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酶工程期末考核论文摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术) 及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。下面从传统固定化技术、传统固定化技术的改进、新型固定化技术等三个方面来概述一下酶固定化方法的研究进展：一、传统固定化技术吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为物理吸附法,简称吸附法。吸附法包括物理吸附和离子结合法。工艺简便和条件温和是该方法显著的优点,可供选择的载体涉及天然或合成的无机与有机高分子材料,有时酶的纯化与固定化也可同时实现。因酶分子与载体之间的共价结合而呈现良好的稳定性及重复使用性,共价结合法是目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。物理吸附法常用的吸附剂有活性炭.氧化铝.硅藻土.多孔陶瓷.多孔玻璃.硅胶.羟基磷灰石等。吸附法制备固定化酶,操作简便,条件温和,不会引起酶的变性失活,载体价廉易得,而且可反复使用。但酶与载体的结合不牢易于脱落,所以它的使用受到一定的限制。但是,吸附法中由离子键、氢键、偶极键及疏水键固定的酶易受反应介质的pH、离子强度等的影响而从载体上脱落。包埋法将酶或酶菌体包埋在多孔载体中使酶固定化的方法称为包埋法。包埋法分为网格型和微囊型两类,其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。包埋法专用的载体主要有:明胶、 聚酰胺、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠、火棉胶等。包埋法根据载体材料和方法的不同,可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。凝胶包埋法是将酶或酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中,制成一定形状的固定化酶的方法。微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中,制成微胶囊固定化酶的方法。但是,包埋法中高分子凝胶或半透膜的分子尺寸选择性不利于大分子底物与产物的扩散。结合法选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起而制成固定化酶的方法,称为结合法。根据酶与载体结合的化学键的不同,结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。离子键结合法通用的载体是各种离子交换剂,用离子键结合法制备的固定化酶,操作简便,活力损失少,但是结合不牢固,在pH 值和离子强度等条件变化时,酶容易脱落。共价键结合法常用的载体有:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素、 氨基酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物等。用共价结合法制备的固定化酶,结合牢固,酶不易脱落,可连续使用相当长的时间。但载体的活化操作比较复杂,因为结合法有较激烈的反应而使酶活力损失较大。结合法制备固定化酶所用的高分子载体带有强的反应基团,如重氮盐、醛、酰氯、活性酯等活性基团,以保证酶的固化过程得以在比较温和的条件下进行。常用的载体有重氮化聚苯乙烯、缩醛类聚合物、聚酰胺等。近年来,固定化酶的载体研究发展很快,已产生几大类别的载体。可分为有机高分子载体、无机载体和复合载体。在有机高分子载体中,天然高分子凝胶载体一般无毒性,传质性能好,但存在强度较低、在厌氧条件下容易被细菌分解和寿命短等问题。常见的有琼脂,海藻酸钠,明胶等。近年来新兴起的新载体是甲壳素和壳聚糖。而合成高分子凝胶载体一般强度较大,但传质性能较差,会对酶的活性产生影响。常见的载体有聚丙烯酰胺和聚乙烯醇等。近年来,人们又合成出许多具有优良性能的新载体, 如: 聚乙烯醇冷冻胶,聚乙烯醇氧化物,无孔聚苯乙烯/ 聚苯乙烯磺酸钠PS/ PNaSS 微球载体,PF 凝胶载体(对苯二酚和甲醛聚合物) ,球状纤维素单宁树脂,多孔醋酸纤维素球形载体等。以无机材料为固定化酶载体具有一些有机材料不具备的特点,如稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性、不易被微生物分解等特性。在这方面,美国的UOP 公司以氧化铝为载体,德国的Milss 公司以二氧化硅为载体制备固定化酶取得了显著的成效。复合载体材料是将有机材料和无机材料复合组成,以改进材料的性能。磁性高分子微球是近年来研究的较多的一类复合载体材料。_交联法借助功能试剂使酶分子之间发生交联作用而制成固定化酶的方法,称为交联法。交联法亦称架桥法,游离酶的氨基酸残基与双官能团或多功能团交联剂反应而被固定化可得酶蛋白单位浓度较高的固定化酶。常用的双功能试剂有戊二醛.己二胺.顺丁烯二酸酐.双偶氮苯等,其中应用最广泛的是戊二醛。用交联法制备的固定化酶结合牢固,可长时间使用。但是,由于交联反应较激烈,酶活力损失较大。实际使用时,往往与其他固定化方法联合使用,如将酶先经凝胶包埋后,再经交联等。这种采用两种或多种方法进行固定化的技术,称为双重或多重固定化法,用此法制备的固定化酶活性高,机械强度好。热处理法将含酶细胞在一定的温度下加热一段时间,使酶固定在菌体内的方法,称为热固定化法。热固定化法只适合于那些热稳定性较好的酶。在加热处理时,一定要掌握好加热温度和时间,以免引起酶的变性失活。诚然,前述各种酶固定化方法有各自的优点和不足,但固定化酶也存在着一些共同的缺点：对于一些可作用于大分子底物,也可作用于小分子底物的酶而言,经固定化后,由于受到载体空间位阻作用的影响,大分子底物难于接近酶分子,从而使其催化反应速度大大降低,而小分子底物的反应速度则不受影响;酶固定化的过程中,失活的酶量较大;载体的带电性质对固定化酶的最适pH 值有明显的影响:一般来说,带负电的载体制备的固定化酶,其最适pH 值比游离态的高;带正电的比游离态的低;电中性的不变化。以上是在制备和应用固定化酶的时候应该特别注意的。这些不足之处限制了固定化酶的广泛应用,成为亟待解决的主要问题。因此,开发简便、温和、适用的固定化方法,设计合成性能优异且可控的载体,以及应用工艺的优化研究等使固定化酶及其酶促反应的研究至今方兴未艾,仍是目前研究热点之一。二、传统固定化技术的改进保持各种传统固定化方法的优点并改进其不足一直是固定化酶方面研究的重要内容。将酶吸附于离子交换树脂上后,再用多官能基化合物交联可提高固定化胰蛋白酶的活性及稳定性。在有硫酸铵或水溶性聚乙二醇存在时,会大幅度提高疏水性载体对酶的吸附率;在底物反应液中加入维生素C时,可提高固定化葡萄糖氧化酶的使用性能;调节pH 值,则能使酶固定化及固定化酶处于一个最佳的微环境中。戊二醛类双官能团偶联剂的一端保护后活化载体,再脱保护并固定化酶时可大幅度提高酶活力的回收率。这些研究结果表明,通过改进传统固定化方法而改善固定化酶的性能是可行的。载体的结构与性能研究是传统固定化技术改进的重要方面。考虑到生物大分子酶及某些大分子底物与产物的传质和扩散的需要,李彦锋等采用线型聚合物致孔法合成了球状特大孔丙烯腈与醋酸乙烯酯的共聚物(MR - AV 树脂) ,再转化为聚丙烯酰胺肟- 聚乙烯醇载体固定化嗜热菌蛋白酶。结果表明,固定化酶活性随载体孔径的增大而提高;MR -AV 树脂与含水乙二胺反应生成聚N - 氨乙基丙烯酰胺- 聚乙烯醇载体时亲水性进一步增强,其固定化前列腺素合成酶及木瓜蛋白酶时皆可获得良好结果。增加载体活性侧基的空间悬臂(Spacer) 的长度有利于减少空间阻碍而提高载酶量及固定化酶活性,如用不同链长的二元胺活化聚丙烯酸甲酯及聚氯乙烯大孔球状载体时,固定化酶的活力则随活化侧基链长的增加而提高。膜载体具有组装连续运转生物反应器的优势,如- 半乳糖甙酶被聚甲基丙烯酸羟乙酯膜固定化后,可高效催化乳糖水解且连续运行30h 的酶量损失 52 %、操作半衰期达到250 h ,球形交联状壳聚糖固定化- 淀粉酶的比活力达820 U/ g、具有良好的稳定性。Tiller 等用对苯二胺活化甲基苯磺酸纤维素酯制备的超分子结构载体在固定化葡萄糖氧化酶、过氧化物酶及乳酸酯氧化酶时,固定化酶的比活力可高达660 U/ g、且具有良好的稳定性及分析应答性。天然载体既具有适宜的生物相容性及亲水性,又多为可再生资源,故应予以足够重视。壳聚糖也已被广泛应用于固定化酶的研究,姜梅等研究了以壳聚糖膜为载体、戊二醛为交联剂的固定化葡萄糖氧化酶的特性。结果表明:固定化酶的Km 值为12116 mmol/ L ,溶液酶的Km 值为20186 mmol/ L ;固定化酶比溶液酶更耐热,且贮藏稳定性及操作稳定性也有所提高;固定化酶重复使用率较高。三、新型固定化技术运用当代高新技术设计合成新型载体以及两者的有机结合是引人注目的研究动向。利用超声波使高分子主链均裂产生自由引发功能性单体,再聚合成嵌段共聚物载体固定化酶的结果表明,借助现代技术可使一般性聚合物经功能化改性成为新的酶固定化载体。1.磁性载体磁性体Fe3O4与聚苯乙烯、含醛基聚合物一起溶解混合后,再除去溶剂可获得磁性载体,其固定化葡萄糖氧化酶在适宜条件下的酶活力回收可高达70 % 。磁性载体固定化酶由于Fe3O4的磁响应性从而能借助外部磁场简便地回收,已引起人们的极大研究兴趣。其中,磁性高分子微球是近二十年来发展起来的一种新型功能高分子材料。磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物(如铁、钴、镍及其氧化物) 的超细粉末,而具有磁响应性的高分子微球。近年来,磁性高分子微球也用于固定化酶的研究。与非磁性材料相比,磁性高分子微球作为固定化酶的载体具有以下优点: . 有利于固定化酶从反应体系中分离和回收,操作简便,对于双酶反应体系,当一种酶的失活较快时,就可以用磁性材料来固载另一种酶,回收后反复使用,降低成本; . 磁性载体固定化酶放入磁场稳定的流动床反应器中,可以减少持续反应体系中的操作,适合于大规模连续化操作; . 利利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向,替代传统的机械搅拌方式,提高固定化酶的催化效率。磁性高分子微球的合成方法主要有: . 利用天然高分子材料包埋磁性微粒,可以得到纳米级的磁性微球; . 在磁流体的存在下进行聚合反应,得到微米级的磁性微球。Munkd 制备了纤维素等三种磁性高分了微球,用于凝乳化蛋白酶的固定化,研究了不同壳层、不同磁核及粒径对酶的活性及固定量的影响; Iman 将PS/ Fe3O4微球用于尿素酶的固定化;邱广亮等采用乳化复合技术制得磁性淀粉复合微球,并以此微球为载体,采用溴化氰共价结合法、戊二醛交联法、物理吸附法固定化- 乙酞乳酸脱羧酶(ALDC) ,将固定化ALDC 用于啤酒发酵具有明显降低双乙酰的效果,而且由于它具有磁性,可通过施加外磁场方便简单地与酒液分离,而不影响啤酒风味,缩短生产周期,大大降低成本。2.导电载体导电聚合物(conducting polymers) 是固定酶的另一种新型载体材料,它具有重量轻,以及易于表面涂覆的特性,而在导电性能方面则具有半导体、金属乃至超导体等优良特性。导电聚合物作为酶固定化载体时特别有利于酶电极类生物传感器的制备。在这方面,研究较多的是葡萄糖氧化酶,应用最广泛的是聚吡咯,应用目标主要是生物医学检测。射线引发丙烯醛与聚乙烯膜接枝聚合后,活性醛基可共价固定化葡萄糖氧化酶并呈现良好结果;Co60辐照冰冻态水溶性单体与酶的水溶液混合体时将使单体聚合与酶固定化同步完成,其回到常温时因冰融化而形成的多孔结构非常有利于底物与产物的扩散、并可提高酶的活性。3.经等离子技术改性载体近年来国内外许多研究人员还利用等离子体技术对一些力学强度较好,但缺少活性基团(如羟基、羧基、羰基、氨基等官能团) 的材料进行处理,以得到更好的新型固定化酶载体。等离子体活化处理聚丙烯膜接枝丙烯酸后可用于固定化胰蛋白酶;而等离子体引发丙烯酰胺聚合包埋固定化的葡萄糖氧化酶用于麦芽糖的酶促转化时,运转20 天也未发现酶活性损失的现象,显示出优良的操作稳定性。等离子体技术对聚合物材料表面进行改性有许多优点: 利用等离子体反应的特点赋予改性的表面各种优异的性能; 表面改性层厚度极薄(从几到数百纳米) ;可制得超薄、均匀、连续和无孔的高功能薄膜,且该膜在底基上有强的粘着力,便于各种载体的表面成膜。利用等离子体处理的聚合物作为载体进行固定化酶,可使载体单位面积固定化酶的量增多,而且酶结合牢固。在固定化酶中,处理载体材料使用的等离子体处理方法主要有:等离子体表面处理、等离子体接枝共聚和等离子体气相沉积技术。4.光敏/温敏载体此外,光敏性单体聚合包理固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶时,由于条件温和可获得酶活力较高、稳定性良好的固定化酶。N -异丙基丙烯酰胺与丙烯酰胺及其衍生物共聚可得到温敏性水凝胶载体,其固定化嗜热菌蛋白酶时可实现均相催化与异相分离的统一,温敏载体的较低临界液相温度(LCST) 可通过改变N - 取代丙烯酰胺的结构予以调整。温敏载体是环境敏感性载体的一种,类似的酸敏性载体固定化酶时亦可达到良好效果,这是一类设计新颖、应用独特的新型固定化技术。Parthasarathy 等还用模板聚合法制备了一种阵列式聚吡咯微囊固定化酶,具有酶活力高、稳定性良好的特点,可作为生物传感器和生物反应器而在水及有机介质中应用,其研究思路颇具启迪性。但是，在载体固定化酶中，由于聚合物载体的存在而大大降低了酶与大分子底物的结合容量和反应能力，而无载体固定化酶具有较高的催化剂比表面；较高的酶催化活性，成本低；受底物扩散限制的影响较小；可提高酶在极端条件下及有机溶剂中和蛋白酶中的操作稳定性等优点。因此，有关无载体固定化酶技术逐步引起了多国外研究者的关注。1交联溶解酶交联溶解酶(CrossLinked Qissolued Enzyme，CLEs)是通过交联剂对酶分子直接交联而获得，也是操作最简单的一种方法。到目前为止，已有20多种酶通过交联直接形成CLEs或先吸附在惰性膜载体上再经交联形成有载体的CLEs形式。但是这种采用外加载体的方法会明显地降低单位体积的酶活性水平，所以其工业应用范围受到限制。 2交联酶晶体交联酶晶体(CrossLinked Enzyme Crystals，CLECs)是近年来发展起来的新型酶晶体催化剂，是酶结晶技术和化学交联技术的结合。早在1964年Quiocho就对羧肽酶A晶体交联得到活性较高的不溶性CLECs，活性比游离酶晶体高了3070，而且酶晶体在极端环境条件下如极端温度和pH值、有机溶剂和蛋白酶中的稳定性得到有效提高。Rose A等将假丝酵母玫瑰脂肪酶(cRL)晶体经交联后在有机溶剂中进行羧酸和乙醇的手性合成。David等将纯化的羟腈裂解酶(HNL)制成交联晶体酶催化剂用于活性腈醇的合成。IvanildoLuiz利用CLECs技术将葡萄糖氧化酶制成葡萄糖生物传感器。Jegan Roy J等通过交联漆酶晶体制成生物传感器。目前，已经有lO多种CLECs实现了商品化。3交联酶聚集体交联酶聚合体(CrossLinked Enzyme Aggregate，CLEAs)酶分子经沉淀形成不溶性酶聚集体再经交联反应形成。各种文献表明，各种酶的CLEAs在适当的反应条件下都会显示出较好的催化活性和反应稳定性。董晓毅等研究了脲酶CLEAs的热稳定性、贮存稳定性和对抗蛋白水解酶的能力，结果表明CLEAs均显示出比游离酶更高的稳定性。LopezSerrano P等在脂肪酶的CLEAs的制备中添加了SDS、Tritonx一100、冠醚等，结果获得了高活性的CLEAs。Linqin Cao等将青霉素G酰化酶的CLEAs与该酶的商品固定化酶的活性相对比，结果发现在相同反应条件下，该酶的CLEAs的活性损失30，而商品固定化酶的活性降为零。因此，上述文献表明，各种酶的CLEAs在适当的反应条件下都会显示出较好的催化活性和反应稳定性。4交联喷雾干燥酶喷雾干燥酶颗粒尽管可以获得较好的酶活，但直到今天还未开发出理想的交联喷雾干燥酶(Cross-Linked Sprag-dried Enzyme，CLSDs)。主要原因是喷雾干燥过程往往是可逆的，而使酶变得无效。与CLECs、CLEAs或有载体固定化酶相比，CLSDs的操作性相对较差，故而其工业应用受到限制。由于无载体固定化酶通常要比有载体固定化酶的活性高101000倍，且对热和有机溶剂的稳定性明显高于有载体固定化酶；同时无载体同定化酶更有利于在反应器中进行，而且可填充更多的无载体酶，可以弥补在重复使用过程中的酶活损失，而不延长反应时间，与有载体固定化酶相比，无载体酶只占到反应器容积的1020。目前，已有众多的无载体酶相继得到开发，应用于有机合成、手性分子的拆分、生物传感器、生物分离、洗涤剂及其他蛋白质领域。同样的，传统的酶固定化过程中，导致酶的剩余活力降低的因素主要有固定过程中的化学损伤和酶分子不适合的空间取向。因此定向固定化酶技术将成为今后固定化酶研究的热点。1共价固定法酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离活性位点的特定稀有基团(如巯基)进行反应，使该基团与载体上另一基团共价交联来同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以达到控制其空间取向的目的。Collioud等化学合成一个异双功能试剂(N-m一3一(trifluoromethyl)diazirin-3-ylphenyl一4一maleimidobutyr amide)，他们利用这种双功能试剂成功地实现了氨基酸、合成肽和抗体Fab片段的定向固定。Stein等通过衍生全氟叠氮基苯疏水交联共价固定一种脂链细胞蛋白，取得了一致的空间取向。固定后的蛋白质分子结合牢固、稳定性佳，不能被离子或非离子去污剂清除。2氨基酸置换法利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸分子，通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。Huang等通过定点突变在枯草蛋白酶(subtil2isin)分子表面远离活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)残基。经蛋白质空间折叠后暴露出Cys，然后利用Cys残基上的巯基固定枯草蛋白酶分子，取得了较好的固定效果，固定效率和固定后催化活性均有很大提高。3抗体耦联法大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分子中很多可供偶联用的官能团可以通过赖氨酸的-氨基或末端氨基、天冬氨酸的-氨基、谷氨酸的-氨基或末端羧基进行一般性的偶联。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠来定向固定抗体酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗体酶Fab片段保持了很好的催化活性。抗体分子Fc区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体上的氨基通过缩合反应可实现定向固定。醛基若与载体上的酰肼通过腙键结合实现抗体分子的定向固定，与随机固定相比，固定后抗体稳定性提高的同时免疫吸附活性也提高了3倍。4生物素-亲和素亲合法生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微(00001)的中性小分子辅酶。亲和素是一个含有四个相同亚基的四聚体，每个亚基均含一个生物素结合位点(解离常数105molL) 。生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素有高专一性的、极强的亲和力。这种特性使其成为免疫分析、受体研究、免疫组织化学、基因工程和蛋白质分离等领域中独特有力的工具。Min等将生物素羧化载体蛋白、片段分别融合在荧光素酶和氧化还原酶的N末端，然后将这两个融合蛋白定向固定在亲和素包被的琼脂颗粒上。荧光活性提高了8倍，固定化酶的稳定性和固定效率均大大提高。5疏水定向固定法细胞粘着分子(cell adhesion molecules，CAMs)是介导细胞-细胞、细胞-底物粘着、细胞发育和细胞信号发生的分子。细胞粘着分子和其它细胞表面分子通常通过疏水作用固定在脂质膜上，磷脂锚定是常选择的方式。接触位点A糖蛋白是调节发育的细胞粘着分子，产生于多细胞发生早期，通过形成高亲和、EDTA稳定的接触位点介导细胞粘着。接触位点A糖蛋白可通过神经酰胺疏水同定在细胞表面。疏水定向固定可保持蛋白质分子结构、生理活性及天然构象。这种通过疏水作用的固定，固定的效率高，固定为非共价，而且固定过程可逆，用去污剂可终止或消除同定应。Stein等用庚基胺修饰羧甲基葡聚糖载体表面的羧基来疏水固定接触位点A糖蛋白分子，成功地控制了固定位点的空间取向。用mAb7l特异结合来检测csA的活性状态，mAb71结合良好，而mAb353则不能结合。随着酶固定化技术的发展,固定化酶的应用范围不断扩大。目前它已应用于化学及化工领域、食品、临床医药、生物传感器及环境废水处理等方面。定化酶在化学及化工领域中的应用研究水解蛋白酶固定化后可用于肽及有机化合物的酶促合成,如硅藻土固定化木瓜蛋白酶可在乙酸乙酯介质中催化合成Leu - 脑啡肽前体Boc - Phe -Leu - OMe、产率高达90 %以上;固定化嗜热菌蛋白酶可高产率及专一性催化合成高甜度低热量的二肽甜味剂Aspartame 的前体Z - L - Asp - L - Phe -OMe 、并可同时实现天冬甜精的生物合成与DL -苯丙氨酸甲酯的光学拆分。通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备、且具有潜在的应用前景。脂肪酶既能催化天然油脂及酯类的水解,也能在有机介质中催化酯的合成、交换、氨解及肽合成而具有重要工业价值, 故固定化脂肪酶的研究颇受重视。固定化酶在化学及化工领域中的应用研究也是人们感兴趣的课题,通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备,且具有潜在的应用前景。在食品行业的应用固定化氨基酰化酶是世界上第一种用于工业化生产的固定化酶。1969 年,日本就将它用于拆分DL - 氨基酸,连续生产L - 氨基酸,其生产成本仅为流离酶生产成本的60 %。淀粉酶及糖化酶能催化淀粉转化为葡萄糖,是较早研究并仍在研究的固定化生物催化剂。将糖化型淀粉酶吸附在二乙氨乙基纤维素上,以此固定化酶为催化剂并悬浮在30 %的淀粉溶液中,在55 下搅拌水解,几乎可定量连续地得到葡萄糖溶液。淀粉酶及糖化酶能催化淀粉转化为葡萄糖,是较早研究并仍在研究的固定化生物催化剂,- 淀粉酶与糖化酶的共固定化实现了淀粉的液化与糖化两步反应的合二为一、淀粉一步水解为葡萄糖且操作半衰期可达920 h ,而当- 淀粉酶、糖化酶及葡萄糖异构酶共固定化时又可使淀粉转化果糖。不仅如此,酶尚可与细胞等其它生物分子构成共固定系统。两种或多种有联系的酶共固定化构成更为复杂的生物转化系统、却又能将复杂的生物反应过程简单化,这是一种颇具新意的研究思路。其次,淀粉及纤维素是地球上贮量丰富的可再生资源,通过固定化酶催化水解实现其高附加值转化符合社会经济可持续发展的时代要求,如固定化蜗牛酶就对纤维素的降解具有良好的酶催化活性。固定化葡萄糖异构酶是现在世界上生产规模最大的一种固定化酶,1973 年就已用于果葡萄浆的连续工业化生产,其固定化方法普遍采用热处理固定化法。1973 年,日本用聚丙烯酸酰胺为载体,用包埋法制成固定化天冬氨酸酶,用于工业化生产。固定化乳糖酶和固定化天门冬氨酸- - 脱羧酶也分别于1977 年和1982 年用于工业化生产。在临床医药及生物传感器方面的应用琼脂糖固定化牛胰核糖核酸酶能很好地催化合成重要的寡核苷酸。纤维素固定化胰蛋白酶的活力回收达57. 15 %、酶解半衰期达480 h 且能制备出符合质量标准的医用玻璃酸。前列腺素衍生物是20世纪重要的药物发现之一,用大孔聚N 氨乙基丙烯酰胺固定化前列腺素合成酶并酶促合成前列腺素衍生物E1 时,固定化酶显示出良好的贮存稳定性及活性。壳聚糖固定化胰蛋白酶制备具有多种药用价值的高比活抑肽酶已显示出工业化应用前景,微囊固定化过氧化氢酶具有良好的酶活性及稳定性,将在临床检测及卫生防疫方面具有广泛用途。药用酶可通过固定化提高稳定性及缓释性、并可除去免疫原性,甚至葡聚糖磁性毫微粒固定化L - 天冬酰胺酶具有通过血液注射治疗急性淋巴白血病的医用前景。这些研究将为现代医学的发展提供强有力支持。酶固定化技术的发展使生物传感器应运而生,如利用活蚕液状丝素蛋白的变性作用制备的葡萄糖氧化酶传感器具有酶活性损失小、稳定性高、响应速率快及使用寿命长等优点。葡萄糖氧化酶被固定化在纳米微带金电极上可得能用于活体检测的微型生物传感器; 聚吡咯固定化脲酶传感器在脲浓度为(510 10 - 5110 10 - 2) mol 范围内具有良好的电化学响应性。自动化及连续化快速检测是生物传感器的临床检测特点,但酶电极的制备较复杂且需专用仪器配套方可。当用烷基胺玻璃珠固定化葡萄糖氧化酶测定血糖时,则可用普通分光光度计于= 520 nm 处方便测定,其回收率、直线性及精度等皆达到实用要求,且多次重复使用6 个月以上仍有80 %的保留活力。这些结果表明生物学及生物工程、医学及生命科学仍是固定化酶应用的重要场合。在环境科学中的应用随环境污染的日趋严重及其治理的日益迫切,固定化酶在环境科学领域将具有重要用途,固定化胆碱酯酶对有机磷化合物具有较高的检测灵敏度,可用于环境领域中微量有机磷化合物的检测。固定化多酚氧化酶对酚类化合物具有特异性催化功能,可用于废水中酚类物质的检测及除去,已引起环境科学界的高度重视,这是一个值得注意的固定化酶应用领域。废水处理中,由于废水组分复杂而且经常变化,利用单一的固定化酶,很难收到好的处理效果。因此,要用多种单一的固定化酶组合处理,才能使有机物完全无机化和稳定化。如德国将九种降解硫磷农药的酶共价组合固定在多孔玻璃珠、硅胶珠上,制成酶柱处理硫磷废水获得95