高效液相色谱法（HPLC）在天然产物分离中的研究进展__课程论.docx

高效液相色谱法（HPLC）在天然产物分离中的研究进展分析化学 陈研君 20150260 摘 要主要简述高效液相色谱法的分离原理及研究进展。简单综述高效液相色谱法在天然产物中的分析及分离，包括酚酸类、黄酮类、皂苷类等化合物，药物的分离纯化多采用以C18为填料的反相色谱柱。中药及天然产物的纯化采用的溶液大多数是甲醇水溶液或乙腈水溶液。最后对高效液相色谱技术及其方法做简要的总结和展望。关键词高效液相色谱法；天然产物；综述Abstract: The separation principle and research progress of high performance liquid chromatography were briefly introduced. In this paper, the analysis and separation of natural products, including phenolic acids, flavonoids, saponins and other compounds, purification using the C18 reversed-phase column packing drug separation. Most of the traditional Chinese medicine and natural products purified by solution is aqueous methanol or acetonitrile water solution. Do a brief summary and prospect at the end of the high performance liquid chromatography and its method.Key words: high performance liquid chromatography; Natural products; Review1 高效液相色谱法1.1高效液相色谱法原理及应用高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代中后期在经典液相柱色谱基础上，引入气相色谱的塔板理论，发展而来的一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析方法。它在技术上采用了高压输液泵、高效微粒固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、高灵敏度、分离效能高。操作自动化等分析特点。其基本原理是基于混合物中各组分在性质和结构上的差异，当溶于流动相中的各组分流经固定相并与固定相发生相互作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等），由于各组分与固定相的作用力大小不同而导致其在固定相中的滞留时间不同，从而按一定次序先后从固定相中流出。将HPLC 适当的柱后检测方法结合，可实现混合物中各组分的分离检测。高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和记录系统等五大部分组成。高效液相色谱根据作用可以分为制备型和分析型，它们的构造跟分离原理相似，但在具体操作中两者的指导思想却有着本质的不同。在制备分离中，我们总是希望尽可能短的时间内得到尽可能多的纯组分。这就以分离效果为代价，在保持最低分辨率的前提下，使柱子超载以得到最大的物料通过量。而分析分离中在最短时间里得到的分离效率则是我们希望得到的。制备分离选择的是高柱效、高柱容量的色谱柱，而且色谱柱在超载状态下工作。即将塔板数下降10%时柱容量。在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级，甚至更低。，重在定性分析。随着不断的改进与发展，高效液相色谱已成为极为重要的化学分离分析手段。目前，高效液相色谱法已被广泛地应用与食品分析、环境检测、中草药成分检测、生物化学分析、石化分析等领域。1.2 高效液相色谱法研究进展近年来，高效液相色谱作为物质分离检测的重要工具，在各个方面都取得了很大的发展。高效液相色谱仪，以其高效、快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器，出现了多种可与HPLC结合的检测器，如紫外-可见光检测器（UV-VIS）、二极管列阵检测器（DVD）、示差折光检测器（RID）、荧光检测器（FID）、电化学检测器（ECD）、蒸发光散射检测器（ELSD）等1。同时高效液相色谱技术也取得了较大的发展，出现了多维高效液相色谱（MD-HPLC）2、微柱高效液相色谱（MHPLC）、超高效液相色谱（UHPLC）3-7、变性高效液相色谱（DHPLC）8-12等新型高效液相色谱技术，使液相色谱在更高的水平上实现了突破。此外，为了使物质的检测更加准确方便，出现了多种色谱联用技术，如高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）13-16、高效液相色谱-红外光谱联用技术（HPLC-IR）、高效液相色谱-原子吸收光谱联用技术（HPLC-AAS）17、高效液相色谱-原子荧光光谱联用技术（HPLC-NMR）18-20、高效液相色谱-紫外光谱联用技术（HPLC-UV）21-23等。2高效液相色谱法在天然产物中的研究进展2.1酚酸类化合物的分离及测定酚类化合物是一类具有较强的还原性有机化合物，广泛存在植物食品中。酚类化合物对人体有多种生理功能且不良反应少，具有较大的开发应用前景。高效液相色谱在酚类化合物中的应用得到飞速发展，HPLC已经广发用来测量组分、纯化分离酚类化合物。白藜芦醇是一类天然的酚类化合物，Wang24等以95%的甲醇溶液对虎杖中白藜芦醇进行超声提取，以乙酸-乙腈溶液为流动相，采用梯度洗脱的HPLC法分离检测了白藜芦醇的含量。结果表明，简单快速，不需要大孔树脂填充柱，有机溶剂少，最后得到的产物增加了4倍，高达74%。谢越25等建立高效液相色谱同时测定滁菊样品中9种酚酸类化合物（水杨酸。苯乙酸、对羟基苯甲酸、香草醛、对香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、丁香酸和肉桂酸）的方法。采用Symmetry C18色谱柱（250nm4.6mm，5m）分离，流动相为乙腈和0.02mon/L磷酸盐缓冲溶液，以冰醋酸调至pH2.8，进样量20m，采用梯度洗脱，流速为1.0 mLmin-1，柱温25，检测波长280nm。9种酚酸在35min内得到较好分离。9种酚酸的检出限介于0.010.08mg/L，平均回收率在97.8%102.5%之间，相对标准偏差为0.2%3.6%。这个方法可以用于滁菊样品中酚酸类化合物的快速分析。2.2黄酮类化合物的分离及测定黄酮类化合物是天然产物中非常重要的化合物，大多数具有显著的生理药性活性。高效液相色谱更多用于黄酮类物质的定量分析测定、定性检测或少量样品的分离制备。徐小琼26等采用HPLC法测定了陕产金柴胡药材中的黄酮类化合物含量，通过梯度洗脱，以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相，实现了在25min内高效色谱法同时测定了金柴胡提取物中三种黄酮类化合物的含量，该方法相对较简单，精密度和可靠性均良好。张元梅27等建立了一种高效相色谱法同时测定柑橘果实中18种类黄酮（圣草次苷、二氢槲皮素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷。新橙皮苷、野漆苷、槲皮苷、圣草素、香峰草苷、枸橘苷、柚皮素、木犀草素、山奈酚、香叶木素、橙黄酮、川陈皮素、橘皮素）的含量。利用色谱柱为ZORABX SB-C18（4.6250mm，5m），流动相为甲醇-甲酸-水，梯度洗脱，流速为0.7mLmin-1，柱温25，检测波长黄烷酮为283nm、黄酮和多甲氧基黄酮为330nm、黄酮醇为367nm。实验结果18中类黄酮在42min内完全分离，线性范围为62.4-960mgL-1（r=0.9996-1.0000）,定量限为0.05-0.133gmL-1，回收率为88.70%-104.76%，相对0.33%-3.05%（n=6）。这种方法简便、快速、准确、可靠，适合柑橘果实中18种类黄酮的含量测定。2.3皂苷类化合物的分析及测定目前已知的人参皂苷类成分有30多种。到现在为止，许多研究人参皂苷的研究人员基于不同物质建立了许多方法。现在比较常用的方法是高效液相色谱法。逄世峰28等采用高效液相色谱法，利用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.150mm，1.7m），流动相乙腈-水梯度洗脱测定了人参苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rb3、Rd的含量。结果发现人参地上和地下部位皂苷组成不同，人参叶中皂苷含量较高，人参根中人参皂苷主要集中于参皮。为人们对人参的合理利用提供依据。该方法使用的条件相对来说较复杂，而且分析时间也比较长。马百平29课题组对蒺藜全草中皂苷成分进行研究，HPLC色谱条件为MegresC18（250mm4.6mm,5m）柱，流动相为不同配比的乙腈水溶液，得到两种甾体皂苷，uttroside B和polianthoside D，均为首次从蒺藜中分离出的化合物。2.4三萜类化合物的分析及测定三萜类化合物具有广泛的生理活性，具有溶血、抗癌、抗炎、抗病毒等作用。如乌苏酸为夏枯草等植物的抗癌活性成分。已有大量文献报道齐墩果酸和熊果酸有明显的护肝作用。齐墩果酸是三萜类化合物的一种。汤丽琴，刘圣等30采用HPLC的方法建立同时测定枇杷叶中齐墩果酸与熊果酸含量的方法。选用C18柱(250mm4.6mm，5m)；流动相为甲醇水。结果发现齐墩果酸进样量为0.452.70g范围内，熊果酸进样量在这范围内的线性关系良好。回收率分别为9。3%（RSD为3.15%）和97.7%（RSD为2.97%）。方法快速并准确。熊爽等31人利用RP-HPLC法准确测定月腺大戟根中2种主要三萜类成分的含量，用AgientHC-C8柱（150mm416mm，5m），流动相为乙腈-水（85:15），流速110mL/min-1，检测波长为205nm，柱温为25。可以准确、灵敏地测定月腺大戟根中化合物和的含量，重复性好。陈晓辉32等利用高效液相色谱法从日本产杉树中分离制备倍半萜类化合物。在YWC-Pack C18柱上，以异丙醇-甲醇-正己烷-水（体积比为50:35:10:5）为流动相，流速为5Ml/min，制备了2种倍半萜类化合物，经紫外光谱、红外光谱及核磁、质谱分析，确认它们为（-）-cubebol和（+）-2,7（14），10-bis-bolatrien-1-ol-4-one所制备的两个化合物的纯度分别为98.7%和99.1%。2.5生物碱类化合物的分析及测定生物碱类是存在于生物体（主要为植物）中的一类含氮的碱性有机化合物，大多数有复杂的环状结构，氮素多包含在环内，有显著的生物活性，是中草药的重要有效成分之一。丁明玉33等采用高效液相色谱法分离了麻黄浸膏粉中去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱等5种主要麻黄类生物碱，用分离柱为HIQSIL C 流动相为含少量(体积分数为0.2%)甲醇的0.02mol/L磷酸二氢钠溶液（用HCl和三乙胺调至pH 3.2）。韩刚34等利用高效液相色谱法测定不同产地苦参中生物碱的含量。色谱条件：氨基键合相柱，乙腈:磷酸水溶液（pH=2）:无水乙醇=8:1:1为流动相，检测波长为220nm。测定结果准确，方法简便。罗猛35等利用反相高效液相色谱法快速测定长春花中4种碱。以水：二乙胺=986:14，用磷酸调节pH=7.2(溶液A)，甲醇：乙腈=4:1（溶液B），380mL A和620mL B 混合作为流动相，流速2ml/min，进样量10l，220nm下检测，以恒流洗脱方式在25min内分离了长春碱等4种成分。3展望高效液相色谱法还能用于香豆素类等化合物，应用范围非常广泛，是现代分析化学中最重要的分离方法之一。猕猴桃根里大量含有齐墩果酸和熊果酸，现在大部分采用的是超临界CO2萃取法，但其设备的一次性投入大，技术不够完善等缺点，有望使用高效液相色谱法能探索新的方法去制备。高效液相是卧铺法吸取了气相色谱和经典液相色谱的优点，而且具有高效、高速的优点，灵敏度高、样品用量少，并用现代化的手段加以改进，因此得到了迅猛发展。但是它的缺点也很明显，消耗大量的溶剂、产品过于稀释以及无法避免有毒溶剂的使用。色谱技术的最大弱点是定性差，因此，能将分离手段和分析手段联合成为一个整体，配上专用的计算机，成为近代分析仪器发展的一个重要方向。近年来还出现了超高效液相色谱，卓越的分离度和灵敏度更适合于复杂样品的分析，同时减少了溶剂消耗，并极大的缩短了分析时间36。极大地满足科研需要。在天然产物的分离分析中，高效液相色谱将有更广泛的应用。参考文献1 魏福祥.现代仪器分析技术及应用M.北京:中国石化出版社,2011.2 Yagi H,Ohno E,Kondo S,et al.Development and Application of Multidimensional HPLC Mapping Method for O-linked OligosaccharidesJ.Biomolecules,2011:48-62.3 Challer C A.Advances in UPLC Techniques and Column Chemistry Aid J.Parmaceutical Technology,2014,38(2):64-66.4 Seo Y H,Chung Y H,Lim C H,et al.UPLC-UV method for determination of risedronate in hu-man urineJ.Journal of Chromatographic Science,2014,52(7):713-718.5 Jadric Z,Roberts D,Rathor M N,et al.Assessment of fruit juice authenticity 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