筛选根瘤菌菌株与大豆和土壤间相互适应性研究.doc

东北林业大学毕业论文东 北 农 业 大 学成 栋 学 院 毕 业 论 文 论文题目： 筛选根瘤菌菌株与大豆和土壤间相互适应性研究 学生姓名： 王梓 指导教师： 徐庆华 副教授 所学专业： 生物技术 2013年6月仔猪黄白痢药物治疗试验方案研究Chengdong College of NortheastAgricultural University Thesis Thesis topic：Studies on screening of the adaptability of Rhizobium strains and soybean and soil Student name： Wang Zi Tutor name： Xu Qinghua Associate professor Specialty： echnology June 2013 筛选根瘤菌菌株与大豆和土壤间相互适应性研究筛选根瘤菌菌株与大豆和土壤间相互适应性研究摘 要根瘤菌与豆科植物共生固氮作用是自然界固氮效率最高固氮量最多的生物固氮体系影响根瘤菌结瘤固氮的主要因素有土壤环境对瘤菌本身和寄主豆科植物本试验针对黑龙江省大豆主产区的主要土壤类型和主要大豆栽培品种,寻找与其相匹配的根瘤菌株,探索根瘤菌大豆和土壤三因素最佳组合,为筛选出优良大豆根瘤菌接种剂菌种提供理论依据。根瘤菌宿主植物和土壤环境对结瘤固氮都存在影响,其中土壤是影响根瘤菌结瘤固氮的首要因素,其次为接种菌交互作用中,接种菌对土壤的适应性及接种菌与大豆品种的匹配性是影响共生固氮效果的主要因素,因此,要想获得最佳接种效果,必须针对土壤环境进行根瘤菌与大豆的最佳匹配。固氮酶活性影响大豆产量,对大豆籽粒的蛋脂总量也有一定影响;固氮酶活性根瘤干重和酞脉含量之间呈极显著正相关；共生固氮效率与产量呈极显著正相关种植大豆可以增强土壤肥力人豆收获后黑土和草甸土有机质的含量分别较播种前增加了13.42%和10.95%,碱解氮的含量较播种前增加27.47%和17.4%pH值有所增加,其它营养指标较播种前变化不大。关键词：根瘤菌,大豆,土壤类型,适应性,匹配性 Studies on screening of the adaptability of Rhizobium strains and soybean and soil AbstractRhizobium and symbiotic nitrogen fixation of legumes is the most efficient nitrogen fixation in nature! up to systems of biological nitrogen fixation in nitrogen-fixing Main factors influencing of Rhizobium nitrogen fixing soil! host legumes and rhizobia itself this test is intended for the Black Dragon Main soil types in the major soybean in Jiangsu Province and the main cultivated varieties of soybeans, looking for matching strains of rhizobia, exploring roots Tumor of bacteria! three factors of soybean and soil the best combinations for screening good soybean Rhizobium Inoculants provide theoretical basis .Rhizobia! host plant and soil environment on knot tumor solid nitrogen are exists effect, which soil is effect rhizobia knot tumor solid nitrogen of primary factors, second for vaccination bacteria interactive role in the, vaccination bacteria on soil of adaptability and the vaccination bacteria and soybean varieties of match sexual is effect symbiosis solid nitrogen effect of main factors, therefore, to wanted to obtained best vaccination effect, must for soil environment for rhizobia and soybean of best match.Solid nitrogen enzyme activity effect soybean production, on soybean grain of egg fat total also has must effect;solid nitrogen enzyme activity! nodules dry heavy and phthalate pulse content Zhijian is very significantly are related; symbiosis solid nitrogen efficiency and production is very significantly are related planting soybean can enhanced soil fertility people bean harvest Hou black and grass meadow soil organic matter of content respectively more sowing Qian increased has 13.42% and 10.95%, alkali solutions nitrogen of content more sowing Qian increased 27, 47% and 17.4% pH value has increased, Other nutrition indicators changed little before planting .Key Words: Rhizobium,soybeans,soil type,adaptability,matching.目 录摘 要IAbstractII前 言1 材料与方法1.1试验材料1.1.1材料1.1.2仪器与设备1.1.3培养基与实验试剂1.2试验实施方案1.2.1根瘤菌的分离和纯化1.2.2初筛试验1.2.3优选菌株的细菌学鉴定1.2.4盆栽试验1.3测定项目及方法1.3.1初筛试验1.3.2盆栽试验1.4数据分析2结果与分析2.1初筛试验2.2优选菌株R1 R5 R8的细菌学鉴定2.3盆栽试验2.3.1供试土壤的自然情况2.3.2固氮酶活性2.3.3酞脉含量2.3.4共生固氮效率2.3.5根瘤数2.3.6产量2.3.7蛋脂总量2.3.8相关性分析2.3.9接种根瘤菌对土壤肥力的影响3讨论3.1因素及其交互作用的效应分析3.2接种菌与土壤3.3生物固氮与产量和品质3.4种豆肥田机制4结论参 考 文 献致 谢 前 言 随着土地退化和非农业用地的增加，耕地面积正在以每年50-70万hm2的速度减少。要以越来越少的耕地养活不断增加的人口，并且要使农业可持续发展，其中的出路之一是提高作物单位面积产量。我国从20世纪70年代末开始相继大量施用化肥，作物产量也不断增加，然而作物产量并未随着施肥量的增加而增加，损失却越来越多，造成饮用水及空气的污染，导致氮氧化物温室气体的释放，不可更新资源的耗竭，全球N循环的不平衡，以及N03一的淋失，使环境恶化。我国正面临着人口骤增、耕地减少、资源短缺、环境恶化等尖锐矛盾，如何确保粮食安全和生态安全，满足人民生活和社会日益发展的需要，寻求农业可持续发展的新出路，己成为新世纪我国国民经济持续发展的关键问题。人们在对过去在资源与环境方面采取的战略和措施进行深深的反思中逐渐认识到，农业的发展既要确保农作物增量，又不能以破坏土地的持续生产力和生态环境为代价，这就是可持续农业发展战略。问作套种是极具中国特色的一种种植制度，是我国农民在长期生产实践中逐步摸索认识和掌握的一项增产增量措施，也是我国农业精耕细作传统的一个组成部分。问作套种早在二千多年前的记胜之书中就有关于瓜与小豆混种的记载。一千四白多年前的齐民要术中进一步记述了葱与胡姜问作等多种问套作方式，并总结了以桑园问作中要做到“二豆良美，润泽益桑”。以发挥作物问的互利作用；“慎勿于大豆地中杂种麻了”，以避开作物问的不利关系。 瘤菌与豆科植物共生固氮是己知固氮量最高的生物固氮体系全世界己知豆科植物1.9万种,其中1400一1500种在中国豆科植物的根系中广泛共生根瘤菌,固定空气中的氮并转化成养料目前全球总固氮量中仅有20%是人类工业生产的氮肥,而75%由固氮生物提供,其中根瘤菌与豆科植物共生完成的又占65%自从19世纪发现根瘤菌的固氮作用以来,人类对它已进行了100多年的研究,至今方兴未艾。 我国的根瘤菌固氮研究虽然只有60多年的历史,然而应用却是比较早的如早在1937年张宪武先生就发表了大豆根瘤菌菌株研究报告陈华癸，庆笙等先辈也先继在30年代开始了豆科根瘤菌共生固氮的研究，解放后,我国科技工作者在生物固氮的农业应用方面取得了一定的成果本世纪40年代,我国学者开始了根瘤菌剂的研究在20世纪的50与60一70年代在新区种植大豆，花生时,接种过与之相匹配的根瘤菌剂,获得了显著的增产效果。黑龙江省1983-1987年的应用面积已达到32万公顷,全省大豆播种面积的6%,占全国大豆根瘤菌剂接种面积的80%以上。2003年黑龙江垦区与启动大豆根瘤菌接种新技术的试验示范项目,与国内惟一的产业化专业化大豆根瘤菌生产企业秦皇岛领先科技公司合作,在垦区开始了大豆根瘤菌接种的大面积试验示范工作现己完成了7个试验示范基地。黑龙江省地域辽阔,土地肥沃,雨热同季,日照充足,具备大豆高产优质的条件本实验结合黑龙江省大豆主产区的主要土壤类型和主要大豆栽培品种,研究根瘤菌与大豆品种，壤类型间相互适应性关系,明确不同大豆根瘤菌与大豆品种，壤类型的适应性,试图筛选出高效固氮及竞争能力强的根瘤菌株,找到与不同大豆品种和不同土壤适宜的根瘤菌株及根瘤菌株与大豆共生能力强的共生体；试图将筛选出的优良菌株成为优良的大豆根瘤菌接种剂菌种,并且可以作为一种良好的科研用结瘤阳性对照菌株,为根瘤菌剂在黑龙江省的广泛使用奠定基础,同时也为提高大豆产量和改善大豆品质提供新思路。 土壤本身是一个复杂的生态系统,土壤的类型pH值以及其它理化性质都能影响根瘤菌的接种效果在这方面的研究虽然较多,但得出的结论还不尽相同,有待进一步研究。中国土著大豆根瘤菌大多数是有效结瘤共生菌,但共生效率不高土著根瘤菌的共生特性与菌株，大豆的地理起源类型相关,相同菌株在大豆品种间表现出了极大的结瘤固氮差异,同一大豆品种与不同地理来源的根瘤菌共生特性差别也很大这个结论进一步证明了我国大豆生产中应用根瘤菌接种剂的必要性,同时也说明选育针对竞争性土著根瘤菌和大豆品种的根瘤菌接种剂是提高应用效果的一项重要措施。近年，我省大豆生产主要应用美国菌种61A拓作为接种剂。1984年全省应用面积达46万亩，增产效果为11.6=12.200,亩增收大豆36.7斤。但是，黑龙江省地域辽阔，自然条件有很大差异，不同地区其土壤类型和大豆主栽品种也各有不同。因此，对于不同地区的土壤和大豆品种应选择最适宜的根瘤菌菌种作为接种剂，才能获得最佳的增产效果。国内外许多研究已证明，大豆根瘤菌不同菌系与大豆品种有一定亲合力，一种菌系对某种大豆品种接种有效，对另外一些大豆品种接种不一定有效。此外，土壤条件在一定程度上也影响接种效果。为明确大豆根瘤菌不同菌系与大豆品种、土壤类型的适应性，我们于1984-1985年在全省不同地区进行了中间试验，以便提出全省不同土壤和不同大豆品种适宜的根瘤菌菌系，为根瘤菌生产和应用提供科学依据。 本试验的目的是结合黑龙江省大豆主产区的土壤环境，根瘤菌与豆科植物的共生关系，会因土壤环境的差异而具有很大的多样性。通过试验的数据分析、长期观测，探究土壤的自然情况、根瘤菌的生物活性及其产物活性对植株与土壤的影响、大豆产量、植株与根瘤菌对土壤肥力的影响的。从而分析筛选出对黑龙江地区土壤环境最具适应性的的优良根瘤菌菌株及相适应的大豆品种，使得大豆根瘤菌的共生组合发挥出更好的固氮效果，提高大豆产量与土壤肥力，获得更可观的社会效益与经济效益。1 材料与方法1.1试验材料1.1.1材料黑龙江地区的大豆植株1.1.2仪器与设备离心机、菌落计数器、自动电热压力蒸汽灭菌器、电恒温培养箱、恒温振荡器、超净工作台、可见光光度计、电子分析天平、烧杯、移液管。1.1.3培养基与实验试剂 YMA 固体培养基：甘露醇 10g，酵母粉 3g，MgSO47H2O 0.20g，NaCl 0.10g，K2HPO40.25g，KH2PO40.25g，pH 7.0，固体琼脂1518g； TY 液体培养基：胰蛋白胨 5g，酵母粉 3g，CaCl26H2O 0.70g，pH 7.07.2； LB 液体培养基：细菌培养用胰化蛋白胨 10g，细菌培养用酵母提取物 5g，氯化钠 10g，pH 7.0；Fahraeus 无氮营养液：CaCl22H2O 0.10g，MgSO47H2O 0.12g，KH2PO40.10g，Na2HPO412H2O 0.15g，柠檬酸铁 5.0mg；微量元素液：H2BO32.86g，ZnSO4H2O 0.22g，MnSO44H2O 2.03g，NaMoO42H2O 0.13g，CuSO45H2O 0.08g（使用时接 0.1mL 加入 1L Fahraeus无氮营养液中）； 以上培养基、营养液除特殊说明外，配制时均用蒸馏水定容至1000mL，在121灭菌30min。 1.2试验实施方案1.2.1根瘤菌的分离和纯化供试的10个菌株自大豆根瘤中直接分离，采用系统分离法分离根瘤菌。具体分离方法是将植株的根部浸泡冲洗千净后，用剪子剪下根瘤,略带一小段根，将根瘤用95%的酒精浸泡5min后，再用3%的NaCl溶液浸泡5min，然后用无菌水冲洗5遍，用无菌滤纸将根瘤表面的水吸干后，取其汁液在平板上划线接种并以经过表面消毒的整个根瘤置于平板中间位置作为对照，保温28e培养挑取平板上长出的菌落接于YMA斜面上，待斜面上长出菌苔后,采用稀释平板法对所分离的菌株进行纯化其详细情况见表1-1。表1-1供试菌株编号菌株宿主土壤类型R1MLS1BGlycine max 大豆BS 黑土R2MS2BGlycine max 大豆BS 黑土R3YS3MGlycine max 大豆ML 草甸白浆土R4BX1BGlycine max 大豆BS 黑土R5HAB1Glycine max 大豆BS 黑土R6MS4MGlycine max 大豆ML 草甸白浆土R7HAB2Glycine max 大豆BS 黑土R8HL1BGlycine max 大豆BS 黑土R9HL2DGlycine max 大豆DBE 暗棕壤R10LKAGlycine max 大豆AS 白浆土RckJX4DGlycine max 大豆DBE 暗棕壤1.2.2初筛试验初筛试验以从根瘤中分离的10株根瘤菌和黑龙江省优质大豆为材料供试大豆的详细情况见表1-2。初筛试验以河砂为基质,采用双层钵法进行栽培用一纱布条穿过纸杯底部,杯中装有洗净的河砂,将纸杯置于装有Fahraeus无氮植物营养液的罐头瓶口上,河砂通过纱布吸取营养液,以维持砂中植物生长所需要的湿度杯口用封口膜封口以上装置采用分别灭菌后在无菌超净台中组装的,河砂121e蒸汽灭菌2.5h,其余装置121e蒸汽灭菌3Omin。将经过表面灭菌的种子放入无菌平皿中,皿底垫上湿润的灭菌纱布28e催芽2d分别对催芽后的4个大豆品种接种10株根瘤菌,以无菌水浸种作为对照,播种于双层钵中置自然光照下培养,共44个处理,3次重复。催芽后的种子在菌悬液中浸泡巧而n,用无菌镊子夹取植入装有砂培的杯中,在沿各植株根部加入该菌液2ml,使每个处理中含菌量达到40亿个设不接种的种子作为对照。接种方法:浸种,取一无菌培养皿加入菌悬液适量再加入发芽一致的种子,浸泡15min用无菌镊子夹取植入装有砂培的杯中,再沿各植株根部加入该菌液2ml使每个处理中含菌量达到4又10个/ml。表1-2供试大豆品种编号品种名称蛋白质含量脂肪含量引种单位V1东农4246.04%19.33%东北农业大学大豆研究所V2东农116840.50%22.00%东北农业大学大豆研究所V3黑农4844.71%19.05%东北农业大学大豆研究所V4绥农1441.72%20.48%东北农业大学大豆研究所1.2.3优选菌株的细菌学鉴定 试验采用经典分类鉴定方法，包括菌株形态特征和培养特征观察生理特性鉴定三部分一内容。1.2.4盆栽试验试验所用的两种土壤均取自于双城，草甸土取自于双城市临江镇,黑土取自于双城市市郊,前茬作物均为玉米试验用盆质地为塑料，上口直径为30厘米，盆底直径为25厘米，桶高为30厘米每盆装土10kg。试验采用完全设计方案分别在草甸土和黑土上对东农42和东农1168接种根瘤菌株R设接种菌株，作为接种菌株的阳性对照,不接种为阴性对照,共20个处理,6次重复,采用盆栽方法,完全随机排列,在东北农业大学园艺站内进行。接种方法:采用种子丸衣化方法丸衣材料比例按10009种子加1009根瘤菌剂,阿拉伯胶液(1009阿拉伯胶溶于225m一热水中)5009碳酸钙,加铝酸按109配制；首先将根瘤菌剂与胶液混匀,然后把种子和拌有根瘤菌的胶液一起搅拌,当每粒种子都均匀的拌有根瘤菌剂胶液后加铝酸按,再加入碳酸钙后不停地搅拌直到种子完全丸衣不结块且包衣均匀为宜,做好的丸衣种子避免在阳光下暴晒。播种:为了防止根瘤菌污染空白对照区,先播对照区的种子,然后再播丸衣接种区,采用一般田间管理。1.3测定项目及方法1.3.1初筛试验出苗后45周，测定植株干重，株高，根瘤数，根瘤干重。1.3.2盆栽试验采用乙炔还原法剪下待测植物的根置于500ml三角瓶中，加盖橡皮塞后，从中吸出50ml空气，注入50ml乙炔，室温下反应30min后，从中吸出4mL混合气体放入顶空瓶中，上机时用微量注射器从顶空瓶中抽取混合气体100闪注入气相色谱仪(GC)进样柱中，测定CZHZ!CZH4峰值,重复2次，后在同样条件下用标准乙烯测定并绘制乙烯的标准曲线由此计算根瘤样品的固氮酶活，每个处理做3次重复。1.4数据分析采用DPs7.05版Excel和相关的计算机其他软件进行数据分析。2结果与分析2.1初筛试验结果表明，10个菌株均能在四个品种大豆上结瘤品种V除了根瘤数与V:差异不显著外v,的株高植株干重和根瘤干重都极显著高于其他品种,品种V:的植株干重和根瘤干重极显著高于V:和叭所以在初筛试验中初步认定V,为最佳品种,品种次之初筛试验中，参试菌株对大豆的株高植株干重根瘤数和根瘤干重都有极显著的提高作用，接种菌株Rl和R:其效果更为显著，说明这二种菌株与V.和V:之间有较强的亲和力为进一步检验优选菌株与优选品种的共生有效性及选育出亲和力强和适应性强的菌株，在盆栽实验中结合土壤类型因素以考查根瘤菌与大豆与土壤间的相互适应性，进而筛选出匹配性更好的优良组合。2.2优选菌株R1 R5 R8的细菌学鉴定优选菌株细菌学鉴定结果，菌落形态观察:不同菌株形成不同大小粘稠度和透明度的菌落形态,其中菌株Rl和RS形成粘稠而呈乳白色的菌落，称为M型；菌株凡和凡k形成稀薄而半透明的菌落，称为w型为慢生型根瘤菌，在B.T.B反应中产碱，在石蕊牛奶中产碱，在含2%NaCI的培养基中不能生一长;能够利用柠檬酸盐，在肉汤蛋白陈中不能生长，不产生3一酮基乳糖。2.3盆栽试验2.3.1供试土壤的自然情况表2-1供试土壤的自然情况土类有机质全氮全磷缓效钾碱解氮速效磷pH菌数g/kgg/kgg/kgmg/kgmg/kgmg/kgNSR/g黑土28.620.270.46944.36168.636.27.3150草甸土22.370.210.62918.27121.3544.585.4420由表2-1可见,黑土中有机质和碱解氮的含量分别较草甸土高出6.15g和46%在其他项目比较中，全磷和速效磷草甸土高于黑土，其他项目均低于黑土黑土pH值接近中性，草甸土的pH值偏酸性，根瘤菌在两种土壤中都能进行良好结瘤草甸土中土著根瘤菌的数量较多，为420个/g干土，几乎是黑土中土著根瘤菌数量的3倍黑土和草甸土中的速效磷和速效钾的含量等级都为高，所以说在两种土壤中不存在磷钾元素缺乏影响共生固氮的问题。2.3.2固氮酶活性固氮酶活性方差分析结果表明,菌株大豆品种土壤类型及其所有的交互作用对固氮酶活性的影响均达到差异极显著水平从单因素效应来看,黑土中固氮酶活性高于草甸土，品种V植株固氮酶活性高于妈菌株对固氮酶活性影响的比较结果对大豆接种根瘤菌其固氮酶活性都极显著的高于阴性CK，说明接种根瘤菌能够提高植株的固氮能力；菌株Rl和凡固氮酶活性极显著高于Rek,对大豆接种菌株Rl其植株生物固氮量最高，说明菌株Rl生物固氮能力强于其它菌株。在黑土中,菌株R,和RCk与品种V:和V:的共生体固氮酶活性极显著高于两CK处理，但菌株RS的两共生体与两CK之间差异不显著；V1接种菌株Rl与队固氮酶活性之间差异不显著，但叭接种Rl其固氮酶活性极显著高于丸；Vl接种RS固氮酶活性极显著低于RCx,但V接种RS固氮酶活性显著高于丸在草甸土中，处理固氮酶活性极显著的高于其他接种处理，并且对v,和v:来说，接种菌株的处理固氮酶活性均极显著的高于CK处理。处理之间差异不显著，但显著高于其它处理四个阴性对照比较结果表明,黑土与两个品种间的组合固氮酶活性都高于草甸土与两个品种组合，而且他们之间的差异极显著；黑土与v,组合间固氮酶活性显著高于与V的组合；草甸土与V和v组合间固氮酶活性差异不显著。2.3.3酞脉含量酞脉含量方差分析结果表明,除大豆品种对酞脉含量差异显著影响外,其他因素及其交互作用对酞脉含量均达到差异极显著性影响从单因素效应看,黑土中酞脉含量高于草甸土菌株对酞脉含量影响,大豆接种根瘤菌其植株酸脉含量都极显著的高于CK,说明接种根瘤菌能够提高植株酞脉含量,而且接种Rl其植株酞脉含量最高并极显著高于瓜,菌株R,和RS酸脉含量极显著低于RCx,说明菌株R,氮素贮藏和运输的最多。RV交互作用对酞脉含量影响的比较结果见表2-2接种菌与不同大豆品种的组合其酞脉含量均极显著高于CK处理；对品种V,接种R,其酞脉含量极显著高于RCk,而接种RS和S其酞脉含量极显著低于凡k；对品种VZ种R,和RS其酞脉含量极显著高于RCk而Rs酞脉含量显著低于Rck从表中还可以看出,交互作用酞脉含量极显著高于其它的交互作用,说明RI与V,之间组合贮藏和运输的酞脉较多,此结果与固氮酶活性相同。表2-2不同菌株对酞脉含量影响的比较菌株酞脉含量差异显著性F0.05F0.01R116.42aARck14.96bBR814.43cCR513.91dDck11.59eE根瘤菌与大豆土壤组合间酞脉含量差异显著性比较结果中,可以明显的看出所有根瘤菌与大豆的组合其酞脉含量在黑土中均极显著高于在草甸土中在黑土中，品种V1和VJ其酞服含量均极显著高于CK处理:V接种RS其酚脉含量极显著高于CK处理，但v接种RS其酞脉含量极显著低于CK处理；品种V1和VZ接种RI其酞脉含量极显著高于Rck,接种R8酞脉含量与Rck之间差异。2.3.4共生固氮效率根瘤菌与大豆在不同土壤中共生固氮效率的比较见图2-3豆的组合其固氮效率在黑上中均显著高于草甸土中的组合在草甸土中，菌株R与两个品种组合的固氮效率最高，固氮效率分别为5.63%和20.77%。R与V组合的共生固氮效率均高于与V,的组合在黑土中，菌株RI与两个品种的组合固氮效率最高，固氮效率分别为34.92%和34.46%；RCkRl和RS与v;组合的共生固氮效率均高于与V的组合以上说明，在草甸土和黑土中品种V和姚接种R,其共生固氮效率均为最高，由此可见,菌株R与两品种之间的共生匹配性在草甸土和黑土中显著高于其它菌株RV共生固氮效率在草甸土中最大，而RIVI共生固氮效率在黑土中最大，这种差异的产生说明固氮作用不仅取决于根瘤菌与大豆基因的匹配，土壤环境因素对固氮作用的影响也不可忽视说明RI在草甸土中有很强的生存定殖能力。图2-3土壤中大豆一根瘤菌组合固氮效率的比较2.3.5根瘤数 根瘤数方差分析结果表明，根瘤数受多方面因素的影响:菌株和土壤类型对根瘤数影响均达到差异极显著水平，大豆品种对根瘤数影响达到差异显著水平，因素间的交互作用对根瘤数影响均达到差异极显著性水平从单因素效应来看，黑土中根瘤数要极显著高于草甸土，这与根瘤干重的方差分析结果相同，在不同菌株对大豆根瘤数影响的比较中，对大豆接种根瘤菌其根瘤数均极显著高于菌株其根瘤数要极显著高于1菌株，两者之间差异不显著这与不同菌株对根瘤干重影响的变化结果近乎相同，说明接种根瘤菌株大豆形成的根瘤体积大小不同会影响到根瘤干重有些偏差。2.3.6产量 大豆产量的方差分析结果表明,菌株大豆品种土壤类型及其之间的交互作用，均达1%显著水平，土壤是产量效应的决定性因素;竟争结瘤能力强的优良根瘤菌株对产量效应也起着决定性的作用；大豆品种对产量也起着关键性的作用；菌株与土壤及菌株与品种及土壤的交互作用对产量效应也起着很大的作用。 从单因素效应来看，大豆在黑土中的产量要极显著高于在草甸土中，品种V的产量要显著高于在不同菌株对大豆产量影响的比较中对大豆进行接种根瘤菌株其产量极显著高于接种菌株，其两者之间差异极显著，接种菌株其产量之间差异不显著，接种菌株增产效应最高，说明菌株有较强的竞争结瘤固氮能力。 RxS交互作用对大豆产量影响的比较结果，种菌与黑土的交互作用极显著的高于与草甸土的交互作用并且均极显著的高于接种菌株R和凡其产量均极显著高于队，且两者之间差异极显著，接种菌株R能获得较高的产量；在草甸土中，接种菌株均能提高产量，接种菌株Rl效果最好R,交互作用产量极显著高于R的交互作用,这与根瘤干重结果相同，上说明，菌株Rl在两土壤中都有较强的适应性和较强的生存侵染能力，在草甸土中相对低与草甸土土著菌多有关。根瘤菌与大豆土壤组合间产量差异显著性，瘤菌与大豆的组合在黑土中均差异极显著的高于在草甸土中在黑土中，品种v,接种根瘤菌株的处理其产量均极显著高于CK，接种菌株R凡和凡其产量均差异极显著高于RCk,且菌株R差异极显著高于菌株凡和RS,菌株R与V匹配产量最高；而V种根瘤菌株均能够提高产量，但接种菌株R凡和队之间差异不显著在草甸土中，品种V种根瘤菌株均能够提高产量，且接种处理间差异不显著；品种姚接种根瘤菌株R凡和凡的处理其产量极显著的高于CK,接种菌株Rl其产量差异极显著高，说明两品种无论是在黑土还是在草甸土中都具有较强的亲和力及其共生固氮能力，阴性对照的产量情况来看，两个品种在黑土中的产量要极显著高于草甸土两个品种在同一类型土壤中，其产量之间差异均不显著,说明土著根瘤菌与两个品种的亲和力之间无明显差别以上结果与根瘤重及根瘤数相同，说明土著根瘤菌的结瘤固氮能力较弱。2.3.7蛋脂总量 由于大豆蛋白质含量和脂肪含量呈负相关，所以用蛋脂总量来衡量大豆的品质大豆蛋脂总量方差分析结果表明，菌株，豆品种，壤类型三因素以及因素间的交互作用对大豆蛋脂总量的影响均达到差异极显著水平，这说明大豆品质受多方面因素的影响，株对大豆蛋脂总量的影响结果可以看出，对大豆接种根瘤菌其蛋脂总量均差异极显著高于CK，接种菌株其蛋脂总量极显著高于肠且两者之间差异极显著因为蛋白质和脂肪含量比为2:l的关系，所以蛋脂总量高往往是蛋白质含量高通过以上说明，对大豆进行有效的接种根瘤菌能够提高蛋白质的含量，改善大豆品质；对大豆接种菌株R:体现的尤为显著。2.3.8相关性分析 进一步对盆栽试验中期取样的各指标与大豆产量和品质等烤种指标作相关性分析结果表明,中期取样的各指标相互之间除固氮酶与固氮效率之间显著正相关外，其他指标之间均为极显著正相关；大豆产量与品质等烤种指标相互之间除蛋脂含量和其他指标之间不显著外，其他指标相互之间均为极显著正相关。 由固氮酶活性和酞服含量等指标与大豆产量和品质等指标的线性相关系数，以看出蛋脂总量与中期取样各指标之间均不显著相关,但其他指标与中期取样各指标之间均为显著正相关或极显著正相关；酞脉含量根瘤干重和固氮效率与烤种各指标之间均为极显著正相关，原因有可能是根瘤干重大其含菌组织的体积也较大，固氮作用强产生的酞脉也就越多，酞脉含量多贮存和为植株运转的氮量就多，从而为植株的营养生长和生殖生长提供更多的能源，因此营养生长和生殖生长的各指标就会相对高。2.3.9接种根瘤菌对土壤肥力的影响 由表2-4看出，两种土壤的有机质和碱解氮都有一定的增加，黑土和草甸土的有机质含量分别较播种前增加了3.84g/kg和2.45g，较播种前含量增加13.42%和10.95%碱解氮分别较播种前增加了32.58g和21.16g/kg，较播种前增加27.47%和17.4%。收获后和播种前土壤全氮含量变化不大，高效磷和速效钾较播种前有所减少，大豆接种根瘤菌以增强固氮能力，有助于磷钾肥的吸收pH值有所增加，这有可能和接种菌株都为慢生根瘤菌产碱有一定的关系。表2-4供试土壤的基础肥力项目黑土草甸土收获后播种前收获后播种前有机质32.463.4824.822.45全氮0.2700.220.01碱解氮151.1832.58142.821.16全磷0.141-0.050.59-0.03速效磷40.61-4.2142.42-2.16缓效钾946.151.79876.39-41.88速效钾173.36-20.51150.39-12.79pH7.50.25.050.13讨论3.1因素及其交互作用的效应分析 通过方差分析中F值的大小即可判断出因素及其交互作用的效应大小关系在各指标的分析中,因素及其交互作用效应的大小关系的总体规律是:单因素效应大于一级交互作用效应,一级交互作用效应大于二级交互作用效应在本试验的各指标考察中,只有蛋脂总量受大豆品种因素的影响大于其它因素以及各因素间的交互作用,而其它所有指标的结果中,土壤类型因素对这些指标的影响均大于其它因素效应以及各因素间的交互效应;在固氮活性酞脉含量根瘤数，根瘤干重，产量和百粒重的测定结果中发现,菌株因素对它们的影响仅次于土壤因素,而大于其它因素以及各级连应效应；品种因素效应对荚数，粒数和株高具有很大的影响由以上分析得出:一是三个因素中土壤类型是影响根瘤菌结瘤固氮的首要因素土壤本身是一个复杂的生态系统,土壤的理化特性，生物因素直接影响根瘤菌的定殖和侵染二是大豆的遗传型直接决定其品质,但土壤和菌株对大豆品质也有一定的影响所以选育与根瘤菌相互亲和性好的品种有利于提高大豆的品质三是接种根瘤菌显著增强了固氮酶活性和酞服含量及提高了大豆产量和根瘤干重等,原因是对植株接种的根瘤菌有很强的生存和定殖能力,酞脉含量增多,那么为植株籽粒提供的氮量就会增强,因此提高了产量和改善了品质因为在实际应用当中,不可能针对大量的品种使用不同菌株的菌剂,所以要考虑菌株和寄主大豆品种的广谱性问题。 交互作用中,菌株与土壤类型的交互作用对根瘤干重，产量，荚数和百粒重的影响大于其它的交互作用；在固氮酶活性酞脉含量和蛋脂总量的分析中,菌株与大豆品种间交互作用对以上各指标的影响大于其它交互作用效应；大豆品种与土壤类型的交互作用对株高和单株粒数的影响大于其它交互作用效应以上说明,接种菌与大豆品种及与土壤间的相互适应性是影响共生固氮效果的主要因素,说明获得最佳接种效果,必须得同时考虑接种菌宿主植物和土壤环境因素这证实了根瘤菌与豆科植物的共生关系因生态环境的差异而具有很大多样性此结论与根瘤菌接种选种的新准则相一致:即选种时必须既针对植物品种(而不是种),又针对生态环境进行根瘤菌与宿主的最佳匹配,以期获得最好共生效果在以往的工作中,大多侧重寄主和根瘤菌株关系的研究,或是某一环境因素对共生固氮作用的影响,而将三者统一起来进行探讨的并不多,本试验将菌株大豆品种和土壤三因素结合起来进行探讨,发现菌株与大豆品种最佳匹配的同时,土壤环境因素对菌株在土壤中的生存和定殖也起着决定性作用。3.2接种菌与土壤影响根瘤菌竞争结瘤能力的生态因素有土壤条件，肥力水平，土著根瘤菌的数量和类型，其它微生物，根瘤菌的接种方式和时间等接种菌在不同土壤上的竞争结瘤能力不一样土壤理化性质同接种菌株的有效性存在一定的相关，本试验研究结果表明，接种菌在两种土壤中都表现出较强的生存和定殖能力，黑土中表现的尤为极显著，但在草甸土中也表现出显著的接种效果土壤中土著根瘤菌数量分布对接种菌株的侵染结瘤有显著的制约作用，但土著菌种类不同，与接种菌的竞争结瘤能力也不同，因此要成功接种必须针对当地土著菌种类,筛选出竞争结瘤能力强的接种菌。3.3生物固氮与产量和品质根瘤固氮对增加大豆氮素营养及提高产量具有重要作用，根瘤发育的健壮与否又直接影响大豆对氮素的吸收，本研究在固氮酶活性酞脉含量和根瘤干重等共生生物固氮有效性指标与产量品质的相关性分析中发现，固氮酶活性与大豆产量之间显著相关，但其与籽粒中蛋脂总量之间相关系数为0.32，虽然它们之间不显著相关，但从相关系数看它们之间是有一定的相关性的；酞脉含量和根瘤干重等指标与大豆产量之间均为极显著相关，但它们与蛋脂总量之间相关系数很小，此结果说明对大豆接种根瘤菌提高了产量，而且对大豆品质有一定的影响，选用相应的根瘤菌，能收到明显的增产增收效果，根瘤固氮能力的强弱能够影响大豆的产量和品质其原因在于由于根瘤固定了大量的是籽形成的物质基础氮是构成蛋白质和核酸的主要物质,是一切生命的要素。3.4种豆肥田机制我国东北地区的大豆茬农谚都是肯定它有肥田作用,有肥茬，软茬，热茬和油茬之称这种说法虽没有现时的科学数据，但它体现了大豆肥田综合的和感性的指标，针对这一说法，本研究在大豆收获后再一次测定了试验土壤的基础肥力。果表明两种土壤的有机质和碱解氮的含量都有大幅度的增加黑土和草甸土中有机质的含量分别较播种前增加了13.42%和10.95%，碱解氮含量较播种前增加27.47%和17.4%，其他指标与播种前相比变化不大也有研究通过对栽种大豆的土壤养分进行定点监测化验发现，土壤中全氮有机质等养分含量明显增加，土壤养分含量增加最明显的是速效钾和速效磷豆科绿肥作物接种根瘤菌后，提高了土壤有机质，对培肥地力疏松土壤改善土壤通透性等方面均非这说明虽然我们不清楚根瘤固氮在大豆肥田机制中的具体贡献,但我们可以从前人的阐述中得到一些启发。初步分析还有大豆根系组织结构及其化学成分促使幼嫩根系形成自我吸收障碍根系很庞大的豆科植物，尤其能不断地发出根系新老更替，新根又能长根瘤的作物，它们给土壤遗留下来的氮素数量，似乎要多于根系有限的作物。4结论Rl侵染能力最强，与寄主的共生有效性最高待进一步扩大考查R共生结瘤谱后，其有望成为优良的大豆根瘤菌接种剂菌种，并且可以作为一种良好的科研用结瘤阳性对照菌株。品种 V2对它们进行侵染结瘤的共生固氮效率和产量极显著高于品种V1,筛选具有优良性状的寄主大豆品种与选育高效根瘤菌菌株同样重要。黑土的接种处理极显著高于草甸土。种植大豆可以增强土壤的基础肥力。参 考 文 献1. 常从云、孙克用、卢增辉、戴蜀迁、赵长军、杨孟佩、李奇真，1990，高效固氮根瘤菌与高产高蛋白大豆最佳共生体筛选研究简报。大豆科学.9(3):256-2612. 陈朝勋、席琳乔、姚拓、张虎、张德是.2005.生物固氮测定方法研究进展.草原与草坪.2:24-263. 陈丹明、曾昭海、隋新华、胡耀高、陈文新.2002.紫花首稽高效共生根瘤菌的筛选草业科学，19(6):27-324. 陈俊生.1994.建设高产优质高效农业。中国农业出版社.25-285. 陈文峰，陈文新。2003，我国豆科植物根瘤菌资源多样性及应用基础研究。生物学通报38(7):l-46. 陈文新、李阜棣、闰章才。2001.我国土壤微生物学和生物固氮研究的回顾与展望。世界科技研究与发展.24(4):6-127. 陈文新、汪恩涛、陈文峰。2004.根瘤菌一豆科植物共生多样性与地理环境的关系。中国农业科学37(l):81-868. 慈恩，高明。2004.生物固氮的研究进展。中国农学通报。20(1):25-289. 戴小密、刘彦杰、叶小梅、朱万宝、许玲、朱家壁、常志州、黄红英、马艳、俞冠翘2003。接种大豆根瘤菌遗传工程菌株LMG101对大豆的增产效应。中国农业科学36(l):66-7010. 丁武.1992.影响根瘤菌竞争结瘤的生态学因素分析。生态学杂志.11(4):50-5411. 董继珍.2005.浅析种植大豆对培肥地力的作用.云南农业.(8):24-2512. 董守坤、马春梅、李姚、金喜军、垄振平.2005.大豆植株中酞脉含量变化动态研究.东北农业大学学报.36(5):549-55213. 董钻.1997.关于大豆株型和株型育种的儿个问题.大豆通报.(2):1-214. 窦新田、程恒昌、李树藩、李新民、程恒昌、吴尔其、桑秀香、潘绍英.1989.大豆根瘤菌在黑龙江省接种效果与接种有效性的研究.中国农业科学.22(5);62-7015. 窦新田、李树藩、李晓鸣、程恒昌,、吴尔其、桑秀香、潘绍英.1989.黑龙江省大豆接种根瘤菌增产效果和接种有效性的研究#中国农业科学.5:142-14416. 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