DB32∕T 2089-2012 梨品种DNA指纹图谱鉴别规范

ICS 65.020.20 B 31 备案号：33994-2012 江苏省地方标准 DB32 DB32/T 2089-2012 梨品种 DNA 指纹图谱鉴别规范 Rules of identification for DNA fingerprinting in pear cultivars 2012-05-08 发布 2012-08-08 实施 江苏省质量技术监督局 发布 DB32/T 2089-2012 前 言 为规范梨品种命名和保护新品种产权，促进梨苗木市场有序发展，特制定本标准。 本标准编写按 GB/T1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分 标准的结构与编写规则的规定编写。 本标准由南京农业大学提出。 本标准由南京农业大学负责起草和制定。 本标准主要起草人：吴俊、张绍铃、张明月、陶书田、齐开杰、黄小三、张虎平。 DB32/T 2089-2012 1 梨品种 DNA 指纹图谱鉴别规范 1 范围 本标准规定了梨品种登记、样本采集和处理、DNA 提取与检测、分子标记扩增与检测、谱带数据分 析、DNA 指纹图谱建立及品种鉴别。 本标准适用于梨品种资源的鉴定。 2 术语和定义 下列定义适用于本标准。 2.1 DNA 指纹图谱 DNA Fingerprint 指通过DNA检测技术，获得由多个位点上的等位基因组成的长度不等的特征图纹，这种图纹极少有 两个完全相同，故称为“DNA指纹“，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。 2.2 SSR 标记 Simple Sequences Repeat marker 指以少数几个核苷酸(15)为单位多次串联重复的 DNA 序列,由于基本单元重复次数的不同而形成 SSR 座位的多态性。 2.3 SRAP 标记 Sequence-related amplified polymorphism marker 指相关序列扩增多态性，该标记对 DNA 的内含子、启动子区域进行特异扩增，因个体不同以及物种 的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。 3 品种登记 记录待鉴定品种资源的来源，并对该品种系谱关系的背景进行了解和登记。 4 仪器设备 PCR 仪、核酸定量分析仪（Nanodrop）、水平电泳仪、凝胶成像仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪。 5 材料采集与处理 5.1 叶片采集 选取生长健康良好的梨树幼嫩叶片，要求发育良好，而尚未完全展开，一般在枝的生长点附近。注 意要选取完整、无病虫害或者损伤的叶片。 5.2 样品处理 DB32/T 2089-2012 2 将采集的样品放在冰盒中，保持新鲜状态，并及时带回实验室。将所采集的样品叶片经过水清洗 后，擦干，可直接用于 DNA 提取。如不立即使用，也可将叶片经液氮速冻后，-70冰箱保存备用。 6 DNA 提取与检测 6.1 取样 微量提取，可称取 0.20.5g 幼嫩叶片；也可按实际检测需求量，增加叶片量，但提取液也按相应 比例增加。 6.2 DNA 提取方法 采用 CTAB 法提取梨叶片的基因组 DNA，试验步骤如下： 6.2.1 样品研磨 取适量叶片加入快速液氮研磨至粉末状，在样品解冻前，迅速转移至 2ml 离心管中，并加 DNA 提取 液 3ml，上下颠倒混匀后，放入 65恒温水浴中提取，水浴时间 30-50min，期间每隔 8-10 分钟上下轻 轻颠倒混匀样品。 6.2.2 样品的抽提 水浴后取出样品，在 20下，12000rpm 离心 15min，并将上清液转移到新离心管中；等体积加入 氯仿/异戊醇(24：1)抽提，颠倒混匀后摇床平和摇动 15 分钟，再次 12000rpm 离心 10min；将离心管取 出后，小心吸取上清液移至新离心管中，再加入氯仿/异戊醇(24：1)抽提；如此反复 23 次(可室温下 操作)。 6.2.3 DNA 的沉淀 将最终抽提的液相移至新的离心管中，并加入1/10体积NaAc (3M，pH5.2)，混匀后，加入2倍体积的无 水乙醇 (-20)，缓慢颠倒混匀，并于-20冰箱中放置30min 沉淀DNA； 之后将样品取出，于4 12000rpm 离心10min。小心倒去上清液，DNA沉淀则用1ml 70乙醇溶液清洗， 12000rpm离心5min，倒去乙醇溶液，如 此反复2次后凉风吹干DNA。 6.2.4 RNA 消化 待管内液体挥发干并无乙醇味时，用 500 l TE 缓冲液(pH8.0)溶解 DNA，加入 2 l RNaseA(10mg/ml) 降解 RNA，37水浴保温 60min；再用等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提，4 12000rpm 离心 10min， 小心吸取上清液到新的 1.5ml Eppendorf 管中，进行 DNA 的沉淀，步骤同第一次 DNA 的沉淀。 将吹干的样品 DNA，加入 5-100 l 灭菌纯水溶解 DNA，-20保存备用。 6.3 DNA 检测 取 3 l DNA 样品在 1.0Agarose 凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外检测质量，基因组 DNA 主带清 洗，大小在 2000bp 以上，无 RNA 和蛋白杂质干扰。电泳结果在凝胶成像系统下拍照记录。 同时可利用核酸定量分析仪辅助检测，A260/A280 值在 1.82.0，则为纯净的 DNA。利用 Nanodrop 微量检测样品的浓度，根据浓度的实际度数，按 20ng. L -1稀释至使用浓度。 7 DNA 标记的扩增和检测 7.1 方法选择 在构建梨指纹图谱过程中， 根据不同的种质资源选择合适的分子标记方法， 目前在果树上广泛应用、 且可靠性强的分子标记主要是 SSR 和 SRAP。SSR 标记根据保守区域进行扩增，共显性好，对于 DNA 纯度 要求低；SRAP 标记多态性高，操作简单，成本相对较低。使用时可以根据实际情况，选择其中的一种 分子标记类型。 DB32/T 2089-2012 3 7.2 SSR 检测体系 SSR 标记检测体系：取模板 DNA 50 ng，dNTPs 0.2 mmolL -1，Mg2+ 2.5 mmolL-1，上下游引物 各 0.3 molL -1，Taq 酶 1.0 U，反应总体积 20 L。 反应程序为：94预变性 3 min， 循环在 94 40s， 55 50s，72 1min 条件下运行 39 次，随后 72延伸 10min，最后 1010min。 7.3 SRAP 检测体系 SRAP 标记检测体系：取模板 DNA 30 ng，dNTPs 0.2 mmolL -1，Mg2+ 2.0 mmolL-1，上下游引物 各 0.2 molL -1，Taq 酶 1.0 U，反应总体积 20 L。反应程序为 94预变性 5 min，反应前 5 个循环 在 941 min，351 min，721 min 条件下运行；随后的 30 个循环退火温度提高到 50，最后 72 延伸 10 min。 7.4 产物的检测 扩增产物利用 2%琼脂糖或 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳谱带在凝胶成像系统下观察统计。 8 指纹图谱的分析 选择 20 对扩增稳定的标准引物，利用标准分析体系，对所有品种的遗传多态性位点进行分析和鉴 定，并获得扩增谱带的记录信息。在不同的位点上将有条带记录为1，无条带记录为0，并建立 所有数据的相似矩阵。 应用数据统计对获得的指纹进行相似