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河北大学 硕士学位论文 中华锯齿米虾卵黄发生的超微结构及免疫组化研究 姓名：赵梦然 申请学位级别：硕士 专业：细胞生物学 指导教师：康现江 20090601 摘要 摘要 目前国内外许多学者对十足目甲壳动物的卵巢发育和卵子发生做了大量的研究，但 有关中华锯齿米虾卵黄发生过程的研究还未见相关报道，对中华锯齿米虾生殖发育的调 控机理仍然不是十分清楚。本文采用透射电镜和免疫组织化学技术系统研究了中华锯齿 米虾卵母细胞及其内部各种细胞器在卵黄发生过程中的形态变化特征，以及在这一过程 中滤泡细胞的结构变化情况。这项研究，一方面为甲壳动物卵黄发生研究提供理论基础， 对甲壳动物生殖发育调控及育种具有重要的实际意义；另一方面对以卵黄蛋白原作为环 境内分泌干扰物质的“生物标志物”等毒理学方面的深入研究具有细胞学理论指导意义； 同时，还为甲壳动物的毒理学实验确定了一种良好的实验材料。 中华锯齿米虾的卵巢分为前叶、后叶两部分，前叶汇合在一起位于心脏下方、肝胰 腺上方；后叶位于肠道上方并与肠道平行。在卵巢的发育过程中，可观察到不同时相的 卵母细胞。 卵原细胞期：细胞圆形，体积较小，核质比较大，细胞质均匀，细胞之问排列相当 紧密，没有发现滤泡细胞。 卵黄发生前期：细胞体积有所增大，但胞质仍较均匀。该时期滤泡细胞出现，但数 目较少，分布也很不规则，且有逐渐将卵母细胞包围分割的趋势。 卵黄发生早期：卵黄蛋白合成全面启动，细胞体积由于卵黄蛋白的不断合成而增大， 细胞质中开始出现卵黄球。卵母细胞被滤泡细胞全部包围，多层，但它们之间的关系很 松散。 卵黄发生中期：细胞体积继续增大，形状越来越不规则，近似于三角形。核质比下 降。卵母细胞被单层滤泡细胞层完全分割。滤泡细胞渐渐紧贴卵母细胞。 卵黄发生后期：卵黄物质继续填充卵母细胞质，部分卵母细胞的细胞核甚至消失。 滤泡细胞开始缩小退化。 成熟期：卵母细胞中充满成熟的卵黄蛋白。此时滤泡细胞呈一薄层紧贴于卵母细胞 乃至完全退化。 在此基础上进行电镜观察发现：中华锯齿米虾卵黄发生过程是双源性的。在卵黄发 生过程中，卵母细胞中的线粒体、内质网、溶酶体和核糖体等多种细胞器均参与了其内 t 摘要 源性合成。其中线粒体最早参与形成卵黄颗粒。在卵黄发生的中后期，内质网成为内源 性卵黄蛋白合成最主要的细胞器，并最终演化成颗粒较大且有膜包被的卵黄球；溶酶体 也在此时期发挥其特有的吞噬功能，通过与线粒体、内质网、环状片层结构组成自噬泡， 相互融合使卵黄球的体积逐渐增大；另外，有些溶酶体通过融合分解线粒体、内质网等 胞质细胞器形成髓样结构，最终形成一种电子密度很大的致密卵黄球。外源性卵黄则主 要通过卵质膜形成的微绒毛和微吞饮小泡从卵周隙及滤泡细胞中摄取外源物质而形成。 通过免疫组织化学实验，充分表明：中华锯齿米虾内源性卵黄物质发生的主要场所 是卵母细胞质。在卵黄发生前，卵母细胞中的卵黄物质较少，到了卵黄发生时期，卵母 细胞中的卵黄物质快速积累。此外，实验中发现滤泡细胞中也存在卵黄物质，进一步证 明了滤泡细胞是外源性卵黄物质来源的主要场所。同时也进一步证实了中华锯齿米虾卵 黄发生是双源性的这一结论。 关键词中华锯齿米虾卵母细胞卵黄发生超微结构免疫组织化学 i l a b s t r a c t a b s t r a c t a tp r e s e n t , m a n ys c h o l a r sh a dd o n ead e v i lo fi n v e s t i g a t i o n so nt h eo v a r yd e v e l o p m e n t a n do o g e n e s i so fd e c a p o d ac r u s t a c e a n n e v e r t h e l e s s ，i th a d n ts e e nt h er e p o r t sc o r r e l a t e d v i t e l l o g e n e s i si nt h eo o c y t e so fn e o c a r i d i n ad e n t i c u l a t as i n e n s i s t h es t u d yo nt h er e g u l a t i o n m e c h a n i s m so fr e p r o d u c t i v ed e v e l o p m e n ti n d e n t i c u l a t as i n e n s i sw a sn o tv e r yc l e a r t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) a n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r yw e r ee m p l o y e dt o r e s e a r c ht h em o r p h o l o g i cc h a n g ec h a r a c t e r i s t i c so fv a r i o u sk i n d so fo r g a n e l l e si no o c y t e sa n d t h es t r u c t u r ec h a n g e so nf o l l i c u l a rc e l l sd u r i n gt h ev i t e l l o g e n e s i so f d e n t i c u l a t as i n e n s i s s y s t e m l y t h i sr e s e a r c hw o u l dp r o v i df u r t h e rr a t i o n a l ef o rs t u d i n gt h ev i t e l l o g e n e s i so f c r u s t a c e a n i tp o s s e s s e ds i g n i f i c a n tp r a c t i c a lp u r p o s eo nr e p r o d u c t i v ed e v e l o p m e n tr e g u l a t i o n a n db r e e d i n gi nc r u s t a c e a n i ta l s ow o u l db et h et h e o r yg u i d eo nu s i n gt h ev i t e l l o g e n i na s e n v i r o n m e n t a le n d o c r i n e d i s r u p t i n gc h e m i c a l s b i o l o g i c a lm a r k e ri nt o x i c o l o g yf u r t h e r r e s e a r c h t l l i sr e s e a r c hp r o v i d e dag o o dk i n do fs t u d ys u b j e c tf o rt o x i c o l o g ya sw e l l t h e d e n t i c u l a t as i n e n s i s so v a r yi sd i v i d e di n t ot h ea n t e r i o rl o b ea n dp o s t e r i o rl o b e 1 1 1 ea n t e r i o rl o b ej o i n st o g e t h e ra n dl o c a t e sb e t w e e nt h eh e a r ta n dh e p a t o p a n c r e a s t h e p o s t e r i o rl o b el o c a t e sa b o v e t h ei n t e s t i n a lt r a c ta n dp a r a l l e l sw i t hi t d u r i n gt h ed e v e l o p m e n t o fo v a r y , w ec o u l do b s e r v et h eo o c y t e sd u r i n gd i f f e r e n tp h a s e s 耽eo v o g o n i u m ：t h ec e l lw a ss p h e r i c a l t l l ev o l u m ew a sc o m p a r a t i v e l ys m a l l n l e n u c l e a r - c y t o p l a s m i er a t i ow a sl a r g e t h ec y t o p l a s mw a sw e l l d i s t r i b u t e d a l lo f c e l l sd i s p o s e d t i g h t l yf a i r l y 劢ep r o p h a s eo fv i t e l l o g e n e s i s ：t h ev o l u m eg r e w 砀ec y t o p l a s ms t i l lr e m a i n e d w e l l - d i s t r i b u t e d t h ef o l l i c u l a rc e l l sa p p e a r e di nt h i sp h a s e b u tt h ea m o u n tw a sv e r yl o w t h e d i s t r i b u t i o no ff o l l i c u l a rc e l l sw a sq u i t ei r r e g u l a r i t y t h e yh a dat e n d e n c yt os u r r o u n d i n ga n d d i v i d i n gt h eo o c y t e sb yd e g r e e s 1 1 1 ee a r l i e rp e r i o do f v i t e l l o g e n e s i s ：t h es y n t h e s i sa c t i v i t yo fv i t e l l o g e n i ns t a r t e do v e r a l l 1 1 1 ec o r p u s c u l a rv o l u m ew a sg oo ng r o w i n g t h eo o c y t e s c y t o p l a s mb e g a nt oa p p e a ry o l k s p h e r e t h eo o c y t e sw e r ee n t i r e l ys u r r o u n d e db ym u l f i l a y e rf o l l i c u l a rc e l l s b u tt h er e l a t i o n w a s l o o s i n g 砀em e t a p h a s eo fv i t e l l o g e n e s i s ：t h ec o r p u s c u l a rv o l u m ec o n t i n u e dg r o w i n g 砀es h a p e o fo o e y t e sw a si r r e g u l a r i t yg r a d u a l l ya n da p p r o x i m a t i n gat r i a n g l e t h eo o c y t e sw e r e c o m p l e t e l yd i v i d e db yt m i l a m i n a rf o l l i c l ec e l l t h ef o l l i c u l a rc e l l ss t u c k t ot h eo o c y t e st i g h t l y i t l a b s t r a c t t h ea n a p h a s eo fv i t e l l o g e n e s i s ：t h eo o c y t e sw e r ef i l l e dw i t hv i t e l l u sm a t e r i a l ap a r to f o o c y t e sn u c l e u se v e nd i s a p p e a r e d 1 1 1 ef o l l i c u l a rc e l l ss t a r t e dt od e g e n e r a t ea n dd e f l a t e d t 1 1 em a t u r a t i o np h a s e ：t 1 1 eo o c y t e sw e r ef u l lo fr i p ev i t e l l o g e n i n t l l ef o l l i c u l a rc e l l s b e c a m eae x t r e m et e n u i sw r a pa n de v e nv a n i s h e d o u ro b s e r v a t i o nw a sc a r r i e do u to nt h e s eb a s eb yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e t h er e s u l t si n d i c a t e dad u a lo r i g i no ft h ey o l k a l lk i n d so fo r g a n e l l e sw e r ei n v o l v e di n e n d o g e n o u sy o l kf o r m a t i o nd u r i n gt h ev i t e l l o g e n e s i sp e r i o d ，f o re x a m p l e ：m i t o c h o n d r i a ， e n d o p l a s m i cr e t i c u l a , l y s o s o m e sa n dr i b o s o m e s t h em i t o c h o n d r i aw e r et h ef i r s to r g a n d i e s i n v o l v e di ny o l kg r a n u l e sf o r m a t i o n h o w e v e r ，t h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l aw e r et h ed o m i n a n t o r g a n e l l e sw h i c hp l a y e dt h em o s ti m p o r t a n t r o l ei nt h em e t a p h a s ea n da n a p h a s eo f v i t e l l o g e n i co o c y t e sa n dt h e nd e v e l o p e di n t ot h eb i g g e ry o l kg r a n u l e sw i t hm e m b r a n e s f u r t h e r m o r e ，t h el y s o s o m e sp l a y e dt h et y p i c a lf u n c t i o ni nt h es a m ep h a s e t h e ye n g u l f e da n d r e s o l v e dt h em i t o c h o n d r i aa n de n d o p l a s m i cr e t i c u l at oe x p a n dt h ey o l ks p h e r e sv o l u m e ，a t l a s tf o r m e dh i g he l e c t r o n - d e n s ey o l kg r a n u l e s e x o g e n o u sy o l kf o r m a t i o nw a sc a r r i e do u t p r i m a r i l yb ym i c r o v i l l u sa n dp i n o c y t o t i cv e s i c l e so ft h ep l a s m am e m b r a n ew h i c hu p t o o kt h e e x o g e n o u sm a t e r i a l sf r o mt h ep e r i v i t e l l i n es p a c e o rf o l l i c u l a rc e l l s t h er e s u l t so fi m m u n o h i s t o c h e m i s t r yr e s e a r c hw o u l db ea n i m p o r t a n tt e s t a n d s u p p l e m e n t a r yt ot h ea b o v e m e n t i o n e dr e s u l t a n t t h er e s e a r c hd i s c o v e r db ya n a l y z i n gt h a tt h e o o c y t e s c y t o p l a s mw e r et h em a j o ra r e n a o fe n d o g e n o u s y o l kf o r m a t i o nd u r i n gt h e v i t e l l o g e n e s i sp e r i o d i nt h ep r o p h a s eo fv i t e l l o g e n e s i s ，t h ea m o u n to fv i t e l l u sm a t e r i a lw a s v e r yl o w d u r i n gt h ev i t e l l o g e n e s i sp e r i o d ，t h ev i t e l l u sm a t e r i a la c c u m u l a t e dq u i c k l y i n a d d i t i o n t h e r ew e r ev i t e l l o g e n i ni nf o l l i c u l a rc e l l s t h er e s u l tw o u l db eaf u r t h e rp r o o ft o c e r t i f i c a t et h a tf o l l i c u l a rc e l l sw e r et h em a j o ra r e n ao fe x o g e n o u sy o l kf o r m a t i o ni n d e n t i c u l a t as i n e n s i s s i m u l t a n e o u s l y , i ta l s oc o n f i r m e dt h ec o n c l u s i o no fad u a lo r i g i no ft h e y o l k k e y w o r d sn e o c a r i d i n ad e n t i c u l a t as i n e n s i so o c y t e sv i t e u o g e n e s i s u l t r a s t r u c t u r e i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y i v 河北大学理学硕+ 学付论文 缩略词( a b b r e v i a t i o n s ) 缩略词( a b b r e v i a t i o n s ) 续表 3 9 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名：盘望达。日期：年月日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方格内打“4 “ ) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为( 的学位论文，是我个人在导师() 指导并与导师合作下取得的研究成果， 研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费 资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定 的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人： 盘婪达。 日期：年月日 作者签名：盘壁垫： 导师签名： 丞堕! 兰一一 第一章绪论 第一章绪论 1 1 十足目甲壳动物雌性生殖系统发育及卵子发生 雌性生殖系统是十足目甲壳动物机体的重要组成部分，直接关系着甲壳动物的生长 发育、繁殖性能等重要生命活动。因此，研究雌性生殖系统的解剖学、组织学，以及卵 子发生，是认识和探讨甲壳动物生理调控、繁殖机制的重要途径之一。 1 1 1雌性生殖系统解剖学 十足目甲壳动物雌性生殖系统一般由卵巢、输卵管和雌性生殖孔组成【卜2 】。卵巢一 般位于身体背面，肠道上方，心脏下方，呈左右对称。较原始的卵巢仅为一对简单的管 子，而比较高级的种属，如对虾属( p e n a e u s ) ，其左右卵巢则各有8 个小叶组成。短尾部 甲壳动物的卵巢只限于在头胸部内，真虾部( c a r i d e a ) 贝, 0 由头胸部一直延长到第一腹内， 其中对虾属的卵巢甚至深入到尾节。鼬虾总科( t h a l a s s i n i d e a ) 和寄居蟹总科( p a g u r i d e a ) 的卵巢完全位于腹部内；除上述两个总科外，其余种类甲壳动物的左右卵巢之间都有 1 3 条横跨连枝而相互连接。卵巢两侧各发出一条输卵管，开孔在第六胸节；游泳亚 目( n a t a n t i a ) 及爬行亚目( r e p t a n t i a ) 的长尾部( m a c r u r a n ) 与异尾部( b r a c h y u r a n ) 的输卵管 开孔于第三步足的基节上，但是拟寄居蟹属( p a r a p a g u r u s ) 只在左侧有一个雌性生殖孔， 短尾部的输卵管先与由外胚层来源的体壁内凹所形成的受精囊会合，然后开孔于第三步 足的基节上或第六胸节的腹甲上。萤虾属( l u c i f e r ) 也有一对卵巢，完全位于腹部内肠到 下方，左右输卵管也各与一纳精囊汇合，但是共同开孔于第三胸节腹甲中央，因此只有 一个雌性生殖孔【3 1 。 1 1 2 雌性生殖系统及其发育的组织学 凡纳滨对虾( p e n a e u sv a n n a m e ) 的卵巢由卵巢壁及其内部卵室和中央卵管组成，基本 呈实心结构；卵巢壁即卵巢的外膜，由外而内依次由上皮层、肌层、基膜和分化上皮构 成；中央卵管实为卵巢壁内突，一条、从卵巢壁一侧发出，伸入卵巢内部、管壁主要由 外层基膜和内层的复层生殖上皮构成，生殖上皮分化出卵原细胞并大量增殖，是卵巢的 增殖中心；卵巢壁的内突伸入卵巢内部，将其分隔成许多大小不一的卵室，卵室中充满 不同发育阶段的卵母细胞【。东方扁虾( t h e n uo r i e n t a l i ) 卵巢主要包括4 种形态组分： 1 河北人理学硕十学位论文 ( 1 ) 卵巢壁，( 2 ) 生殖上皮，( 3 ) 卵母细胞( 早期卵巢还包括卵原细胞) 一滤泡细胞层，( 4 ) 卵 巢壁内突；卵巢壁及壁内突均含有血管、血窦和肌细胞等成分，卵巢壁内突延伸至每个 滤泡的外层基膜处。 甲壳动物的滤泡结构一般比较简单，滤泡从内至外由4 部分组成：卵细胞、卵周隙 及其内含物、滤泡细胞和基膜【2 】。根据滤泡细胞与卵母细胞来源是否一致，可将卵子发 生分为滤泡型和非滤泡型两大类。长毛对虾僻p e n i c i l l a t u s ) 的卵子发生是属于滤泡型的， 滤泡细胞与卵原细胞同样由生殖上皮分化形成，它们都属于性细胞。卵细胞发育所需要 的营养与滤泡细胞的供应有关，滤泡细胞粗糙型内质网很发达，合成大量的卵黄蛋白， 输送给卵母细胞作为形成卵黄颗粒的原料【4 】：凡纳滨对虾的滤泡细胞由卵巢壁的分化上 皮分化而来，属于体细胞；而卵细胞则起源于卵巢壁的特殊分化上皮生殖上皮，属于 性细胞，二者并不同源，在卵母细胞周围的滤泡细胞，其主要功能是保护卵母细胞的发 育，并供应其发育所需要的营养物质，这与体细胞的生理功能相符f l 】；中国明对虾 ( f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s ) 滤泡细胞可能来自结缔组织，是进入到卵巢内部的唯一的 非性细胞，滤泡细胞对卵黄的发生起供给作用【5 】；黑斑口虾蛄( o r a t o s q u i l l ak e m p i ) 滤泡 细胞由伸入卵巢内部的结缔组织细胞分生肥厚而成，为体细胞，其功能主要是保护卵母 细胞的发育，供应其发育所需要的营养物剧6 1 。 关于甲壳动物卵巢发育的分期各学者划分标准不一。王良臣等将中国对虾的卵巢发 育分为未发育期、增殖期、生期、将成熟期、成熟期和排卵后期等六个时期嘿上官步 敏等根据卵巢内外特征的变化，将锯缘青蟹( 勋如s e r r a t a ) 的卵巢发育分为未发育期、 发育早期、发育期、将成熟期、成熟期和排卵后期等六期；郑忠明等根据卵巢发育的形 态学和组织学特征，将哈氏仿对虾( p a r a p e n a e o p s i sh a r d w i c k i ) 的卵巢发育分为形成期、 小生长期、大生长前期、大生长后期、成熟期和恢复期等六期【8 1 ；何绪刚等根据卵巢的 外部特征及卵母细胞的组成，将日本沼虾( m a c r o b r a c h i u mn i p p o n e n s e ) 的卵巢发育分为 五期【9 】；顾志敏等根据第一批卵细胞的发育状态，将中华绒螯蟹( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) 的卵 巢发育分为七期【1 0 】；王春琳等根据卵巢切面中面积据最高比例的卵母细胞的时相来将黑 斑口虾蛄的卵巢发育分为四期【6 】：颜素芬通过对凡纳滨对虾卵巢内外特征的对比，以组 织学、细胞学观察为主，在认识了从卵原细胞增殖到卵子成熟的整个卵子发生过程的基 础上，将凡纳滨对虾的卵巢发育分为增殖期、小生长期、大生长期早期将成熟期成熟期 2 第一章绪论 和恢复期共六期【1 1 1 ；邓道贵根据粗糙沼虾ma s p e r u l u m ) 卵巢发育中每种雌性生殖细胞 比例和发生的次序以及卵巢的形态特征，把卵巢发育分为7 个时期【1 2 】。综上所述，各个 学者虽然对不同种类甲壳动物卵巢发育的分期不一致，但是他们使用的卵巢分期标准却 非常类似，主要依据甲壳动物卵巢发育中卵巢体积、颜色和形状等外部形态的变化以及 组织学的变化进行分期。 1 1 3 卵子发生的过程及分期 十足目甲壳动物卵子发生是个体发育的重要环节，是一个卵母细胞逐步成熟的过 程。与高等脊椎动物相同，其卵子发生都要经历一次减数分裂，染色体变为体细胞的一 半。其成熟卵子同样也只是发育到初级卵母细胞阶段，只是常因动物种类不同而处于不 同的发育时期，如中华绒螯蟹的成熟卵处于初级卵母细胞第一次成熟分裂的中期。而成 熟卵子减数分裂的真j 下完成、两个极体的排出则要等到受精后。 卵黄发生是十足目甲壳动物卵子发生过程中最显著的事件，卵黄的多寡、分布与组 分直接关系到卵子的成熟和质量。因而不同学者常常以卵母细胞的大小及形状、卵母细 胞核的形态变化、卵黄物质的合成及积累情况、卵母细胞及滤泡细胞之间的关系等方面 为参考依据将卵子发生过程分成几个不同时期【1 3 】。洪根水、王玉凤、颜素芬分别对长毛 对虾、罗氏沼虾( mr o s e n b e r g i i ) 及凡纳滨对虾卵子发生过程进行研究，都将卵子发生 分为卵原细胞期、卵黄发生前期和卵黄发生期三个时期。朱冬发在研究东方扁虾卵子发 生的超微结构时，将卵子发生过程分为卵原细胞期、卵黄发生前期、卵黄发生期和卵黄 成熟期四个时期。卵子发生实际上是卵母细胞由发生到成熟的连续性过程，期间没有绝 对界限。 处于不同时期的卵母细胞各具特点。 卵原细胞：十足目甲壳动物的卵原细胞圆形或不规则；核呈椭圆状，核孔极少，双 层核膜之间的核周池较宽，局部扩张形成核膜泡，核内染色质多数沿核膜内侧呈块状或 絮状分布，核内有一至数个较为疏松的核仁，一般位于近核的中央位置，很少紧贴着核 内膜的边缘；细胞一般处于不活跃状态，活跃增殖时的卵原细胞常可见核完全分裂，卵 质却尚未分裂而形成多核共质体结构【1 4 】；细胞质稀少，细胞器不发达，偶尔散布着滑面 内质网囊泡 4 , 5 , 1 0 , 1 3 - 1 6 。 卵黄发生前的卵母细胞：卵原细胞经过分裂、生长发育为卵母细胞，刚形成的卵母 河北人学理学硕十学位论文 细胞直径为卵原细胞的1 至2 倍1 1 4 , s , l o , 1 3 - t 6 | 。此时期的细胞分为早期和晚期两个阶段，早 期的卵母细胞在体积、内部构造上与卵原细胞相近，但卵核明显增大，染色质电子密度 很高，卵质中还出现了少量核糖体和高尔基体。晚期的卵母细胞体积与内部结构变化明 显：核膜上核孑l 增多，核膜凹凸不平，并向卵质中伸出伪足状突起，核周池变窄；核仁 呈大小不等的致密颗粒，数量很多，紧贴核内膜围成一圈，有的核仁表现为两性核仁【4 】； 东方扁虾胞质核明显膨大，特称生发泡【l3 1 。卵母细胞体积迅速增大，胞器种类和数量明 显增多，紧靠核外膜的卵质中出现数团电子密度与核仁一致的核仁外排物，且富含游离 型核糖体和线粒体 1 4 , 1 7 1 ；东方扁虾胞质为内质网囊泡所充满。 卵黄形成期卵母细胞：此期卵母细胞近圆球形，由于卵黄合成旺盛其体积迅速增大 4 , 5 , 1 0 , 1 3 - 1 6 】1 。根据滤泡是否形成、卵黄颗粒合成的状况及卵壳的有无等，卵黄形成期卵母 细胞期又可细分为前期、中期和后期三个阶段【1 3 1 或初期、旺盛期和晚期三个阶段【1 4 ，1 7 1 。 卵黄形成前期卵母细胞：细胞形成的卵黄少，核膜上核孔十分密集，核仁变小，核 膜外可见到大量核仁外排物。卵质增加不多，但细胞器却十分丰富和发达：线粒体大量 分布在核周围及卵质的表层区域，游离核糖体极为丰富，颗粒变粗，使卵质致密；囊泡 状粗面内质网数量最多，网腔中开始沉积小颗粒，环形片层也开始局部膨大、断裂形成 许多具内含物的小囊泡、大小不一的囊泡状滑面内质网也较多，网腔边缘逐渐沉积细小 颗粒物，次级溶酶体体积大，内含物丰富多样。游离核糖体和粗面内质网等胞器已活跃 参与了卵黄物质的合成，在细胞质内形成电子密度高的细小卵黄颗粒，但是滤泡尚未完 全形成i 4 , 5 , t o , t 3 - 1 6 。 卵黄形成中期卵母细胞：细胞的主要特点是体积迅速增大，核逐渐解体、消失；滤 泡已完全形成。内源性和外源性的卵黄合成都很旺盛，大量的卵黄颗粒和一些脂滴得以 快速形成。线粒体、粗面内质网、核糖体、溶酶体、滑面内质网等胞器活跃参与卵黄粒 和脂滴的合成。随着卵黄形成量的增加，细胞器数量随之减少，结果卵质中积累了大量 大小不等的卵黄粒和脂滴，并可观察到卵黄粒的融合现象。同时卵母细胞形成了覆盖于 质膜外的均匀致密的卵黄膜( 即初级卵膜) i 4 , 5 , t 0 , 1 3 - 1 6 。部分种类在卵质边缘出现一圈呈辐 射状排列的椭圆形皮质棒【1 。7 1 。 卵黄形成后期卵母细胞：卵黄合成晚期，细胞体积达最大。卵黄合成活性下降，滤 泡细胞胞质稀少、胞器不发达，残留的主要为内含致密小颗粒的粗面内质网囊泡和少量 4 第一章绪论 线粒体。胞质内不同来源的形态各异的卵黄粒之间发生了广泛的融合而形成大的卵黄 粒，这些大的卵黄粒经过消化进一步演变为内含髓样小体的卵黄粒【1 3 ，1 7 1 。 成熟期卵母细胞：胞质中充满了成熟的卵黄体、脂滴，完整的初级卵膜已形成。中 华绒螯蟹在成熟卵子中极易找到不同侧的第一次成熟分裂中期相，纺锤体长轴平行于卵 膜且与之明显靠近【l0 1 。东方扁虾卵母细胞成熟的形态学依据：胞内充满着内含髓样小体 的大而致密的卵黄粒，绝大部分的胞质被排挤到卵子的四周；卵壳己形成；卵质膜发出 的微绒毛已发生回缩并在卵壳中留下许多孔道1 1 3 】。 1 1 4 卵子发生中的物质积累 十足目甲壳动物的成熟卵子中贮存有大量的卵黄物质，为后代个体提供胚胎发育所 需的能量。卵黄是由蛋白质、脂类和糖类等能量物质组成，成分多样，结构复杂。因此 在卵子发生过程中除了精确的完成遗传物质的复制、分配和贮存之外，卵黄合成则是卵 子发生中最重要的生理过程。经过多年的研究与论证，目前大多数学者都一致认为甲壳 动物的卵黄合成是内源与外源共同作用完成的【1 8 。2 0 】。前者由卵母细胞通过卵内合成而产 生；后者则在卵外合成后再转入卵母细胞内而形成。 内源性卵黄物质是在卵母细胞发育过程中通过胞质中的各种细胞器卵内合成并贮 存而形成，因此来源于不同细胞器的卵黄颗粒有不同的亚显微结构特征。在长毛对虾中， 线粒体率先参与卵黄粒的形成；高尔基液泡是参与卵黄粒形成的主要细胞组分；内质网 膜囊积极参与卵黄粒的形成；溶酶体参与卵黄粒形成是长毛对虾卵黄发生的一大特点 【2 。罗氏沼虾细胞核是卵黄蛋白合成的基础；内质网具有合成和运输卵昔蛋白的功能； 溶酶体也积极参与卵黄蛋白的合成；线粒体可直接演变成卵黄粒；微丝参与卵黄粒形成 是罗氏沼虾卵黄发生的一大特点【1 6 】。凡纳滨对虾卵子属中黄卵，卵黄含量丰富，卵黄的 形成过程主要发生在卵黄发生的卵母细胞阶段，且有多种细胞组分参与了卵黄粒的形 成，细胞质中的线粒体数量迅速增加，尤其在卵核的周围更为密集，并率先参与形成卵 黄粒；核糖体的合成初产物为高电子密度的细颗粒，先在卵质中呈游离状态，随后彼此 融合成粗颗粒开始聚拢，其中一部分进入囊泡或囊腔内参与形成有膜的卵黄粒，另一部 分直接形成大小不等的致密的无膜卵黄粒；溶酶体具有很强的吞噬功能，可吞噬卵质中 的线粒体、内质网等多种细胞组分，数量众多的次级溶酶体以多种方式参与了卵黄粒的 形成【l 丌。东方扁虾核糖体率先参与内源性卵黄的形成，合成无膜卵黄粒；内质网是内源 5 河北人学理学硕十学何论文 性卵黄形成的最主要胞器，粗面内质网上的核糖体参与内源性卵黄发生；线粒体活跃参 与卵黄的发生，为内源性的卵黄发生能量，并直接参与内源性卵黄形成；溶酶体也积极 参与卵黄发生【1 3 】。红螯光壳螯虾( c h e r a xq u a d r i c a r i n a t u s ) 的溶酶体在整个卵黄发生过程 中是数量最多且参与程度较高的胞器，溶酶体酶解退化的细胞器或转运入卵母细胞的外 源性物质，形成含有絮状、脂状、小泡状、髓样等不同内含物的次级溶酶体【2 2 1 。 外源性卵黄合成是指卵黄物质由卵子之外的其他细胞、组织或器官通过卵外合成以 后，再通过某种途径转入卵子内。长毛对虾卵黄发生期间，卵黄蛋白的细胞外来源是依 滤泡细胞提供的【2 1 1 。中华绒螯蟹卵母细胞以两种不同的方式接纳卵外合成的卵黄原，在 卵巢发育早期，电子密度较高卵黄原自然容易透过纤薄且又疏松的卵巢壁外膜内的血窦 管壁，就被卵母细胞以胞吞方式接接纳进去；卵黄原还通过卵泡细胞被卵母细胞间接接 纳【2 3 1 。东方扁虾外源性卵黄物质主要通过质膜的微吞饮作用和微绒毛的吸收作用这二种 方式进入卵母细胞，微吞饮凹以断裂的方式与质膜脱离形成外具被膜的微吞饮泡进入胞 质，微吞饮泡或者相互融合、扩张，形成卵黄粒；或者与胞质内已有的卵黄粒发生融合 而参与卵黄发生；质膜能直接从外界环境中吸收部分营养物质参与外源性卵黄发生，微 绒毛的形成则大大增加了质膜吸收作用的表面积【l3 1 。凡纳滨对虾卵泡细胞的合成外源性 卵黄，卵黄发生中、后期，卵周隙中的内含物十分丰富，主要呈絮状或大小不等的囊泡 状，卵泡细胞的自身合成产物是其重要来源之一，还有一重要来源则是通过卵泡细胞从 血淋巴中转运而来；卵周隙中的外源性内含物将被卵母细胞的卵质膜以微吞饮的方式摄 取来形成卵黄粒【1 7 】。锯缘青蟹卵母细胞外源性卵黄物质的合成是以卵母细胞表面出现的 胞饮作用为特征的，且由卵泡细胞直接参与此过程；在初期胞饮作用只发生于卵母细胞 表面的区域，随着胞饮作用的加强，在卵母细胞的表面形成一种链锁状结构，大大提高 了卵母细胞从卵泡细胞吸收卵黄物质的效掣2 4 1 。 1 2 卵黄蛋白的生化性质 卵黄蛋 刍( v i t e l l i n ，v n ) 是某些动物雌体在生殖时期所产生的种蛋白，是卵黄的主 要成分。对于甲壳动物而言，卵黄蛋白是幼体生长发育所必需的营养物质。目前，人们 已经对十足目甲壳动物中的许多种类，如中国明对虾、斑节对虾( pm o n o d o n ) 、凡纳滨 对虾、日本囊对虾僻j a p o n i c s ) 及淡水中的罗氏沼虾、日本沼虾的卵黄蛋白进行了研究 1 2 5 - 3 4 ：2 0 0 4 年李荷迪等对红螯光壳螯虾卵黄磷蛋白进行纯化鉴定研列3 5 】；2 0 0 5 , - 一2 0 0 6 6 第一章绪论 年谢松对克氏原螯虾( p r o c a m b i u sc l a r k i i ) 和三梭子蟹( p o r t u n u st r i t u b e r c u i a t u s ) 的卵黄 蛋白也进行了研列3 8 】；2 0 0 9 年穆淑梅又对中华锯齿米虾( d e n t i c u l a t as i n e n s i s ) 卵 黄蛋白的部分生化性质进行研究【3 9 】。研究一般认为，卵黄蛋白是一种糖脂类胡萝卜素蛋 白( 1 i p o g l y c o c a r o t e n o p r o t e i n ) ，这可以作为鉴别卵黄蛋白的依据。 1 3 卯黄蛋白原 卵黄蛋白( v 曲原是特异地存在于非哺乳类性成熟的卵生雌性动物血液中的一种蛋 白，是几乎所有卵生动物卵黄蛋白的前体，与卵黄蛋白有着相似的生物化学特性和免疫 原性。v g 最初是p a n 等人【4 0 1 1 9 6 9 年对雌性昆虫血液淋巴蛋白的特称，后来这一名称被 广泛用于特指雌性动物血浆中卵黄蛋白原。v g 为正在发育的胚胎提供氨基酸、脂肪、 碳水化合物、维生素、磷和硫等营养和功能性物质，还能促进培养中的动物卵母细胞的 生长和分化。近年来，将卵黄蛋白原作为环境内分泌干扰物质的“生物标记物”已成毒理 学研究的热点问题。环境内分泌干扰物( e n v i r o n m e n t a le n d o c n n e d i s r u p t i n gc h e m i c a l s ， 简称e d c s ) 是指由于人类的生产和生活所释放到周围环境中，对人体和动物体内原本营 造的正常激素功能产生作用，从而影响内分泌系统的化学物质【4 1 4 2 】。它们在环境中存在 的浓度常常很低，却能导致各种生物的性激素分泌量下降、活性减弱、精子数量减少、 生殖器异常、癌症等发病率的增加，并影响到各种生物的性行为、生殖功能、免疫系统 和神经系统等【4 3 - 4 9 , 6 2 】。因此建立方便、经济、灵敏的环境类激素筛选和活性检测方法， 特别是寻找高效、特异、灵敏的生物标志物已成为环境内分泌干扰物质研究的重点。卵 黄蛋白原作为内分泌干扰物质的标记物具有以下几方面优势。首先卵黄蛋白原对外源雌 激素反应具有高度特异性。另外某些具有抗雌激素活性的外源性化学物能干扰雌性动物 体内卵黄蛋白原的生成，据此可检测具有抗雌激素活性的物质。其次以卵黄蛋白原作为 生物标志的筛选方法具有高度灵敏性。再次标本的取材灵活广泛，卵黄蛋白原定量检测 的样品既可采用动物血浆、肝组织和整体匀浆，也可通过细胞培养获侧6 3 - 7 2 1 。 1 4 研究目的及意义 中华锯齿米虾，隶属甲壳纲( c r u a s t a c e a ) ，十足目( d e c a p o d a ) ，真虾部( c a r i d e a ) ，匙 指虾科( a t y i d a e ) ，米虾属，是一种营淡水生活的小型虾类，在我国广泛分布【7 3 1 。中华锯 齿米虾具有生长迅速，生命力顽强，生长周期短，容易饲养等特点，是一种优良的实验 材料。目前国内外许多学者对十足目游泳亚目的卵巢发育和卵子发生做了大量的研究。 7 河北大学理学硕+ 学传论文 但有关中华锯齿米虾卵黄发生过程的研究还未见相关报道，对中华锯齿米虾生殖发育的 调控机理仍然不是十分清楚。利用透射电镜和免疫酶组化技术系统研究中华锯齿米虾的 卵黄发生过程，以期对中华锯齿米虾生殖生物学的进一步