生物化学结课论文淀粉中提取总糖及还原糖的研究.doc

生物化学结课论文学 院：物理化学学院 姓 名：刘双双 学 号：311113030202 专业班级：应用化学11-02 授课老师：斯琴格日乐 成 绩： 0目录摘 要.3关键词.3前 言.4 第一章 概论.4第二章 总糖及还原糖提取分离及纯化方法的研究.4 2.1 总糖及还原糖的提取.4 2.2 总糖及还原糖的分离.5 2,3 总糖及还原糖的纯化.5第三章 实验部分.6 3.1 实验仪器及药品.6 3.2 实验步骤.7 3.3 实验数据处理.8第四章 结论与展望.9致 谢.9参考文献.101淀粉中提取总糖及还原糖的研究【摘 要】：本文利用3,5二硝基水杨酸法测定淀粉中的总糖和还原糖的含量。旨在掌握还原糖和总糖的测定原理，及用比色法测定还原糖的方法。其原理是：在NaOH和丙三醇存在下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中还原糖的含量。利用多糖能被酸水解为单糖的性质，可以通过测定水解后单糖的含量来对总糖进行测定。实验证明：该方法简单、易于操作，并且准确度高，是淀粉中总糖及还原糖测定的优选方法。【关键词】：淀粉；总糖；还原糖；葡萄糖；3,5二硝基水杨酸Study on extraction of total sugar and reducing sugar in the starch【 Abstract 】 : in this paper, using the method of 3, 5-2 nitro salicylic acid determination of total sugar and reducing sugar in starch content. To master the principle of the determination of reducing sugar and total sugar, and the method of reducing sugar was determined by colorimetric method. Its principle is: in the presence of NaOH and glycerol, 3, 5-2 nitro salicylic acid (DNS) after thermal reduction with reducing sugars to generate amino compounds. NaOH in excess of the compounds in alkaline solution are orange, had the biggest absorption, in the 540nm wavelength in a certain concentration range, the amount of reducing sugar has a linear relation with light absorption value, using the colorimetric method to determine the content of reducing sugar in the sample. By using the properties of polysaccharide acid can be hydrolyzed to simple sugars, can be used to determine the content of monosaccharide hydrolysis to the determination of total sugar. This method is simple, easy to operate, and high accuracy, suitable for the determination of total sugar and reducing sugar.【 key words 】 : starch; Total sugar; Reducing sugar. Glucose; 3, 5-2 nitro salicylic acid前 言 在农业和食品工业中往往需要准确、快速的测定淀粉中还原糖及总糖的含量。大量实验表明,3 .5一二硝基水杨酸试剂在碱性介质中与还原糖共沸,被还原成桔红色的3一氨基一5一硝基水杨酸,在540nm处用72型分光光度计进行比色测定故淀粉可在不同的水解条件,将其水解转化为葡萄糖，通过测定葡萄糖的含量即可得到淀粉中总糖及还原糖的含量。此方法简单方便，所用试剂少，准确度高，很多领域中都采用此方法测定淀粉、马铃薯等中的糖。第一章 概述总糖主要指具有还原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖，麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。还原糖类之所以具有还原性是由于分子中含有游离的醛基（-CHO）或酮基(=C=O)。 测定总糖的经典化学方法都是以其能被各种试剂氧化为基础的。还原糖：羰基碳没有参与形成糖苷键能够还原斐林试剂或托伦斯试剂(银氨溶液)的糖称为还原糖，所有的单糖，不论醛糖、酮糖都是还原糖。大部分双糖也是还原糖，蔗糖例外。分子结构中含有还原性基团（如游离醛基半缩醛羟基或游离羰基）的糖，叫还原糖。如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为桔红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与桔红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算总糖含量时应乘以0.9。第2章 总糖及还原糖提取分离及纯化方法的研究2.1 总糖及还原糖的提取水提醇沉法：水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法.多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂.用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5h，多糖的质量分数和得率均较高.单一酶解法：单一酶解法指的是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术.其中经常使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等.蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出.2.2 总糖及还原糖的分离主要有分级沉淀、季铵盐沉淀法、金属盐沉淀法、色谱分离、膜分离、透析、电渗析等，目前大多采用DEAE凝胶或其他各种不同类型的凝胶柱层析以及离子交换色谱法。分级沉淀法：大多数活性多糖可溶于水，3个碳以下的多糖还可溶于乙醇，随着聚合度的增大，多糖在乙醇中的溶解度逐渐降低.根据这一性质可在多糖的浓缩水溶液中分批加入乙醇，使乙醇的体积浓度逐渐增加到50，100，200，900mL/L，从而使不同聚合度的多糖分别沉淀析出。色谱分离法：常用两种色谱分离方法：一是凝胶柱色谱法，二是离子交换色谱法。膜分离法：膜分离技术是一种高效分离技术，分离过程以选择透过性膜作为分离介质，通过在膜两侧施加某种推动力（压力差、化学位差、电位差等），使原料液中组分有选择性的通过膜.目前应用较多的是超滤和微滤技术。2.3 总糖及还原糖的纯化Sevage法：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用V（氯仿）V（戊醇或正丁醇）为51或41，混合物剧烈振摇2030min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种只能除去少量蛋白质，效率不高，须反复多次，多糖有损失。但此方法比较温和，在避免多糖降解上效果较好。三氟三氯乙烷法：将多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温搅拌10min左右，离心分离得上层水层，水层继续用上述方法反复处理几次，得无蛋白质的多糖溶液，此法效率较Seavg法高，但溶剂沸点低，易挥发，不宜大量应用.三氯乙酸法：三氯乙酸是一种有机酸，使多糖提取液中的蛋白质与有机酸作用而变性沉淀。该法是在多糖水提液中滴加5%10%与多糖水提取液等体积的三氯乙酸，混匀静置过夜，离心除去胶状沉淀，重复以上的操作直至溶液不再继续混浊为止，得无蛋白质的多糖.三氯乙酸浓度越大，除蛋白质效果越好，但对多糖的影响也越大，可能是三氯乙酸对多糖结构具有破坏作用，使多糖降解，而且这种破坏作用随着三氯乙酸浓度增大而增强。第三章 实验部分3.1 实验仪器及药品实验仪器试管；移液管；水浴锅；电炉；721型分光光度计。实验试剂1. 3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至 1000mL。2. 葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100mL，即含葡萄糖为2.0mg/mL。3. 6mol/L HCl：取250mL浓HCl（35%38%）用蒸馏水稀释到500mL。4. 6mol/L NaOH：称取120g NaOH溶于500mL蒸馏水中。5. 碘碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中6. 0.1% 酚酞指示剂。实验材料小麦淀粉。3.2 实验步骤1. 葡萄糖标准曲线制作取6支15 mm180mm试管，按下表加入2.0mg/mL葡萄糖标准液和蒸馏水。管号葡萄糖标准液/mL蒸馏水/mL葡萄糖含量/mgOD/5400010010.20.80.40.11920.40.60.80.24930.60.41.20.30140.80.21.60.53551020.629在上述试管中分别加入DNS试剂2.0mL，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0mL，摇匀，在 540nm波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2. 样品中还原糖的提取准确称取0.5g小麦淀粉，放在100mL烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入约40mL蒸馏水，混匀，于50恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。3. 样品总糖的水解及提取准确称取0.5g小麦淀粉，放在大试管中，加入6M HCl 10mL，蒸馏水15mL，在沸水浴中加热0.5h，取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6M NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100mL，过滤取滤液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。4. 样品中含糖量的测定取7支15mm150mm试管，分别按下表加入试剂：项目空白 还原糖总糖H2O/mL0123456样品溶液/mL11111113,5-二硝基水杨酸试剂（mL）2222222A54000.0080.0110.0120.1270.1150.163加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0mL，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖含量。5. 结果处理按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：式中：C还原糖或总糖提取液的浓度，mg/mL；V还原糖或总糖提取液的总体积，mL；m样品重量，g；1000mg换算成g的系数。3.3 实验数据处理1. 葡萄糖标准曲线2. 样品中还原糖的百分含量还原糖的A的平均值为：把A带入到回归曲线y=0.3175x-0.0120中，可得还原糖中葡萄糖的含量为：0.069mg3.样品中总糖的百分含量总糖A的平均值为：把A带入到回归曲线y=0.3175x-0.0120中，可得总糖中葡萄糖的含量为：0.463mg第四章 结论与展望结论：本实验通过3,5二硝基水杨酸（DNS）法对淀粉中还原糖及总糖的含量进行测定，方法是利用还原糖的羰基在弱碱性条件下,将3,5-二硝基水杨酸还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸,还原产物的吸光度值与还原糖的含量在一定范围内成正比。该方法可用于烟草中水溶性总糖、还原糖和淀粉中总糖及还原糖的测定,与其它法相比,该方法具有快速省时,操作简单方便,试剂消耗少等优点,准确度也能达到分析要求,尤其适用于样品批量测定。展望：我国对多糖的研究起步较晚，但近年来的工作取得了较大的进展，愈来愈多的多糖被发现。并证实它们具有复杂、广泛的生物活性和功能.随着对多糖生物活性的深入研究，多糖的生物活性机理，功效因子会更加明确，它的应用领域也将会更加拓宽。然而，由于多糖本身结构比较复杂，种类繁多，其结构测定和分离纯化有很大的难度；有些多糖在天然植物中的含量低且不易分离及多糖的药理作用与诸多因素有关，给多糖的研究和应用带来许多的挑战，这需要相关行业的人士共同应对.。 致 谢本论文是在河南理工大学物理化学学院斯琴格日乐老师的悉心指导下完成的。斯琴老师作为一名优秀的、经验丰富的教师，具有丰富的专业知识和指导经验，在整个论文实验过程中，对我进行了耐心的指导和帮助，提出严格要求，引导我不断开阔思路，为我答疑解惑，鼓励我大胆创新，使我在这一段宝贵的时光中，既增长了知识、开阔了视野、锻炼了心态，又培养了良好的实验习惯和科研精神。在此，我向我的指导老师表示最诚挚的谢意！ 在论文即将完成之际，我的心情久久无法平静，从开始做实验到顺利论文完成，不知有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无数的帮助。感谢河南理工大学物理化学学院提供的实验器材和实验药品，感谢全体老师给予我丰富的专业知识和各个方面的关心和帮助，感谢合作组员的热心协助。同时也要感谢应用化学11-02班的全体同学，正是由于你们的帮助和支持，我才能一个一个克服困难、解明疑惑，直至本文顺利完成，在这里请接受我诚挚的谢意！最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们！ 参考文献【1】 梁存权;比色法测定植物多糖含量方法概述J;