[工作计划]大学生创新课题.doc

黄河裸裂尻生长激素基因的PCR扩增和克隆摘要：从黄河裸裂尻鱼的脑组织提取总RNA，应用RT-PCR方法获得生长激素cDNA。将cDNA 插入质粒 pQE30中,并使其在大肠杆菌 RB791 中表达。经IPTG诱导后SDS-PAGE 电泳检测蛋白的表达情况。结果表明：扩增后黄河裸裂尻生长激素基因为508bp。由序列的比对，黄河裸裂尻生长激素基因与青海湖裸鲤的的同源性很高。电泳结果显示一新的分子量约为14. 4 kD的特异蛋白带。关键词：黄河裸裂尻 生长素基因 克隆 基因表达PCR amplification and Cloning of growth hormone gene in Schizopygopsis pylzoviAbstract: The total RNA was extracted from brain of Schizopygopsis pylzovi.The growth hormone cDNA was amplified by RT-PCR method using isolated total RNA as template. The GH cDNA fragment was inserted to plasmid pQE30 and made it expression in E.coli RB791.The expression protein was assayed by SDS-PAGE after IPTG inducing . Results show that the GH cDNA fragment of Schizopygopsis pylzovi was 508bp in length. The growth hormone gene of Schizopygopsis pylzovi was highly homologous with the that of Gymnocypris przewalskii according to sequences comparison. The results of electrophoresis showed that a new specific protein band was found with molecular mass of about 14. 4kD.Key words：Schizopygopsis pylzovi growth hormone（GH）gene Clone Gene expression生长激素(growth hormone,GH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白激素，它是一种具有广泛生理功能的生长调节素，鱼类生长激素(fish growth hormone,fGH) 是鱼类脑垂体合成和分泌的一种分子量在22 kD左右的蛋白多肽，对鱼类的生长和发育有重要作用。本实验采用RT-PCR方法克隆黄河裸裂尻GH cDNA，进一步获得黄河裸裂尻生长激素基因序列,并将其连接至载体上，构建黄河裸裂尻鱼生长激素基因表达质粒,在大肠杆菌系统进行了高效表达,获得融合蛋白，这对我省开展的高原特有鱼种的人工驯化和养殖计划打下了有力的技术保障。1 材料与方法1.1 材料 将黄河裸裂尻鱼在实验室水池短暂养殖。RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、pMD 19-T Vector均为TaKaRa公司产品。引物利用Primere 5根据同属鱼类同源性比对设计，其他试剂购自索莱宝公司。1.2 方法1.2.1 黄河裸裂尻总RNA提取：参照查阅的文献中的方法从黄河裸裂尻鱼组织中提取总RNA，电泳分析RNA质量，利用分光光度计测定其含量后，储存于液氮中。1.2.2 引物设计:利用鱼类GH保守的特点，通过同源性比对设计引物为：GH1： 5 TGAGGAAAGCCTGTTGC 3 GH2：5 TGACTAGCAATACATTAGCG 31.2.3 RT-PCR扩增：溶解总RNA于DEPC水中，RNA终浓度为1ug/ulA RT-PCR反应体系如下（表1）：试剂用量Mgcl2ul10 * PCR Buffer 1 ulRNase free dH2O3.75 uldNTP Mixture1 ulRNase Inhibitor0.25 ulAMV Reverse Transcriptase XL0.5 ulOligo dT-Adaptor Primer0.5 ulRNA1 ulTotal10ul反应条件： 30 10min50 20 min99 5 min 5 5 min 1 cycleB PCR反应体系（表2）：试剂用量5 * PCR Buffer10ul灭菌水28.75 ulTaKaRa Ex Taq HS0.25 ulF（上）0.5 ulF（下）0.5 ul将B与A混合后按以下条件反应：94 5min94 30sec50 30sec72 40sec 35 cycle取PCR产物5ul进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.4 黄河裸裂尻GH基因的克隆 2、3 ：A 将纯化后的目的基因进行转染，用TaKaRa Code：D102A PMD19-T Vector载体，使用JM109感受态细胞，方法如下（表3）：试剂用量PMD19-T Vector*11ulControl Insert*21uldH2O3ul加入5ul（等量）的Solution I ；16反应30分钟；全量（10ul）加入至100ul JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟；42加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟；加入890ulSOC培养基，37振荡培养60分钟；在含有X-Gal、IPTG、Amp的培养基上培养，形成单菌落，计数蓝白斑。B 在扩大培养的1ml菌液中取200ul菌液4000rpm/min离心5min后吸取下层菌液2ul做PCR。反应体系如下（表4）：试剂用量10 * PCR Buffer5uldNTP Mixture4ulM132ulAV-M2ul菌液2ulTaKaRa Ex Taq HS0.25uldH2O34.75ul反应条件： 94 5min94 1min 55 1min72 1min72 5min 4保存1.2.5 DNA序列测定：送往基因公司进行测序1.2.6 大肠杆菌表达载体的构建及诱导表达：2 结果2.1（1）黄河裸裂尻鱼总RNA电泳检测结果（图1）图1：RNA凝胶电泳检测，图中条带从上往下依次为28s、18s、5sRNA（2）分光光度计测定OD值结果2.2 黄河裸裂尻鱼GH cDNA的RT-PCR扩增2.2.1 RT-PCR扩增产物电泳结果（图2）图2：图中条带表示黄河裸裂尻GHcDNA片段的RT-PCR结果A B图3（A、B）：黄河裸裂尻鱼GH转化后PCR结果M：DNA标准分子量；A中115：菌落样品，其中13号样品与预期的大小母的片段一致；B中14：菌落样品，其中1、3号样品与预期的大小母的片段一致2.3 序列分析 2.3.1 测序结果显示黄河裸裂尻鱼GHcDNA长度为508bp,黄河裸裂尻鱼GH基因编码的核苷酸序列与鲤鱼、鲫鱼、斑马鱼、鳇鱼、虹鳟鱼等相应的核苷酸序列之间的同源性较高。（图4）图4：黄河裸裂尻鱼与其它鱼类的GH核苷酸序列同源性比较2.3.2 氨基酸序列比对图5：黄河裸裂尻鱼分别与青海湖裸鲤、鲤鱼和斑马鱼的氨基酸序列比对结果2.3.3同源性比较和系统分析利用Mega4.1软件构件邻接（N-J）系统进化树 4、5，选择在进化上具有代表性的五种进行比较，采用默认参数进行构建，同时应用自举检验估计系统发育树各节点的自引导值（重复次数为1000次）。从中看出黄河裸裂尻鱼与鲤、鲫、拟鲤、虹鳟、斑马鱼等淡水鲤科鱼类的同源性较高。如图5：图6：黄河裸裂尻鱼与其它鱼类的GH系统进化树Schizopygopsis:黄河裸裂尻鱼 Gymnocypris:青海湖裸鲤 Cyprinus:鲤鱼 Carassius:鲫鱼 Pimephales：黑头软口鲦 Danio:斑马鱼 Clarias: 胡子鲶 Gairdneri: 虹鳟鱼 keta:大马哈鱼 S.gairdneri: 虹鳟鱼 Salmon: 三文鱼O.keta: 大麻哈鱼 O.niloticus:尼罗罗非鱼 L.calcarifer：尖吻鲈 Rhabdosargus:平鲷鱼 2.4 黄河裸裂尻鱼GH基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌表达载体的构建及诱导表达:将黄河裸裂尻 GH cDNA与 pQE30载体均用 BamH 和Hind 进行双酶切 ,用T4DNA连接酶连接后 ,获得重组质粒。再将重组质粒转入大肠杆菌 RB791中 ,于 LB 培养基中(37)培养 1215 h。蘸取上述大肠杆菌菌落 ,置于含 2 mL的 2 LB /Amp培养基的试管中在 37条件下振摇 45 h,加 IPTG使其终浓度为 1 mmoL。诱导 2h后收集菌液行 SDS - PAGE蛋白质电泳检测。 图7：黄河裸裂尻鱼生长激素基因SDS PAGE图谱，其中4号出现特异条带SDS - PAGE检测表明 (见图7) ,含重组 GH -Schizopygopsis pylzovi 基因的 4号菌株经 IPTG诱导后 ,出现特异蛋白表达条带 ,蛋白分子量约为 14 . 4 kDa。3 讨论本研究用RT-PCR法和基因克隆活的黄河裸裂尻鱼GH的cDNA,其长度为508bp，比较分析得知，所有的的GH基因具有相同的结构，与其他鱼类进行核苷酸序列比对发现，其亲缘关系比较近，并且可以看出GH基因比较保守，通过其氨基酸序列的比对发现黄河裸裂尻与青海湖裸鲤、鲤鱼、斑马鱼的亲缘关系较近，其氨基酸序列相似性分别为100%、98%、94%，另外，尽管黄河裸裂尻与青海湖裸鲤所编码的氨基酸相似性为100%，但其编码氨基酸的基因序列中也有1个核苷酸位点不同，可能是不同种群间歧异性的具体表现。课题只是扩增出了黄河裸裂尻鱼生长激素基因的一个片段508bp，并没有拿到其全长序列，这对于黄河裸裂尻与其他鱼种的同源性比对产生了一定的差异，如：系统进化树。本研究采用生物信息学方法对黄河裸裂尻鱼GH基因序列、编码蛋白的理化性质等进行分析，这为今后的GH蛋白的分离纯化及对该蛋白生物活性分析提供了可靠的技术保障，也对我省开展的高原特有鱼种的人工驯化和养殖计划的有力技术保障。参考文献1谢保胜，藤原滋树，斑马鱼总RNA提取和纯化J.生物学杂志，2007,24（6）：67-692谢保胜，段瑞君，藤原滋树，斑马鱼促性腺激