斑马鱼相关实验操作.docx

斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的 了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。最适产卵水温为28.5，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。斑马鱼具有下列特点：1、 繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。2、 小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。3、 是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。4、 体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。5、 胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。6、 发育周期短，在28.5温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。三、实验器材和材料 斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。曝气水10L。性成熟雌、雄性斑马鱼。四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。2、曝气水 将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。一般按2 : 1的比例选择健康的性成熟雄鱼和雌鱼用于交配。选择好的雌、雄鱼放到同一个水槽箱或水盆中，用隔板或者筛网栏隔离。在养鱼房之外，可用黑布将整个塑料盆或者水槽箱盖住，使光线不能透过而进行黑暗处理。黑暗处理开始的时间根据第二天准备开始进行试验的时间和产卵的光周期而定，保证黑暗处理时间为10小时即可。例如22:00开始，第二天早上约8:00揭开黑布。4、交配产卵黑暗处理10小时后进行光照，撤去隔离筛使雌雄鱼混合，并加入金鱼藻作为产卵的鱼巢。雌、雄鱼在光照后很快出现交配追逐并开始产卵，发现产卵后，用胶头滴管将胚胎吸出放入有曝气水的培养皿中进行快速漂洗后，在曝气水中于28进行胚胎培养。随后立即观察和记录受精卵的变化和胚胎发育的变化过程和时序。五、斑马鱼胚胎发育的观察的基本内容和作业鱼类的卵是端黄卵，进行盘状卵裂，通过观察斑马鱼从受精卵发育成具有自主生活能力的个体的过程了解端黄卵受精后的变化过程和盘状卵裂类型胚胎卵裂和形态模式形成的特点和过程。具体内容包括观察、作图并记录下述发育过程和时序：1、受精卵的变化和胚盘形成的过程；2、卵裂的方式和多细胞胚胎囊胚的形成；3、原肠形态发生运动囊胚细胞经过广泛的、全局性的定向细胞运动形成原肠胚和胚胎的基本形体模式的方式、特点和过程； 4、器官发生脑、眼睛，循环系统，消化系统，骨骼，肌肉等主要器官和系统形成的过程和时序。附录：斑马鱼胚胎发育图谱和时序（引自Kimmel等，1995）参考文献：Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn 1995; 203:253-310.基因表达研究的显微操作技术一、实验目的通过显微操作将目标基因的DNA或者RNA分子注射到受精卵中，以观察其对胚胎发育的影响。这种显微操作技术是研究基因在胚胎发育中功能的重要手段。本实验的目的是了解和掌握显微操作的基本技术。二、实验器材和材料显微注射仪，体视镜，200ul移液器，100ul移液器，2.5ul移液器，注射试剂，封口膜，注射专用器皿，注射针，拉针仪。三、实验内容和程序1、体视镜操作：体视镜操作主要是通过调整焦距以及两个目镜之间的距离来保证视野内出现清晰且立体的景象。 2、注射仪的操作：注射仪是由定量控制器，显微注射器，手动操作仪以及固定支架等部分组成的精密仪器（图3-1）。控制器参数设置界面如图3-2。定量控制器与电源、显微注射器等的接口如图3-3。图3-1：显微操作系统图3-2：定量控制器面板Output 1-4对应的信号输出端口，绿灯亮表示相应端口有信号输出；I/W 注射/吸样；VOLUME SET预设的注射或者吸入注射针的样品体积；VOLUME COUNTER 实际注射进胚胎或者吸入注射针的样品体积；RATE设置的吸入或者注射速率；DEVICE TYPE连接的仪器类型（本实验中设置为”K”）；G/N/D 端口同时输出信号/不同时输出信号/禁用端口；RUN/STOP 开始或者暂停工作。图3-3定量控制器背面接口POWER ON/OFF 开关；RS232/FOOT SWITCH 外接控制器端口；OUTPUT 信号输出端口，对应图2的OUTPUT 1-4。手动操作仪主要用于控制注射针的移动和角度，操作方式如图3-4所示。图3-4 手动操作仪操作示意图注射针通过垫圈和电极保护套连接和固定到注射器上。图3-5 电极保护套及将注射针固定到注射器上的垫圈3、实验步骤（1）通过斑马鱼人工催产准备胚胎（可以直接用受精卵，也可以用脱膜的受精卵）。（2）注射针的准备：在斑马鱼产卵的同时组装注射针。注射针是用特制的电极毛细管用电热拉针器拉制而成，其尖细的前端是封闭的，在使用前需要截掉针尖前端的封闭部分；然后在显微镜下观察截断后针头的大小，选择有斜面（参考普通医用针头），大小合适实验需要的注射针。针头粗对受精卵的损害相对较大，但过细则容易造成堵塞。然后使用特制的移液器枪头向注射针内灌满石蜡。（3）注射针的安装：卸下操作仪的电极保护套及三个垫圈后，将保护套及较大的黑色垫圈套按大头在上，小头在下的方向依次套在注射针上。其他两个垫圈按照黑在上，白在下的顺序套在注射器的推杆上。将注射针套入到注射器的推杆上（此步要小心操作，电极很脆弱，不能用力过度），然后将固定的电极保护套旋紧即完成注射针的安装。组装完成后，调整控制仪参数，先排出一定体积的石蜡（一般排2500nl）确保注射针的前端没有气泡。（4）注射样品的吸取：用干净的滤纸除去针头的石蜡，剪取合适大小的封口膜，将注射用的试剂吸取数微升至封口膜上，在体视镜下开始吸样（吸取样品体积，速率要先设置好）。吸样结束后，先排除50-100nl的样品，再设置需要注射的参数。（5）注射操作：将胚胎放置在注射专用器皿，并将待注射胚胎移动到视野内。调节手动操作仪的旋钮，将注射针头插入到胚胎的胚胎中后（插入角度以45-60未佳），按定量控制器的注射按钮或者脚踏板将样品注入到胚胎中；约以秒钟后，调节手动操作仪的旋钮将注射针头从胚胎中拉出完成注射。然后移动注射器皿将第二个胚胎移植到注射针头下，进行下一次注射。（注射在没有脚踏板的情况下需要两个，一个人注射，另一个负责按定量控制仪以完成注射，期间可以交换操作，保证每个人都熟悉基本操作技术）。完成注射后，调整参数将电极收回，卸下注射针，关闭仪器并用玻璃保护罩罩住。四、注意事项：1、实验前需要先熟悉仪器，在老师指导下进行操作练习。只有经过长期练习才能熟练使用显微注射仪。刚开始做尽力做到能将样品送到胚胎内部，可以通过共注射有颜色的试剂（如酚红之类）来第一时间观察样品是否进入胚胎。之后再尽量尝试把样品注入胚盘，再然后就是同时提高注射的速度和精度。2、针头的大小应根据实验需要进行选择。3、尽量能在1-2细胞期将样品注入到胚盘。由于鱼类的胚胎在16细胞以前，细胞与细胞之间的细胞质是连通的，只要将样品送入胚盘都是有效果。但是实际注射时，时期越早越好，最晚在分裂到8细胞就停止注射。 基因表达与形体模式形成一、实验目的：基因表达的严格时空控制是发育机制的核心。本次实验人工通过显微注射使斑马鱼-catenin-2基因在胚胎发育早期过表达，干扰该基因表达的时空模式，然后观察和比较-catenin-2基因过表达胚胎与野生型胚胎发育的差异，了解基因表达的时空控制在斑马鱼形体模式形成中的重要性。二、实验器材和材料：1、实验器材：体视镜，显微注射仪，28.5恒温水浴设备，37恒温水浴锅，PH值测定仪，水平拉针仪，斑马鱼养殖设备（加热棒，曝气设备）等。培养皿（中号，大号），胶头滴管若干，移液枪。2、溶液及配制：（1）1PBS: 将20PBS用双蒸水稀释20倍，高温高压灭菌，室温放置备用。使用前调节至28.5。（2）0.25%胰蛋白酶：准确称取0.5g胰蛋白酶，0.02g EDTA溶于200ml的1PBS，37水浴充分溶解1h,4放置备用。使用前加热至28.5。（3）1Hanks液: 称取0.4gKCl, 8.0gNaCl, 0.67g Na2HPO47H2O, 0.6g KH2PO4, 1.44gCaCl2, 1.23g MgSO47H2O, 溶于800ml蒸馏水中，充分溶解。使用前加入0.35g NaHCO3，加水定容至1L，用HCl调至pH 7.2，4保存。用于斑马鱼胚胎培养时加热至28.5，并加入抗生素（10万单位/升的氨苄青霉素，5万单位/升的氯霉素）。3、注射样品准备：以BstXI单酶切后的pcs107+zf-catenin-2 ORF 线性质粒为模板，用Ambion的体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit 转录全长的-catenin-2 capped mRNA。随后使用Roche公司的Mini Quick RNA Columns 纯化 capped mRNA。检测合成的RNA的质量和浓度后，-80保存，备用。使用DEPC水前将-catenin-2 capped mRNA 稀释至所需浓度（400-600ng/l），冰上放置。三、实验步骤：1、斑马鱼胚胎的获得斑马鱼在实验室条件下至于28.5恒温水浴养殖，以高蛋白冰血赤虫和固体饲料作饵食，设置光照周期为10h黑暗/14h光照，性成熟后按雌雄分开养殖。催产前一天晚上，挑选2：1比例的雄鱼和预产卵雌鱼分开养殖，按照光照周期次日开始光照后雌雄混合，光照刺激15分钟左右即可开始收集受精卵。2、斑马鱼胚胎受精膜的去除斑马鱼卵子受精后几分钟，受精卵外围会举起一层受精膜保护胚胎，受精膜的存在不影响观察胚胎发育和模式形成，但不利于显微注射及其它后续实验，所以部分胚胎可以先利用胰蛋白酶脱膜。在开始光照刺激产卵前1小时前，将4中的0.1x Hanks液，0.25%的胰蛋白酶以及1xPBS溶液取出，将其加热至28.5。将收集的斑马鱼受精卵立即放入1PBS溶液中漂洗一次后，吸尽PBS溶液后加入 0.25%胰蛋白酶溶液，于28.5消化处理并在显微镜下实时观察脱膜情况。一般处理大约10 min后，大部分受精卵的卵膜被消化，立即将脱膜后的胚胎小心转移到新鲜的曝气水中漂洗4次以去除残留酶液。最后将胚胎放入盛有0.1Hanks液的培养皿中，28.5培养，用于注射或观察。3、显微注射使用日本Narishige公司的PN30水平拉针器将毛细管拉成显微注射用针（拉针参数为heater:80，sub:50，main:56）。注射前将针尖在滤纸上轻轻划一下，形成一个断面以适合注射。用移液器将针内注满液体石蜡并将针安装显微注射仪上，排出一定体积的石蜡后将配制好的样品吸入到毛细管里，准备注射。胚胎脱膜后在1-2细胞期进行注射，注射体积设定为1.15nl/每胚胎。野生型对照组中每个胚胎注入同样体积的无菌水。4、 胚胎培养注射完成后将胚胎转入已加抗生素的0.1Hanks液中于28.5培养，去除未受精的胚胎，每隔2-3h换液一次。四、胚胎发育观察和作业1、从原肠期至器官发生期，在体视镜下进行观察野生型对照组和-catenin-2 capped mRNA注射组胚胎发育和形体模式形成的差异。2、在受精24h后统计二者中畸形胚胎和正常胚胎的比例，并在体视镜下拍照。3、根据野生型对照组和实验组中胚胎形体的差异分析-catenin-2过表达对胚胎形体模式形成的影响。五、注意事项：1、体外合成的capped mRNA容易降解，相关的离心管、吸头等需DPEC处理去除RNA酶后方可使用。吸样前后均需将RNA置于冰盒上。2、脱膜处理不当及容造成卵损伤。因卵膜内的压力比膜外大，脱膜不充分时移动卵子会导致细胞质从破损处强行挤出而使卵子损坏。时间过长则胰蛋白酶会对胚胎的细胞膜造成损伤。因此必须在显微镜下实时监控脱膜的过程。待大部分胚胎的卵膜基本上被溶解的时候才开始进行漂洗。漂洗时操作要轻而快，脱膜后的胚胎必需保持在水中，一旦离开水或者在水的表面都会使受精卵立即崩解。 基因表达的整胚原位杂交分析一、实验目的：在胚胎发育过程中基因都是按严格的时空模式进行表达。本次实验以斑马鱼脊索中胚层标记基因ntl为例，进行整胚原位杂交分析其在斑马鱼胚胎原肠期的空间表达模式。二、mRNA原位杂交的原理：RNA原位杂交是运用cDNA或寡核苷酸等探针检测细胞、组织和胚胎内目标基因mRNA表达的一种原位杂交技术，它能够将目标基因在胚胎上表达的部位直观而明确的展现出来。其基本原理是：在胚胎细胞和组织结构保持不变的条件下，用与目标基因mRNA互补并连接了地高辛等标记物的反义序列作为探针，在胚胎上与待测目标基因的mRNA结合而形成杂交体（Hybrids）；然后再用标记物的识别抗体，通过组织化学或免疫组织化学方法在形成杂交体的位置形成可在显微镜下观察到的杂交信号，从而确定目标基因的空间表达模式。三、实验器材和材料：1、实验器材：体视显微镜，28.5恒温水浴设备，恒温水浴锅，PH值测定仪，斑马鱼养殖设备（加热棒，曝气设备），分子杂交炉，真空泵，水平摇床等。培养皿（中号，大号各5组），胶头滴管若干，移液枪，2ml 离心管（无DNase/RNase）,锡箔纸等。2、溶液配制：（1）1PBS；（2）0.25%胰蛋白酶:准确称取0.5g胰蛋白酶，0.02g EDTA溶于200ml的1PBS，37水浴充分溶解1h,4放置备用。使用前加热至28.5。（3）1Hanks液:称取0.4gKCl, 8.0gNaCl, 0.67g Na2HPO47H2O, 0.6g KH2PO4, 1.44gCaCl2, 1.23g MgSO47H2O, 溶于800ml蒸馏水中，充分溶解。使用前加入0.35g NaHCO3，加水定容至1L，用HCl调至pH 7.2，4保存。用于斑马鱼胚胎培养时加热至28.5，并加入抗生素（10万单位/升的氨苄青霉素，5万单位/升的氯霉素）。（4）4%PFA(wt/vol):称取20g多聚甲醛(paraformaldehyde PFA)溶于经DEPC处理的500ml 1PBS溶液，65水浴加热，持续搅拌至溶液澄清，冷却至室温，冰上过滤、分装，-20放置。（5）PTW: 1PBS,0.1%Tween-20(vol/vol)。（6）20SSC:购自上海生工，4放置备用（7）10%CHAPS: 5g CHAPS粉末（上海生工）溶于50ml RNase-free 双蒸水中，分装，-20放置。（8） 100mg/ml Heparin: 称取100mg Heparin（上海生工）溶解于1ml RNase-free 双蒸水中。（9）10mg/ml Yeast tRNA : 称取2 mg Yeast tRNA(Roche)溶于2 ml RNase-free 双蒸水，分装，-20放置。（10） 10% Tween-20（vol/vol）：5ml Tween-20中加入45ml RNase-free 双蒸水。（11） 5M NaCl:称取146.1gNaCl（上海生工），加水定容至1L，充分溶解，灭菌后室温保存。（12） 1M Tris-HCl：称取121.1gTris置于1L烧杯，加入800ml双蒸水搅拌溶解，用HCl调至pH9.5,定容至1L，灭菌后室温保存。（13） 1M MgCl2：95g MgCl2粉末溶于1L双蒸水中，灭菌后室温保存。（14） 杂交液（Hybridization mix, HYM）：50%去离子甲酰胺，1.3SSC,5 mM EDTA, 0.2% Tween-20，100g/ml Heparin, 50g/ml Yeast tRNA。（15） Blocking Buffer：1PBS，2% Sheep Serum，2 mg/ml BSA，0.8% GoatSerum，0.1% Tween-20(vol/vol)。（16） Staining Buffer：100 mM Tris-HCl(pH 9.5),50 mM MgCl2,100 mM NaCl,0.1% Tween-20(vol/vol)。3、杂交用RNA探针的制备：用位于插入片段5端的限制性内切酶对已构建好的重组载体pB-zf ntl ORF进行单酶切，轻轻混匀后置于37水浴酶切4h后，取1l点样，检测是否酶切完全，然后使用PCR纯化试剂盒(Axygen)回收线性质粒。以线性化的重组载体为模板，采用Roche公司的体外转录试剂盒转录得到地高辛（DIG）标记的反义RNA探针。37水浴反应2h，加入DNase I消化质粒模板，37孵育15-20分钟。将上述反应体系用Roche公司的Mini Quick Spin RNA Columns进行纯化。最后将得到的ntl探针进行电泳检测，加入等体积的去离子甲酰胺，测定浓度，-80保存。四、实验步骤：1. 斑马鱼胚胎的获得： 参照实验六2. 斑马鱼胚胎受精膜的去除：斑马鱼卵子受精后几分钟，受精卵外围会举起一层受精膜保护胚胎，受精膜的存在不影响观察胚胎发育和模式形成，但不利于显微注射及其它后续实验，所以部分胚胎可以先利用胰蛋白酶脱膜。在开始光照刺激产卵前1小时前，将4中的0.1x Hanks液，0.25%的胰蛋白酶以及1xPBS溶液取出，将其加热至28.5。将收集的斑马鱼受精卵立即放入1PBS溶液中漂洗一次后，吸尽PBS溶液后加入 0.25%胰蛋白酶溶液，于28.5消化处理并在显微镜下实时观察脱膜情况。一般处理大约10 min后，大部分受精卵的卵膜被消化，立即将脱膜后的胚胎小心转移到新鲜的曝气水中漂洗4次以去除残留酶液。最后将胚胎放入盛有0.1Hanks液的培养皿中，28.5培养，用于注射或观察。3. 胚胎材料的收集：体视镜下观察斑马鱼胚胎发育情况，发育时期的确定参照Kimmel1的划分标准，取原肠中晚期（70-90%下包）胚胎进行实验。用大口径吸管选取30颗左右的胚胎置于装有4%PFA的EP管中，4固定过夜。4. 斑马鱼胚胎整胚原位杂交整胚原位杂交按照Thiss的方法2进行。具体步骤包括胚胎固定和预处理、复水和杂交、洗脱和孵育抗体以及显色等。（1）胚胎的预处理(a) PFA固定后的胚胎，用PTW溶液漂洗2次，5min/次。(b) 脱水。使胚胎依次经过25%，50%，75%，100%的甲醇/PTW溶液，5min/次。然后100%甲醇洗3次，10min/次。(c) 将胚胎置于新鲜的100%甲醇，-20保存。可放置数个月。(2) 复水和杂交 （以下溶液若无确切说明，每次用量为1ml）(a) 复水，即将100%甲醇依次置换成75%，50%，25%的甲醇/PTW溶液，5min/次，然后用PTW溶液洗2次，5min/次,室温进行。（b）用10g/ml的蛋白酶K/PTW对胚胎进行消化。处理的时间依胚胎发育时期而异，但体节期之前的胚胎一般不进行消化处理。(c) 4%PFA再固定，室温30min以上。(d) 用PTW洗3次，5min/次，然后将胚胎转移至一个装有新鲜的PTW溶液的2ml离心管中。(e) 用400l PTW/HYM（1：1）混合液洗涤胚胎，使之沉在管底。然后再用400l 100%杂交液洗一次。(f) 将胚胎转移至含有400l新鲜杂交液的EP管中，65-70预杂交1-4 h。(g) 吸出预杂交的HYM（可回收），加入已经预热并含有终浓度为0.1-1 g/ml RNA探针的杂交液，分子杂交炉中65杂交过夜。(3) 洗脱并孵育抗体准备70水浴、干浴，将杂交炉设置为70。（以下溶液每次用量为1ml）(a) 吸出含有探针的杂交液后，用新鲜的杂交液快速洗涤胚胎一次。(b) 依次将溶液置换成66% HYM/33% 2SSC，33% HYM/66% 2SSC， 2SSC溶液，70，放置15 分钟(c) 置换成0.2SSC溶液，70，放置30 分钟(d) 置换成0.1SSC溶液，70，放置30 分钟(e) 置换成66% 0.05SSC/33%PTW，室温，放置10 min。(f) 置换成33% 0.05SSC/66%PTW，室温，放置10 min。(g) 室温用PTW润洗胚胎2次，每次5分钟 (h) 将胚胎置于Blocking Buffer中，于室温孵育胚胎3小时以上。(i) 按1：5000的比例