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ICS 65.020.20 B 31 备案号:33994-2012 江苏省地方标准 DB32 DB32/T 2089-2012 梨品种 DNA 指纹图谱鉴别规范 Rules of identification for DNA fingerprinting in pear cultivars 2012-05-08 发布 2012-08-08 实施 江苏省质量技术监督局 发布 DB32/T 2089-2012 前 言 为规范梨品种命名和保护新品种产权,促进梨苗木市场有序发展,特制定本标准。 本标准编写按 GB/T1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分 标准的结构与编写规则的规定编写。 本标准由南京农业大学提出。 本标准由南京农业大学负责起草和制定。 本标准主要起草人:吴俊、张绍铃、张明月、陶书田、齐开杰、黄小三、张虎平。 DB32/T 2089-2012 1 梨品种 DNA 指纹图谱鉴别规范 1 范围 本标准规定了梨品种登记、样本采集和处理、DNA 提取与检测、分子标记扩增与检测、谱带数据分 析、DNA 指纹图谱建立及品种鉴别。 本标准适用于梨品种资源的鉴定。 2 术语和定义 下列定义适用于本标准。 2.1 DNA 指纹图谱 DNA Fingerprint 指通过DNA检测技术,获得由多个位点上的等位基因组成的长度不等的特征图纹,这种图纹极少有 两个完全相同,故称为“DNA指纹“,意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。 2.2 SSR 标记 Simple Sequences Repeat marker 指以少数几个核苷酸(15)为单位多次串联重复的 DNA 序列,由于基本单元重复次数的不同而形成 SSR 座位的多态性。 2.3 SRAP 标记 Sequence-related amplified polymorphism marker 指相关序列扩增多态性,该标记对 DNA 的内含子、启动子区域进行特异扩增,因个体不同以及物种 的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。 3 品种登记 记录待鉴定品种资源的来源,并对该品种系谱关系的背景进行了解和登记。 4 仪器设备 PCR 仪、核酸定量分析仪(Nanodrop)、水平电泳仪、凝胶成像仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪。 5 材料采集与处理 5.1 叶片采集 选取生长健康良好的梨树幼嫩叶片,要求发育良好,而尚未完全展开,一般在枝的生长点附近。注 意要选取完整、无病虫害或者损伤的叶片。 5.2 样品处理 DB32/T 2089-2012 2 将采集的样品放在冰盒中,保持新鲜状态,并及时带回实验室。将所采集的样品叶片经过水清洗 后,擦干,可直接用于 DNA 提取。如不立即使用,也可将叶片经液氮速冻后,-70冰箱保存备用。 6 DNA 提取与检测 6.1 取样 微量提取,可称取 0.20.5g 幼嫩叶片;也可按实际检测需求量,增加叶片量,但提取液也按相应 比例增加。 6.2 DNA 提取方法 采用 CTAB 法提取梨叶片的基因组 DNA,试验步骤如下: 6.2.1 样品研磨 取适量叶片加入快速液氮研磨至粉末状,在样品解冻前,迅速转移至 2ml 离心管中,并加 DNA 提取 液 3ml,上下颠倒混匀后,放入 65恒温水浴中提取,水浴时间 30-50min,期间每隔 8-10 分钟上下轻 轻颠倒混匀样品。 6.2.2 样品的抽提 水浴后取出样品,在 20下,12000rpm 离心 15min,并将上清液转移到新离心管中;等体积加入 氯仿/异戊醇(24:1)抽提,颠倒混匀后摇床平和摇动 15 分钟,再次 12000rpm 离心 10min;将离心管取 出后,小心吸取上清液移至新离心管中,再加入氯仿/异戊醇(24:1)抽提;如此反复 23 次(可室温下 操作)。 6.2.3 DNA 的沉淀 将最终抽提的液相移至新的离心管中,并加入1/10体积NaAc (3M,pH5.2),混匀后,加入2倍体积的无 水乙醇 (-20),缓慢颠倒混匀,并于-20冰箱中放置30min 沉淀DNA; 之后将样品取出,于4 12000rpm 离心10min。小心倒去上清液,DNA沉淀则用1ml 70乙醇溶液清洗, 12000rpm离心5min,倒去乙醇溶液,如 此反复2次后凉风吹干DNA。 6.2.4 RNA 消化 待管内液体挥发干并无乙醇味时,用 500 l TE 缓冲液(pH8.0)溶解 DNA,加入 2 l RNaseA(10mg/ml) 降解 RNA,37水浴保温 60min;再用等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提,4 12000rpm 离心 10min, 小心吸取上清液到新的 1.5ml Eppendorf 管中,进行 DNA 的沉淀,步骤同第一次 DNA 的沉淀。 将吹干的样品 DNA,加入 5-100 l 灭菌纯水溶解 DNA,-20保存备用。 6.3 DNA 检测 取 3 l DNA 样品在 1.0Agarose 凝胶上电泳,溴化乙锭染色,紫外检测质量,基因组 DNA 主带清 洗,大小在 2000bp 以上,无 RNA 和蛋白杂质干扰。电泳结果在凝胶成像系统下拍照记录。 同时可利用核酸定量分析仪辅助检测,A260/A280 值在 1.82.0,则为纯净的 DNA。利用 Nanodrop 微量检测样品的浓度,根据浓度的实际度数,按 20ng. L -1稀释至使用浓度。 7 DNA 标记的扩增和检测 7.1 方法选择 在构建梨指纹图谱过程中, 根据不同的种质资源选择合适的分子标记方法, 目前在果树上广泛应用、 且可靠性强的分子标记主要是 SSR 和 SRAP。SSR 标记根据保守区域进行扩增,共显性好,对于 DNA 纯度 要求低;SRAP 标记多态性高,操作简单,成本相对较低。使用时可以根据实际情况,选择其中的一种 分子标记类型。 DB32/T 2089-2012 3 7.2 SSR 检测体系 SSR 标记检测体系:取模板 DNA 50 ng,dNTPs 0.2 mmolL -1,Mg2+ 2.5 mmolL-1,上下游引物 各 0.3 molL -1,Taq 酶 1.0 U,反应总体积 20 L。 反应程序为:94预变性 3 min, 循环在 94 40s, 55 50s,72 1min 条件下运行 39 次,随后 72延伸 10min,最后 1010min。 7.3 SRAP 检测体系 SRAP 标记检测体系:取模板 DNA 30 ng,dNTPs 0.2 mmolL -1,Mg2+ 2.0 mmolL-1,上下游引物 各 0.2 molL -1,Taq 酶 1.0 U,反应总体积 20 L。反应程序为 94预变性 5 min,反应前 5 个循环 在 941 min,351 min,721 min 条件下运行;随后的 30 个循环退火温度提高到 50,最后 72 延伸 10 min。 7.4 产物的检测 扩增产物利用 2%琼脂糖或 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电泳谱带在凝胶成像系统下观察统计。 8 指纹图谱的分析 选择 20 对扩增稳定的标准引物,利用标准分析体系,对所有品种的遗传多态性位点进行分析和鉴 定,并获得扩增谱带的记录信息。在不同的位点上将有条带记录为1,无条带记录为0,并建立 所有数据的相似矩阵。 应用数据统计对获得的指纹进行相似

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