蛋白质样品的制备.ppt

第二章 蛋白质样品的制备 蛋白质样品的制备是蛋白质组分析的基础 蛋白质样品制备包含：蛋白质分离、提取、纯化 蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一 步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样 品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究 的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的 蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和 物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具 有难度的。 第一节 样品制备总则 一、为什么要进行蛋白质样品的制备 1.要从某些组织样品中寻找功能蛋白质，就 要排除非蛋白质的影响。 2.目前实验条件下，双向电泳能分辨到1000 -5000个蛋白质点（spot），而生物的蛋 白种类多达10万种以上，样品中的蛋白质 种类也可达到1万种以上，但大部分蛋白 质的拷贝数都很少，因此通过样品制备也 可以起到浓缩蛋白质的作用。 3.消除各种细胞或组织混杂的影响 二、样品制备的原则 1.尽可能采用简单的方法进行样品的处理 2.尽可能的提高样品的溶解度，使所有待分析的蛋白质样品全部 处于溶解状态，且制备方法应具有可重现性。 3.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白 酶抑制剂以防止蛋白的降解。 4.样品制备过程中，防止发生人为的蛋白质样品化学修饰.（加入 尿素后加温不要超过37 ，防止氨甲酰化而修饰蛋白) 5.防止样品在等电聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀 6.破坏蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用，以产生独立的 多肽链 7.有的研究中必须保持蛋白质的活性。 8.通过超速冷冻离心等方法清除所有的非蛋白杂质，对可能起干 扰作用的高丰度或无关蛋白质也应去除 9.样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 。勿反复冻 融已制备好的样品。 三、流程 1.细胞或者组织、菌体的破碎 2.沉淀溶液样品中的蛋白质及清除杂质 3.蛋白质的纯化(重泡涨溶液稀释样品；三氯 乙酸+冷丙酮） 第二节 样品破碎与分离蛋白质 一、样品的类型 1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。 2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。 3.细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。 4.可溶性样品 是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。 二、组织与细胞破碎 为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。 蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。 （一）温和的裂解方法 通常应用于组分比较简单的样品，例 如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物 ，或者用于分析某一特定的细胞器，例如 只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其 它的细胞器。 1. 渗透裂解 非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶 胀而释放出细胞内容物。 2. 冻融裂解 许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要 求为止。 3. 裂解液裂解 含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行 悬浮处理。 4.酶裂解 有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。 （二）、剧烈的蛋白裂解 常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。 1. 超声裂解法 超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫， 样品处理应在冰浴中进行。 2.压力杯法 在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、 霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。 3.研磨法 用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研 磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨 。 4. 机械匀浆法 使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：固体组织，如心脏、肝 脏、肾脏组织和细胞悬 液。 操作步骤：先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。 5.玻璃珠匀浆法 剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容 物 应用对象：细胞悬液或微生物 操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置 于结实的管子里。每克细胞（湿重） 加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min， 冰浴1min。重复上述步骤。 三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这 会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略 。如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在 低温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制 备。另外，许多组织蛋白酶在ph超过9.0的时候 会失活，因此在样品裂解液中出现tris、碳酸钠 和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然 这些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上 述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要 应用蛋白酶抑制剂。 pmsf(苯甲基磺酰氟） 是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/l, 灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是 其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现 加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（dtt）或者- 巯基乙醇溶液中pmsf的抑制效果可能会减小， 因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。 aebsf 为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/l， 作用与pmsf相似，但溶解性较好，且毒性低。但 是aebsf可能会改变蛋白的等电点。 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（edta） 乙二醇双四乙酸（egta） 通常应用1mmol/l的工作浓度，通过螯合自由的金属离 子来抑制金属蛋白酶活性。 肽蛋白酶抑制剂 亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含 dtt的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和 半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂a（pepstatin a） ，抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin） ，抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin),抑制氨 基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是 小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑 制剂a在ph=9的时候不能抑制蛋白酶。 甲苯磺酰赖氨酸甲酮（tlck），甲苯磺 酰 苯丙氨酰氯甲酮（tpck） 通常浓度在0.1-0.15mmol/l，这些相同的成分 不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶 。 benzamidine 通常浓度为1-2mmol/l，抑制丝氨酸蛋白酶。 变性剂 在低温条件下处理。直接加入强变 性剂8mol/l脲、 10tca或2sds。强碱下抑 制酶活，许多组织蛋白酶在ph超过9.0的时候失 活。 四、分离和提取蛋白质（蛋白质沉淀步骤） 这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除 杂质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结 果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的 样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后 并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用沉 淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。 硫酸铵沉淀 （盐析） 原理：在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉 淀下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。 步骤：蛋白浓度大于lmg/ml，缓冲液浓度大于50mmol/l, 并含有edta,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10-30min， 通过离心沉淀蛋白。 然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方 法只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵 会干扰ief,必须被清除。 tca沉淀（三氯醋酸沉淀） 这是一种有效的蛋白沉淀方法，将tca加到提 取液中，终浓度将高达10-20 。蛋白质可于 冰上沉淀30min。另外，组织样品可以直接用10 -20 的tca进行匀浆。这种方法可限制蛋白降 解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉 淀，以除去tca。 然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完 全再溶。残留的tca必须通过乙醇或丙酮彻底清 除，若过多暴露与低ph溶液中可能导致某些蛋白 降解或修饰。 丙酮沉淀 这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许 多杂质，如去污剂、脂类。 于提取物中加入至少3倍体积的冰丙酮，使蛋白 在-20沉淀至少2h，再离心沉淀蛋白。残留的 丙酮通过空气干燥或冻干除去。 在丙酮中用tca沉淀 两者联合应用更加有效，通常用10tca 在丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有0.01 - 巯基乙醇溶液或20mmol/l dtt）。至少在- 20沉淀45min，通过离心沉淀蛋白，并用含 0.01-巯基乙醇溶液或20mmol/l dtt 的冰 丙酮清洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残 留的丙酮。此方法仍然存在难再溶的现象。 用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀 这对于杂质含量高的植物样品很有效。 蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋 酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋 酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通 过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时 较多。 在蛋白质样品制备中，蛋白质裂解是指对 样品蛋白质进行增溶性溶解的过程，其目的 是破坏蛋白质与蛋白质分子、蛋白质与非蛋 白质之间的共价与非共价相互作用；使蛋白 质变性及还原；去除非蛋白质组分，如核酸 、脂类等。为了达到这一目的，在蛋白质样 品制备过程中需使用表面活性剂、还原剂及 离液剂。 第三节 蛋白质裂解技术 一、裂解液 在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。 蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选 择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向 电泳分离效果的一个有力措施。 离液剂 尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键 等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为 一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为8mol/l。尿素 可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使 所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步 提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强 度时，一般用2mol/l硫脲和5-8mol/l的尿素联合使用。 还原剂 还原剂主要是用来断裂蛋白分子中cys残基 之间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用 的还原剂有-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dtt）或 二硫赤藓糖醇（dte)和三丁基膦（tbp）,目前常 用的是dtt。 去污剂（表面活性剂） 去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作 用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作 用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和 兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂 sds，非离子去污剂np-40和tritonx-100，两性离 子去污剂chaps。原则上去污剂应该是非离子型或 者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移 位置。最初，两个相似的非离子去污剂np-40和 tritonx-100被广泛应用。随后研究表明：兼性离 子去污剂chaps的效果更好。 二、裂解技术 裂解液的组成 裂解液基本成分包括：脲、一种或几种去污剂（还 原剂、固相ph梯度缓冲液也可以增强样品的溶解性） 脲：可溶解和折叠大多数的蛋白质，形成完全随机 的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中（硫脲的加 入可以进一步提高溶解度，特别是对膜蛋白） 去污剂：确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作 用导致蛋白质聚合 还原剂：可以断裂二硫键，以保持蛋白处于一种还 原状态。 载体两性电解质和固相ph梯度缓冲液也包含于裂解 液中：通过电荷与电荷之间的相互作用减少蛋白质聚 合来增强其溶解性。 裂解策略 对每一种样品而言，适宜的裂解步骤可由 经验而定，其目的均是尽可能地完全溶解、 解离、变性和还原蛋白质。 通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进行蛋 白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用各种 方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分别进 行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包括根 据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器 定位进行分级，如专门分离出细胞核、核糖体、细 菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样品 预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测 ，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。 第四节 样品预分级 一、亚细胞器的分离 主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度 不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密 度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组 分。 细胞匀浆 取待分析的组织细胞样品以0.9 nacl溶液反复 清洗，加入se缓冲液（0.25mol/l蔗糖、1mmol/l edta)，在低温下研磨成匀浆备用。 亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离 1.差速离心 指在密度均一的介质中不同大小的颗粒通过在 不同离心力场的作用下沉降而分离。 2.密度梯度离心 指用一定的介质在离心管中形成连续或不 连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或 离心力场的作用使细胞分层分离。 速度沉降 分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器， 其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以 不同的速度沉降。 等密度沉降平衡 适用于分离密度不等的颗粒。细胞 或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长 时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那 里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 二、细胞的分离 临床样品都是各种细胞或组织混杂， 而且状态不一。如肿瘤组织中，发生癌变 的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤 中总是与血管、基质细胞等混杂。所以常 采用癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行 差异比较，也就是多种细胞甚至是组织蛋 白质组混合物的比较。 常采用激光捕获微切割技术分离细胞 三、分步裂解提取 1.目的与原理 由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的 溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时 需要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质 。 分步提取法现已被用于提取各种不同组织的蛋白质， 其中通常采用以水相、有机相和表面活性剂为基础的提 取溶液。但是，仍然很难提取到样品的全部蛋白质组和 低丰度蛋白质。此外，一些疏水蛋白质，包括膜蛋白和 膜相关蛋白，以及高度抗性组织（如头发和皮肤组织） 的蛋白质几乎很难进行双向电泳分离，特别是在应用固 相ph梯度的等电聚焦中有待进一步的研究。 2.方法 molley等(1998)首先提出了顺序抽提法，其步骤是和高 效裂解缓冲液结合起来。具体步骤如下： 水溶液的提取 约5-15mg细胞中加入2ml裂解液（40mmol/l tris）。 反复冻融3-4个循环，加入适量的dnase 和rnasea，震荡 混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提 取物。 含urea/chaps/dtt溶液的提取 向第一步的沉淀中加入500ul的裂解液（8mol/l的 urea，4chaps，100mmol/l dtt,40mmol/ ltris，0.5 pharmalyte 3-10，20ug/ml dnase 和5ug/ml rnasea）剧 烈震荡混匀，离心收集上清即为第二步提取物。 含硫脲/sb3-10/tbp溶液的提取 将上一步所余的沉淀用40mmol/l tris清洗后，加 入200ul裂解液（5 mol/l urea，2mol/lthiourea，2 chaps， 2sb3-10，2mmol/l tbp, 40mmol/l tris,0.5 pharmalyte 3-10, 20ug/ml dnase 和 5ug/ml rnase a)剧烈震荡混匀，离心后收集上清，保 存于-70 分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐 渐增加的。第一步裂解液只含有40mmol/l tris， 其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白。第二 步裂解液属传统的裂解方法，含有表面活性剂 chaps、还原剂dtt、解聚剂urea等成分，由于具 有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较 疏水性的蛋白、第三步裂解液中添加了能够促进 疏水蛋白质溶解的成分，如表面活性剂sb3-10、 还原剂dtt、解聚剂thiourea，主要溶解偏疏水性 的蛋白。 细胞器蛋白质的提取 进行细胞预分级：根据蛋白质在细胞中不同的细胞器定位 和蛋白质溶解性进行分级，分离出细胞核、线粒体、高尔基体 等细胞器的蛋白成分 膜蛋白的提取与分离 因其嵌合在脂双层中，抽提时要消弱它与膜脂的疏水相互 作用。 膜蛋白很难出现在双向电泳凝胶图谱上，原因是：膜蛋白 是低丰度的、多为偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中的蛋 白质，因此，为了能够从双向电泳凝胶图谱中分离出膜蛋白， 首先必须实现3个条件：（1）必须保证膜的脂类环境，同时， 应避免多余的脂类对等电聚焦造成干扰。（2）必须以一种可 溶的形式（通常是去污剂-蛋白质复合物）从膜中分离出来（3 ）所提取的膜蛋白必须在等电聚焦过程中维持可溶状态，特别 是在等电点的位置。 核蛋白的提取与分离 三、特殊蛋白质的提取 一、紫外吸收测定法 原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色 氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有 吸收紫外光的特性。吸收高峰在280nm处，其 吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正相关 。此外，蛋白质溶液在280nm的光吸收值与肽 键含量成正比。利用在一定波长下蛋白质溶液 的光吸收值与蛋白质浓度的正相关关系，可以 进行蛋白质含量的测定。 第五节 样品蛋白质含量测定 特点：测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物较多。在用标 准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸 和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适用 于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。 1.280nm光吸收法：测定时 ，将待测蛋白质溶液倒入 石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓 冲液）做空白对照，在紫外分光光度计上直接读取 280nm的吸光度值a280。 2.280nm和260nm的吸收差法：核酸对紫外光有很强的 吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍，但核酸在 260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。纯 蛋白质的光吸收比值a280/a260=1.8;纯核酸的光吸收 比值：a280/a260=0.5 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其a280和 a260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即 可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度（mg/ml)=1.45* a280-0.74* a260 3.肽键测定法 （1）238nm光吸收值法：蛋白质溶液在238nm 处光吸收的强弱，与肽键的多少成正相关。 因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列已知 浓度的蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值 a238，以a238为纵坐标，蛋白质含量为横坐标 ，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由 标准曲线求得。 （2）双缩脲法（nh3conhconh3) 双缩脲是两个分子脲经180左右加热， 放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液 中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双 缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接 的肽键，或能通过一个中间碳原子相连的肽键 ，这类化合物都有双缩脲反应。双缩脲反应的 结果靠紫色络合物的颜色来判断。 紫色络合物的颜色的深浅与蛋白质浓度成 正相关，而与蛋白质分子质量及氨基酸成分无 关，故可用来测定蛋白质含量。 4.folin-酚试剂法 folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨 酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物 ）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白质的量成正相关。 二、考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质 结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为 595nm，溶液颜色也由棕黑色变为蓝色。染料主要是 与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香 族氨基酸残基相结合，在595nm下测定的吸光度值 a595，与蛋白质浓度成正比。 三、试剂盒测定 试剂盒：配有进行分析或测定所必需的全部试 剂的成套用品。如医学上特定疾病诊断试剂盒 、分子生物学上的核酸提取回收试剂盒、微生 物学上的细菌鉴定试剂盒等。 二奎琳甲酸（bca）蛋白质检测试剂盒 样品中的非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白的分 离及二维电泳图谱的质量，因此，在样品制备中 需考虑清除这些杂