DB32∕T 1769-2011 马链球菌兽疫亚种的检测PCR 方法

ICS 65.020.30 B 41 备案号： 江苏省地方标准 DBDBDBDB32323232 DB32/T17692011 马链球菌兽疫亚种的检测PCR 方法 Method of PCR for detecting Streptococcus zooepidemicus 2011-05-06 发布2011-07-06 实施 江苏省质量技术监督局 发布 DB32/T 17692011 I 前言 为规范马链球菌兽疫亚种分子生物学检测技术，提高马链球菌兽疫亚种检测的灵敏度、稳定性、 特 异性，特制定本标准。 本标准按 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写编写。 本标准的附录 A 为规范性附录。 本标准由江苏省农业科学院提出。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准起草人：倪艳秀、何孔旺、吕立新、张雪寒、周俊明、俞正玉、茅爱华、温立斌、郭容利、 李成仁、李彬、王小敏。 DB32/T 17692011 1 马链球菌兽疫亚种的检测PCR 方法 1范围 本标准规定了马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法所用的仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、 结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等技术标准。 本标准适用于马链球菌兽疫亚种的 PCR 检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的， 凡是注日期的引物文件， 仅注日期的版本适用于本文件， 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法 3原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子 链 DNA 的过程。是一项 DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的 DNA。本标准根据 GenBank 上公布的马链球菌兽疫亚种类 M 蛋白基因序列，在其保守区设计一对特异性引物，经过了 PCR 条件的优化、特异性实验、敏感性实验等，对马链球菌兽疫亚种的鉴定具有很高的准确性。 4仪器设备和主要试剂 4.1仪器设备 4.1.1高速离心机 4.1.2水浴锅 4.1.3PCR仪 4.1.4核酸电泳仪 4.1.5凝胶成像系统 4.2主要试剂 除另有规定，所用试剂均为分析纯。 4.2.1生理盐水 4.2.2蛋白酶K 4.2.3Taq 酶 4.2.4dNTP 4.2.5琼脂糖，电泳级 5引物 DB32/T 17692011 2 上游引物：5- GCAGCCCTCTTGGTTGGT- 3；下游引物：5- CTGCGTCAGCGTCTCCAT- 3。 6方法步骤 试验用水：按照GB/T 6682-2008 三级水标准。 6.1样品处理 6.1.1病料样品处理 采用差速离心法：取约 5 g 病料，剪碎研磨，用 5 mL 生理盐水混悬，先 2000 r/min 离心 2 min， 去除大组织块，取上清液，后 10000 r/min 离心 5 min，弃上清液，沉淀以灭菌水重悬，备用。 6.1.2可疑培养物样品处理 取可疑培养物 1 mL 10000 r/min 离心 5 min，弃上清，沉淀以 200 L 灭菌水重悬，备用。 阴性对照：液体培养基。 阳性对照：马链球菌兽疫亚种液体培养物。 阴性、阳性对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。 6.2DNA提取 取 ddH2O 溶解的样品，每 200L 加入 3L 蛋白酶 K（20mg/mL），42作用 1 h，煮沸 5 min，10 000 rmin 离心 5 min，上清作为模板。 6.3PCR扩增 6.3.1反应条件 按 25 L 体系进行，10 buffer 2.5L，MgCl2（25 mM）1.5L，dNTP（2.5 mM）1.0L，上游引 物（50 pmol/L）0.5L，下游引物（50 pmol/L）0.5L，模板 DNA 3.0L，Taq 酶（5 U/L）0.5L， 灭菌水 15.5L。按如下条件进行 PCR 反应。95 5 min，然后进入循环 94 1 min，60.2 1 min， 72 1 min，35 个循环，于 72 延伸 10 min，4 保存。 6.3.2电泳 将 PCR 反应产物于 1.0 %琼脂糖凝胶进行电泳，电压为 120 V，时间 30 min。 6.3.3结果观察 用凝胶成像系统观察结果，并进行拍照。 7结果判定 7.1试验结果成立条件 阳性对照的PCR产物电泳后在364 bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条 带，试验结果成立；否则，结果不成立。 7.2结果判定 7.2.1在试验结果成立的前提下， 如果检测样品中PCR产物电泳后在364 bp的位置上出现一条特异性条 DB32/T 17692011 3 带，判为阳性，即该样品为马链球菌兽疫亚种核酸阳性。 7.2.2在试验结果成立的前提下， 如果检测样品中PCR产物电泳后在364 bp的位置上未出现一条特异性 条带，判为阴性，即该样品为马链球菌兽疫亚种核酸阴性。 7.2.3如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要做重复试验；如果阴性对 照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要做重复试验。 8废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录 A。 DB32/T 17692011 4 附 录 A (规范性附录) 检测过程中防止交叉污染的措施 A.1抽样和制样过程 抽样和制样工具，应清洗干净，121 ,1520 min灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用。存放 样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为一次性灭菌容器。 A.2检测过程 A.2.1PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR 循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单方向进行。 A.2.2实验过程中，应穿实验服和戴手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。 A.2.3各区所有的试剂、器材(尤其是移液器)、仪器都应专用，不得带出该区。 A.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121 ,1520 min灭菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每种溶液 应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在2025 贮存的试剂中，可加0.025% 的叠氮钠。 所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用