如病理条件)迅速分解为OH-和NO2自由基,这两种自由基具有很强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在OA患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区。Fas表达的结果与其相符,OA受损区的Fas表达远高于未受损区,提示Fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除NO途径和Fas途径外,还有一些因素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如IL-1、IL-8、TNF-、PGE2、Aggrecan G1区等。1.2.3 治疗方面有了不少新方法目前中西医治疗OA的药物较多，西药治疗OA主要有三大类，第一类为快作用药，即非甾体药，特点是发挥作用快，但副作用较大，对胃肠、肝肾、血小板均有较大影响，OA多为老年人，长期服用此类药尤其不能耐受，且部分药物价格不菲，而且由于过分的镇痛，导致病人失去警惕过分运动，以致出现“消炎痛髋”，从长期疗效来看反而不佳，最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗OA的首选药，但尚有一定争议，且同样存在上述副作用；第二类为慢作用药，发挥作用慢，疗效不确切，价格昂贵，临床上尚未广泛运用；第三类为软骨保护剂，尚未问世。关节清理术、膝关节置换术，适应症较少，费用高，创伤大，病人难以接受。中哦药治疗OA的研究取得了可喜的进步，但中药治疗仍存在较多共性的问题：多属临床经验，无对照组，特别是西药对照组观察，处方不固定。缺乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标及疗效判断标准为手段来寻找治疗OA的中药。未针对OA发病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、病理、细胞分子水平来探讨中药的药物作用机理。缺乏高效的、作用综合、副作用小的新药。中医认为OA属痹症中的痹、痛痹、骨痹，认为其病因与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关，明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为OA的发病基础，而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统中医理论基础上，阐述了膝OA骨内高压血瘀证氧自由基之间的密切关系；谢林等论述了膝OA与血瘀证之间的内在联系，旨在为运用活血化淤药治疗OA提供理论依据。治疗方面从古到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强筋骨、补气血治其本；散寒通络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒湿痹、关节疼痛和脑血管后遗症的传统固防，具有补肝肾、活血通络之功，临床常见本方加减治疗OA，疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例，总有效率94.7%。单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例，有效率为87.5%。陆智报道用本方加减治疗104例，总有效率91.3%。1.2.4 实验研究方面有了较大的进展随着对OA发病机理的不断深入认识，对OA的实验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微循环和一般抗炎、镇痛试验，现已使用针对OA的动物实验，并采用相关的指标进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是OA的血液流变学、氧自由基及一氧化氮含量等，这些试验一般均可通过建立骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内SOD及MDA含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在NO对OA影响的实验中，一般采用硝酸还原酶法来测定NO含量，运用PT-PCR技术测定NOS基因表达。IL-1、IL-6、TNF等细胞因子、软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原/纤溶酶原激活物和前列腺素PGE2、软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况、性激素水平等也越来越多地被作为检测指标使用到实验研究中来。1.3 选题的理论和实践依据祖国医学并无骨关节炎的病名，从历代文献来看本病应归属于“骨痹”、“痛痹”范畴。我们认为OA病人除了肝肾亏虚，寒湿痹阻外，一般OA病人体重超重较多，也即为痰湿偏盛之体，另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰，痰淤交阻是引起膝关节肿胀畸形、活动受限的重要因素，所谓顽症怪病皆质之于痰淤。基于现代医学对OA发病机理的深入研究，我们在补益肝肾、活血通络基础上，结合中药对缓解软骨降解，增加软骨细胞功能，抑制滑膜增生及炎症的研究成果，于1995年即对备急千金要方中的独活寄生汤进行化裁，重用活血化淤，加用化痰清热之品，总结制定出了高效、药源广泛、安全可行的痛痹颗粒，并于1999年采用痛痹颗粒的组方治疗膝OA，方中以独活为君药，以祛下焦与筋骨间风寒湿邪；威灵仙舒筋通络止痹痛；淫羊藿、怀牛膝补肝肾，强筋骨，通经络，其中怀牛膝为引经药；当归养血柔肝、舒筋活血；川芎则通达四肢关节，为血中气药；虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾、祛风湿、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保护软骨。通过36例的临床研究、观察，结果表明本方疗效显著且副作用小。因此有必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用机制尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进一步的研究，冀能证实痛痹颗粒的临床疗效，明确其作用机制，并初步探讨本病发病的可能机理，为新药问世提供客观的依据，所以进行设计并立题。1.4本研究达到的科学技术水平，预期社会效益和应用推广前景1.4.1继承和发扬祖国医学，保持中医特色，以临床疗效为前提，以实验研究为基础，制造规范化大鼠的膝OA模型，从发病机理探讨本药的作用机制。本实验采用可靠地国际公认的方法复制动物模型，并采用最新的检测指标IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，总之本研究基于现代医学对OA发病机制的最新研究成果，从生化、免疫等多个角度多个层次，系统观察并进行归纳总结，确保本课题不但可行而且先进，冀能填补省内外运用中药治疗OA的空白，并希望以此为基础，进一步从细胞水平（包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的影响）研究中药对OA的长久作用及影响，从而达到挤身国际先进水平的目的，让中药真正走向世界。1.4.2目前，中药治疗OA的方法颇多，但大多以临床疗效研究为主，大样本、规范化的研究很少，中医中药治疗机理的研究，虽有涉及，但大多分散且存在一定的重复性，理想的治疗药物尚未问世，具有公认疗效的小儿迁延性腹泻临床治疗方案尚未确立，其疗效评价体系尚需研究确定，尤其是缺少中医药治疗学整体研究思路与方法，使中药复方治疗OA的疗效机理尚未能全面揭示，影响了该领域研究的深入。而痛痹颗粒是在中医理论指导下选用千金要方中独活寄生汤进行加减所得，并采用可靠的实验模型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对OA的确切疗效及作用机理，这必将对OA的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好的社会经济效益。随着改革开放的形势发展，以及中国加入WTO与国际接轨的进程的不断完善，祖国医学国际地位不断的提高，我们将从祖国医学宝库中发掘出的治疗OA的高效药物与现代新技术、新方法进行研究总结，从而为人类造福，为振兴中医事业做出应有的贡献。2.科研假说或技术构想：主要内容、技术关键目的，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。2.1主要内容2.1.1探讨OA的病因病机，提出新见解，发展中医理论。2.1.2运用现代科学技术，开展实验研究，从分子生物学、免疫学、生理生化学等多方面来探讨“痛痹颗粒”治疗膝OA的疗效机制及药理毒理作用。2.2主要技