《聚合酶链反应》word版.doc

PCR引物的优化设计聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR)通过多循环的变性、退火和延伸过程，能够在时间内获得大量目的DNA片段，称为一种无细胞分子克隆技术，已经成为短生命科学实验室获取目的DNA片段的常规方法。聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR)是用于在体外酶促扩增特定DNA片段的快速方法。像分子克隆技术一样，PCR方法使得许多以前不可能的实验得以完成，PCR的应用似乎是无止境的，并正在不断地扩展，其中包括从基因组DNA和cDNA直接克隆目的基因，体外诱变和DNA工程，对法医样品进行的遗传指纹鉴定，传染病原的分析，遗传疾病的产前诊断，基因的等位序列变异分析，RNA转录物结构的分析，基因组足迹分析以及对基因组DNA和cDNA进行直接核苷酸序列测定。同时相关的技术也突飞猛进地发展。 PCR方法的广泛应用及其相关的技术的顺利进行均离不开PCR引物的合理设计。可以说，PCR引物的合理设计是任何PCR反应能否进行及其产物的特异性、产率高低的关键。目前许多计算机软件可用于引物的设计，但由于各种计算机软件自身存在的局限性，其设计的引物并无法满足实验者不同需要。目前最常用的是计算机辅助设计，即实验者根据PCR引物设计的原则并结合自己的经验人工设计引物，然后选择合适的软件分析引物的合理性。引物设计原则：21 原则 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核昔酸片段，其中在扩增的DNA片断5端的引物对应于有意链DNA序列，3端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。若这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。1. 根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区） ncbi网站查询2. 选择所需的载体,确定合适的酶切位点。 所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点（generunr分析）。4. 正向引物的设计4.1酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的5，3端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。A：扩增的DNA用于表达时： (1) 自身有启动子。如果要利用自身的启动子，扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启动子前面。可在所扩增的DNA序列的启动子前寻找是否有该酶切位点，若有则直接利用该酶切位点进行扩增；若无可寻找与其基本相似的位点进行扩增。 (2) 扩增片段里自身无启动子。对于自身无启动子而又用于表达的基因序列，必须将其接于外源启动子的后面才能顺利表达。在翻译过程中，mRNA必须首先与核糖体相结合才能进行蛋白质合成。在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点，一个是起始密码子 AUG，另外一个是起始密码子AUG上游3bp-11bp处的3bp-9bp的序列，后者由Shine J及Dalgarno L发现，故称为SD序列。SD序列富含嘌呤核苷酸，而16S rRNA3端富含嘧啶核苷酸，二者刚好互补，可促进mRNA核糖体结合，提高翻译效率。因此，在基因重组过程中应将结构基因接于SD序列之后，以便为mRNA提供核糖体结合位点，提高基因表达效率。起始密码子与SD序列之间核苷酸数量变化过大会影响翻译效率，所以应该将目的基因的起始密码子与启动子的ATG相重叠，这样才能保证起始密码子与SD序列之间核苷酸数量不改变，不影响翻译效率。一般的启动子3断酶切位点是NcoI（CCATGG）或Nde I(CATATG)，若添加的酶切位点为NdeI，引物的5端酶切位点设计为Nde I即可；若添加的酶切位点为NcoI时,应该根据目的基因起始密码子后的碱基种类的不同选择不同的酶切位点：如果该碱基是G，则可以直接设计为NcoI位点；如果该碱基不是G（如扩增的目的基因为5-aagtcgtatg actaccgttc ccgatctcga-3）因为NcoI位点ATG后的G与DNA起始密码子后的a不配对，所以在设计引物的酶切位点时不能象上例简单地设计为NcoI。在处理这个问题上有三种方法：一种是直接设计为NcoI位点,其缺点是改变了阅读框的第一个氨基酸，可能对表达会有影响；为了保证原始的阅读框，可采取以下两种方法：第二种方法是利用同尾酶连接法，即在保证起始密码子及其后的碱基不改变的情况下选择合适的酶切位点。如上例将引物的酶切位点设计为tcatga（BspHI的酶切位点）,这样既保证了阅读框的atga碱基，又因为BspHI与NcoI是同尾酶，所以可利用载体上的 NcoI位点与PCR扩增产物的BspHI位点进行连接；第三种方法是将酶切位点设计为末端三个碱基是目的基因起始密码子后的三个碱基的平末断限制性内切酶，然后将启动子的NcoI位点利用T4DNA Polymerase 补平，最后将二者连接，如上例可设计引物的酶切位点为agtact(ScaI位点)。B：若扩增的DNA用于阻断.因为只需要扩增出一定长度的与染色体DNA同源的序列，所以对酶切位点的位置无特殊要求。只需要寻找与所需扩增的DNA配对较好的区域作为酶切位点即可。4.2克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切克隆到用相同酶切的载体上。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制性酶对其识别位点进行有效切断。加的个数见Biolabs242所示，加的种类要和扩增的DNA序列相匹配。如NdeI,Biolabs显示在其酶切位点上加4个核苷酸时，酶切2小时，酶切效率达到50%，而加1个核苷酸时，酶切20小时酶切效率仍然为0%，所以应在酶切位点前加4个核苷酸；4.3 在所添加的酶切位点后加17-30个与扩增的DNA配对的核苷酸序列。4.4不同细胞对密码子的使用频率各不相同，密码子的使用频率与细胞内相应tRNA的丰富是一致的，密码子使用频率高意味着需要较多的相应tRNA，二者之间的相互协调有利于细胞内一些含量高的蛋白质的顺畅表达。同理，当人们期望人工合成的基因能在细胞内高效表达，也要选择该细胞偏好的密码子作为基因的密码子，这样可以充分利用细胞内丰富度高的tRNA，使基因得到高效表达。例如，大肠杆菌基因密码子的使用情况：比较了大肠杆菌中13种含量较多的蛋白质的密码子使用情况发现这些高度表达的基因中密码子的使用有以下规律：对于以C或U结尾的同义密码子，如前两个碱基为A、U，则第三个碱基优先使用C；前两个碱基为C、G，则第三个碱基优先使用U。这样的选择有利于在翻译时密码子与反密码子相互作用。所以对于需要异源表达的基因（如链霉菌基因要在大肠杆菌中表达），对引物起始密码子以后的几个密码子要根据密码子的简并性进行改变。5. 反向引物的设计(1) 扩增的DNA用于表达时，要考虑终止密码子的位置，所扩增的片段里必须包括终止密码子 ，所以酶切位点应该设计在终止密码子后。酶切位点的选择原理与5端一样。(2) 当扩增的DNA用于阻断时，与表达时相同，只是对酶切位点的位置选择没有太严格的要求。 二引物的设计后检查 设计好的一对引物并非就是合理的，应该对其进行进一步分析。由于在实际工作中，欲扩增模板的条件不同以及实验的最终目的的不同，对引物的要求可能不一样。有时已知条件很难满足设计“合理”引物的要求。但在引物设计中应尽量考虑到下列因素。1长度 寡核昔酸引物长度一般为1530bp，常用的是18-27 bp引物的有效长度：In2(G十C)十(A十T)，引物过短会影响到扩增的特异性，引物过长至有效长度In值38时，反应系统的最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶最适反应温度（74），（2 林万明著. PCR 技术操作与应用指南. 北京:人民军医出版社,1993.）也无法保证产物的特异性。如果扩增产物500bp，引物长度为1618bp即可。若扩增产物为45kb，引物最好不要少于24bp。引物3末端应含有所研究基因特异序列中的1730bp。 2碱基分布的均衡性。引物中各种碱基最好分布均匀，G十C/A+T应为50左右，G十C含量一般为4060。引物中应避免嘌呤或嘧啶的堆积现象，避免连续出现4个以上的同一碱基，尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G十C富集序列区发生错误引发。（2 林万明著. PCR 技术操作与应用指南. 北京:人民军医出版社,1993.）3引物的Tm值。 当温度升高到一定值后，双链 DNA分子会解链为单链，这种温度称为解链温度（melting temperature,Tm）。Tm值是指溶液中有半数的DNA分子解链为单链时的温度。引物容易复性到模板上的温度（退火温度）是Tm值减去5-10，所以Tm值直接关系到PCR循环系统退火温度的选择。如果退火温度过低，少数碱基形成的局部双链不易解链，难以继续碰撞找到正确的配对模板，故复性的特异性降低。如果退火温度过高，则利于变性而不利于复性。太高的退火温度使得引物复性到模板上，故不能有效地启动DNA的合成。若按公式Tm4(G十C)十2(A十T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。两条引物的Tm值尽可能相同，相差最好不要超过3。4. 引物二聚体。由于一般的DNA聚合酶在低温下仍具有活性，因此常规PCR中反应混合物内引物与模板及引物自身可以部分发生非特异性复性，导致非特异性扩增及引物二聚体多聚体的形成。二聚体可在两个不同的引物分子之间形成，也可在两个相同的引物分子之间形成，因此，在引物设计时，应尽可能地减少两引物分子之间或一引物分子内部有过多的互补碱基，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成，否则就会形成二聚体。二聚体分子中的两条链互为模板，互为引物，引起引物扩增，导致模板扩增失败。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。另外在实际操作中，PCR反应的热启动(hot-start)也能有效防止引物二聚体的产生。使用热启动PCR，即在高温(70)下加入某种必需因子(通常为DNA聚合酶)。一方面通过扩增前的加热，使双链模板充分解链；另一方面，通过高温热启动反应，促进引物的特异性复性与延伸，增加有效引物的长度，提高反应的有效性与灵敏性，并减少引物二聚体多聚体的形成。在扩增样品数较少的情况下，一般采用先使模块升温后，再加酶的方法。如果扩增样品数较多，则应选用热启始的酶。5 引物二级结构。 引物二级结构是指引物自身存在过多的互补序列，导致引物自身折叠成发夹状结构而形成引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。如果很难完全避免引物分子内二级结构，也要尽可能避免在引物3一端出现二级结构，3一端有二级结构的引物是不能有效引发延伸的。由于分子内的互补碱基比分子间的互补碱基更容易形成二级结构（因为分子距离更近），因此二级结构比二聚体分子对PCR有更大的影响。6引物的3端。引物的延伸是从3端开始的，3端不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR(ASPCR)反应中，引物3端不能发生错配。引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配 位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应 当避免在引物的3端使用碱基A34（ 3 朱平主编. PCR 基因扩增实验操作手册. 北京: 中国科学技术出版社, 1992 4 郑仲承. 寡核苷酸的优化设计，生命的化学, 2001,21(3):254-256. ）7. 引物的特异性。 一个好的引物在模板上的结合位点应该是唯一的，在非扩增部位不应再有结合位点的出现，只有这样才能保证扩增产物的特异性。一般情况下，引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70或有连续8个互补碱基同源。8密码子的简并。如扩增编码区域，引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以对引物的5端修饰，这对扩增的特异性影响不大。但3端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3端开始的。特别应注意的是3端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。9引物的内部稳定性。引物的5端互补序列（不包括5端人为引入的非模板序列）应该是相对稳定的结构，而3端应在碱基配对的基础上尽可能为低稳定性结构。换句话说，3端应该选用A 、T少选用G、C，这种引物有更高的引发效率，且能有效地避免假引发。这是因为，3端为低稳定性结构时，仅仅3一端的几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。只有在引物中部碱基和5一端碱基也都能与模板序列互补结合时，才能有效的引发延伸。如果3一端为富含G、C的结构，只需3一端的数个碱基与模板结合，就可能引发延伸，从而造成假引发。G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定 性。应当选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引 物。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应6。（6 Oligo 软件帮助文件(Oligo.HLP).）PCR反应量的选择:1. 如果要扩增的模板是总DNA，则在PCR反应前应预先变性总DNA（即100水浴中煮沸510min），这样才能保证模板的完全解链。2. 酶的选择应该根据不同的需要及目的基因的特点选择相应的Taq酶。例如对于扩增高GC的片段，应使用LA Taq 酶，缓冲液也应该用GC Buffer.3. 酶量的选择酶量过多时易发生非特异性反应；而酶量过少时，反应性能下降。一般50ul的体系可使用2.5U的酶（即5U/ul,加0.5ul）4. 模板DNA的的选择与用量PCR中的模板可以是来源于任何生物(包括动物、植物、细胞及病毒等)的单链DNA及双链DNA。RNA分子（如总RNA、mRNA、tRNA、rRNA病毒RNA等）亦可作为扩增模板，但在作PCR扩增之前，需要用逆转录酶将RNA转化为cDNA）PCR对模板纯度要求并不高。大量资料表明，样品中存在一定量的蛋白质或有机物对实验结果影响不大。甚至可以将细胞裂解物直接用于扩增。有DNA部分降解的样品，也有可能作为样品使用。，但前提是样品中至少得有一个完整的靶序列分子。有时样品中可能含有某种可抑制DNA多聚酶活性的杂质，可通过高度稀释来淡化杂质对酶活性的抑制。只有在稀释仍不能淡化杂质对酶活性的抑制时才考虑对样品进行纯化处理。PCR中，对于起始模板的用量，一般是总DNA为0.11 ug；片段DNA为0.110ng。5. 引物用量终浓度为0.11.0uM。引物浓度太低时，有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA(如总DNA)作模板时，引物浓度应该低一些；当模板DNA的量较少或Low complexity DNA（如plasmid等）作模板时，引物浓度应高一些。6. dNTPS浓度各种dNTP浓度不可低于15uM,一般为50200uM,过高则易产生错误掺入，过低则产物量降低，且四种底物浓度应完全相同，否则易产生错掺作用，降低反应速率，提前终止延伸。7. 循环参数变性温度及保温时间以确保解链完全及不影响酶活性为度。退火过程应选择引物与模板易产生特异性结合的条件，温度适当提高，时间