DB32∕T 2957-2016 鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法VIP

ICS 65.150 B50 备案号：51404-2016 DB32 江苏省地方标准 DB32/T 2957-2016 鲤疱疹病毒型 PCR 检测方法 PCR inspection specification of cyprinid herpesvirus 2016 - 09 - 20 发布 2016 - 11 - 20 实施 江苏省质量技术监督局 发 布 DB32/T 2957-2016 I 前 言 本标准按GB/T1.12009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则要求进行编写。 本标准由江苏省海洋与渔业局提出。 本标准起草单位：江苏省水生动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：陈辉、袁锐、方苹、倪金俤、刘训猛、陈静、郭立新、吴亚锋 DB32/T 2957-2016 1 鲤疱疹病毒型 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了鲤疱疹病毒型（cyprinid herpesvirus）检测方法的试剂和材料、仪器和设备、 采样、检测步骤和结果判断。 本标准适用于鲫鱼疱疹病毒病病原的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7014-2008 水生动物产地检疫采样技术规范 3 试剂和材料 3.1 水 符合 GB/T 6682-2008 中一级水的规格。(该水用来配置规范性附录 A 中所列试剂) 3.2 无水乙醇 3.3 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 3.4 Taq DNA 聚合酶及配套的 10 PCR 缓冲液 Taq DNA 聚合酶或 Ex Taq DNA 聚合酶，生化试剂，-20保存。10 PCR 缓冲液为该酶配套的相 应反应缓冲液，生化试剂，-20保存。 3.5 MgCl2（25mmol/L） ：生化试剂，-20保存。 3.6 dNTPs 混合物 含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 10mmol/L 的混合物，-20保存。 3.7 5 TBE 电泳缓冲液（按附录 A 的规定）。 3.8 6 DNA 上样缓冲液（按附录 A 的规定）。 3.9 引物及扩增片段 鲤疱疹病毒型 DNA 聚合酶基因扩增引物：P1：5- CCCAGCAACATGTGCGACGG-3，P2：5- CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3。扩增片段大小为 362 bp。 注：该引物为扩增鲤疱疹病毒型 DNA 聚合酶基因的通用引物。 3.10 DNA 分子量标准 DB32/T 2957-2016 2 宜使用 DNA marker 2000，各片段大小依次为：2000 bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp， 也可使用其他合适的 DNA 分子量标准。 3.11 阳性对照 阳性对照为已知受鲤疱疹病毒型感染，且 PCR 检测结果为鲤疱疹病毒型阳性并经测序验证的 DNA 模板，-20保存。 3.12 阴性对照好 阴性对照为已知未受鲤疱疹病毒型感染，且 PCR 检测结果为鲤疱疹病毒型阴性的组织，提取 DNA，-20保存。 3.13 空白对照 灭菌双蒸水（无 DNA 酶） 。 3.14 核酸染色剂 Goldview TM核酸染料或其他宜使用的核酸染料。 4 仪器和设备 4.1 台式高速离心机：最高转速可达 12000 rpm 以上。 4.2 普通冰箱：具有冷藏箱，-20以下冷冻箱体。 4.3 PCR 仪。 4.4 电泳仪：输出直流电压 0-600V。 4.5 水平电泳槽。 4.6 凝胶成像仪。 4.7 水浴锅或者金属浴。 5 采样 5.1 采样数量 按 SC/T 7014-2008 中 6.1 的规定执行。 5.2 个体要求 活鱼或濒死的鱼。 5.3 采样部位 有临床症状的鱼，如体长不超过 4 cm，取鳃；体长为 4 cm6 cm，取鳃和内脏（包括肾） ；体长大 于 6cm，则取脑、肝、肾、脾和鳃组织。 无症状的鱼取肾、脾、鳃和脑组织。 性成熟雌鱼还需取卵巢液。 DB32/T 2957-2016 3 5.4 操作要求 5.4.1 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。 5.4.2 镊子，剪刀等取样工具需要进行灭菌（湿热灭菌为 121，20 min；干燥灭菌为 160，3 小时）。 5.4.3 实验室以外的环境下采得的组织样品需用液氮及时保存。 6 检测步骤 6.1 DNA 抽提 6.1.1 取 100 mg 左右待检新鲜组织与 300 L CTAB 溶液研磨匀浆， 置于 1.5 mL离心管内。 加入 450 uL CTAB 溶液并混匀，65放置 2 h。 6.1.2 加入 600 L 酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）至样品离心管中，持续上下颠倒用力混合至少 1 min， 12000 r/min 4离心 10min，小心取上层水相（约 700 L）置于新的 1.5 mL 离心管中。 6.1.3 加入 700 L 氯仿-异戊醇（24:1），用力混合至少 30 s，12000 r/min 4离心 5 min，小心取上 层水相（约 600 L）置于新的 1.5 mL 离心管中。 6.1.4 加入-20预冷的 1.5 倍体积无水乙醇（约 900 L） ，倒转数次混匀后，置-20沉淀 1 h 以上。 6.1.5 12000 r/min 4离心 30 min，小心去上清，倒置于吸水纸上吸干水分；室温干燥或真空干燥。 6.1.6 加 10 L 双蒸水溶解，作为 DNA 模板。 DNA 抽提也可选用商品化病毒 DNA 抽提试剂盒，按相应说明书提供的方法予以抽提。 6.2 基因扩增 6.2.1 按表加入除了 Taq DNA 聚合酶和待检 DNA 模板或对照以外的各项试剂，配成无酶反应预混物。 PCR 反应体系表 试剂 50L 体系 100L 体系 试剂终浓度 10PCR 缓冲液（无 Mg2+） 5 10 1 MgCl2（25mmol/L） 5 10 2.5mmol/L dNTP(10mmol/L) 1 2 0.2mmol/L 100pmol/L 引物 F1 0.5 1 1pmol/L 100pmol/L 引物 R1 0.5 1 1pmol/L 灭菌双蒸水 32.75 65.5 Taq DNA 聚合酶（5U/L） 0.25 0.5 0.025U/L 待检 DNA 模板或对照 5 10 6.2.2 将无酶反应预混物按 44.75 L（50 L 体系）或 89.5 L (100 L 体系)预混液分装，保存于-20 （最多保存六个月） 。 在临用前， 根据所需的反应份数， 取出无酶反应预混物， 加入相应体积的 Taq DNA DB32/T 2957-2016 4 聚合酶，混匀，即成完全反应预混物。 6.2.3 将完全反应预混物按 1 份/支分装到无 DNA 聚合酶的 0.2mL PCR 待检管、阳性对照管、阴性对 照管、空白对照管中，分别在待检管、阳性对照管、阴性对照管、空白对照管中加入相应体积的样品待 检 DNA 模板、阳性对照 DNA、阴性对照 DNA、空白对照（50 L 体系加 5L，100 L 体系加 10 L） 。 6.2.4 将上述 PCR 管置于 PCR 扩增仪中。94 预变性 5 min； 95 变性 1 min、 55 退火 1 min、 72 延伸 1 min，40 次循环；72 延伸 10 min；4 保温。 6.3 琼脂糖凝胶电泳 6.3.1 用电泳缓冲液 TBE 配制 1.5% 的琼脂糖（加入相应量的核酸染料，加入量参见该核酸染料说明 书）凝胶，厚 0.5 cm 左右。 6.3.2 将平板放入水平电泳槽，电泳缓冲液刚好淹没胶面。 6.3.3 加样：10 L样品加入2 L样品缓冲液，混匀后加入样品孔。 6.3.4 电泳：5V/cm 电泳约 30 min 停止。 6.3.5 紫外灯下观察核酸带，并记录结果。 7 结果判断 7.1 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，当阳性对照出现一条 362 bp 的 DNA 条带，阴性对照和空白对照 没有扩增条带，待检样品出现一条与阳性对照一致的 DNA 条带（同样为 362 bp）则判定为鲤疱疹病毒 型阳性。 7.2 当 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测出现可疑条带时，应将待检样品的琼脂糖凝胶电泳检测条 带回收后进一步进行 DNA 测序。将所测序列与已知的鲤疱疹病毒型 DNA 聚合酶基因序列（参考附 录 B）比较，同源性达 95% 以上判定为鲤疱疹病毒型阳性。 DB32/T 2957-2016 5 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂及其配制 A.1 CTAB溶液 按 2% CTAB、1.4 mol/L NaCl、20.0 mmol/L，EDTA、20.0 mol/L Tris-HCl pH 7.5 配制。用前加巯 基乙醇至终浓度为 0.25%（配制时在 60 ml 水中顺序加入：8.19g NaCl，0.744g EDTA，1.21g Tris，约 0.25-0.3mL 浓 HCl, 使 pH=7.5-8.0，再加入 2g CTAB，完全溶解后加水至 100mL） 。 A.2 酚三氯甲烷异戊醇 用 1.0 mol/L pH 7.9 0.2 Tris 过饱和的重蒸酚、三氯甲烷和异戊醇按 25:24:1 的比例混合，密闭避光 保存。 A.3 三氯甲烷异戊醇 将三氯甲烷和异戊醇按 24:1 的比例混合，密闭避光保存。 A.4 TBE电泳缓冲液（5 浓缩液） Tris 54.0 g 硼酸 27.5 g 乙二胺四乙酸 2.922g 加水到 1000.0 mL 用 5.0 mol/L 的盐酸调至 pH 8.0。 A.5 6DNA上样缓冲液 溴酚蓝 100 mg，加双蒸水 5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖 25 g，加双蒸水溶解后移入溴酚 蓝溶液中，摇匀后定容至 50 mL。加入氢氧化钠（NaOH）溶液 1 滴，调至蓝色。 DB32/T 2957-2016 6 B B 附 录 B （资料性附录） 鲤科疱疹病毒型 DNA 聚合酶基因参考序列（GenBank 登录号：AY939863.1） 1 CCCAGCAACA TGTGCGACGG AGGCATCAGC CCAGAGTCCA TAGTGTCTAG GAGCGACCCG 61 TTCTGTCTCG AGTATGTCAG AAACTGCGTG CTGCTCGATT GGAAAAAGAT ACCGGCCGCC 121 AGTAACATGG AAGAGATCAA GGAATACCCG CACAGCGAAG ACCTGTACAC GATCCTGTGC 181 TACAAGAACC GAGAGGTCGG TTGGACTCGG TTTGTGACCT ACACCGCTTC CAGTCTGGGC 241 CACTACCTCT CTATGAGATC TCAGTACAAG AAACGCATCA AGACCGAGAA AGACGCGAGT 301 CTCAAGGCGT ACTATGATCA GATGCAGGGT GAGATGAAAG TATGCGCCAA CTCTCACTAC 361 GGCGTGAGCC AGAGTCTCTG TCAGCATCTG ACTACTTGGT CCGG