植物体内磷主要以有机磷如核酸.docx

植物体内磷主要以有机磷如核酸、磷脂、植素等的形态存在于植物组织中，有机磷须经干灰化或湿灰化分解转变为无机正磷酸盐。溶液中磷一般用比色法测定。湿灰化应用不同比例的HNO3、H2SO4、HClO4的方法较为普遍，湿灰化法的消煮温度不会超过混合酸的沸点，灰分元素不会形成难溶的硅酸盐，而且当用H2SO4或HClO4消煮时，可使SiO2充分脱水且使其吸附作用降至最低限度，不致造成灰分元素测定产生显著的负误差。但是由于试剂用量大，会带来污染的危险，试剂空白值大。当然加有HNO3的湿灰化法， 则不能在消煮液中同时测定氮。在干灰化法中，所用的温度有所不同，一般建议灰化温度不超过500，而时间为28h，近年来，改进的干灰法中， 添加一些“助灰化剂”，在灰化时通O2，添加KHSO4等，帮助灰化；干灰化添加试剂量少，污染的可能性比湿灰化小，而且简便易行。对于植物全磷的测定用H2SO4- H2O2消煮法，同时测定氮、磷和钾较为方便。总之，方法的选择应根据测定元素的各类、具体条件来决定。溶液中磷的测定，最常用的钼蓝比色法和钒钼黄比色法，可根据样品中磷的含量选用测定方法，当磷的含量高时，选用钒钼黄法为佳，反之则可用钼蓝法。 13.2.2.1植株中磷的测定(H2SO4- H2O2消煮，钒钼黄比色法)13.2.2.1.1方法原理植物样品经H2SO4- H2O2消煮分解制备待测液(同13.2.1.1.4)。待测液中正磷酸能与偏磷酸盐和钼酸盐在酸性条件下作用形成黄色的杂聚化合物钒钼酸盐，其组成沿不能十分肯定，有人认为是P2O5V2O522MoO3nH2O。溶液的黄色很稳定，其深浅与磷含量成正比，可用比色法测定磷的含量。比色时可根据溶液中磷的浓度选择比色波长400490nm，磷的浓度高时选择较长的波长，较低时选用较短的波长。钒钼黄法要求比色液中酸的浓度(即终浓度)很宽，极限是0.041.6molL-1(H+)；酸度太高时显色不完全或不显色，太低时则可能生成沉淀或其它物质的颜色。钒酸盐的终浓度范围是8.010-52.210-3 molL-1，通常用后一种浓度。钼酸盐的终浓度范围是1.610-35.710-3 molL-1。在正常的室温变化范围内对黄色强度无影响。黄色发生很快，在最初15min内会降低约1.3%，以后至少2h内很稳定，在24h内也无显著变化。本法操作简便快速，准确度和重复性较好，相对误差约为13%；灵敏度较钼蓝法低，适测范围广，约为120 mgL-1；对酸的浓度要求不严格，容易控制，在HNO3、HCl、H2SO4、HClO4等介质中都可适用；干扰离子少，特别是Fe3+的允许量远高于钼蓝法，因此该法广泛用于植物和有机肥料样品中磷的测定。13.2.2.1.2主要仪器：消煮管(瓶)；控温消煮炉；分光光度计。13.2.2.1.3试剂1. 钒钼酸铵试剂：称(NH4)6MoO244H2O12.5g 溶于200mL水中。另将偏钒酸铵 (NH4VO3) 0.625g溶于沸水150mL中，冷却后，加入浓 HNO3 125mL，再冷却至室温。将钼酸铵溶液缓慢地注入钒酸铵溶液中，随时搅拌，用水稀释至500mL。2. 6molL-1 NaOH溶液：称NaOH 24g溶于水，稀释至100mL。3. 2,6-二硝基酚指示剂：2,6-二硝基酚0.25g 溶于100mL水中。其变色范围是pH2.4 (无色)4.0(黄色)。变色点是pH3.1。4. 50gmL-1 P 标准溶液：准确称取经105烘干的KH2PO40.2195g，溶于水，移入1000mL容量瓶，加水至约400mL，加浓硫酸5mL，用水定容。装入塑料瓶中低温保存备用。5、其它试剂同13.2.1.1.3 。13.2.2.1.4操作步骤吸取13.2.1.1.4消煮好经过滤的待测液2025mL(含P 0.251.0mg)，置于50mL容量瓶中，加2,6-二硝基酚指示剂2 滴，用6molL-1 NaOH溶液中和至刚呈黄色，加入钒钼酸铵试剂10.00mL，用水定容。放置15min后用波长450nm，在分光光度计上比色，以空白液调节仪器零点。标准曲线制作：分别吸取50gmL-1 P标准溶液0，1.0，2.5，7.5，10.0，15.0于50mL容量瓶中，同上述操作步骤显色和测定，该标准系列P的浓度分别为0， 1.0 ，2.5， 5.0 ，7.5 ，10.0 ，15.0 gmL-1 。13.2.2.1.5结果计算 全P (%) = V 分取倍数10-4 / m 式中：从标准曲线查得显色液P的质量浓度( gmL-1 )； V显色液体积(mL)； 分取倍数消煮液定容体积(mL) / 吸取消煮液体积(mL)； m干样品质量(g)。13.2.2.2 植株中磷的测定(H2SO4-H2O2消煮，钼锑抗比色法)413.2.2.2.1方法原理植物样品经H2SO4-H2O2分解(原理同13.2.1.1.1)。溶液中的磷用钼锑抗比色法测定。13.2.2.2.2 主要仪器：同13.2.2.1.2；13.2.2.2.3试剂 1. 浓H2SO4； 2. 300gL-1 H2O2 ；3. 50gmL-1 标准溶液：同13.2.2.1.3(4)； 4. 其它试剂同5.2.2.3。13.2.2.2.4 操作步骤吸取13.2.1.1.4消煮好经过滤的待测液25mL(含P 525g)置于50mL容量瓶中，按照5.2.2.4，2调节溶液酸度和显色步骤进行比色测定。标准曲线制作：同5.2.2.4，3。13.2.2.2.5 结果计算：参照13.2.2.1.5。13.2.2.2.6注释：参照5.2.2.6。HCIO4H2SO4法5.2.2.1 方法原理用高氯酸分解样品，因为它既是一种强酸，又是一种强氧化剂，能氧化有机质，分解矿物质，而且高氯酸的脱水作用很强，有助于胶状硅的脱水，并能与Fe3+络合，在磷的比色测定中抑制了硅和铁的干扰。硫酸的存在提高消化液的温度，同时防止消化过程中溶液蒸干，以利消化作用的顺利进行。本法用于一般土壤样品分解率达9798%，但对红壤性土壤样品分解率只有95%左右。溶液中磷的测定采用钼锑抗比色法(其原理见5.2.1.2)。5.2.2.2 主要仪器 721型分光光度计；LNK-872型红外消化炉。5.2.2.3 试剂(1) 浓硫酸(H2SO4，1.84gcm-3，分析纯)；(2) 7072%高氯酸(HClO4，1.60gcm-3，分析纯)；(3) 2，6-二硝基酚或2，4-二硝基酚指示剂溶液：溶解二硝基酚0.25g于100mL水中。此指示剂的变色点约为pH3，酸性时无色，碱性时呈黄色。(4) 4molL-1氢氧化钠溶液：溶解NaOH 16g于100mL水中。(5) 2molL-1(1/2 H2SO4)溶液，吸取浓硫酸6mL，缓缓加入80mL水中，边加边搅动，冷却后加水至100mL。(6)钼锑抗试剂：A.5g.L-1酒石酸氧锑钾溶液：取酒石酸氧锑钾K(SbO)C4H4O60.5g，溶解于100mL水中。B.钼酸铵一硫酸溶液：称取钼酸铵(NH4)6Mo7O244H2O10g，溶于450mL水中，缓慢地加入153mL浓H2SO4，边加边搅。再将上述A溶液加入到B溶液中，最后加水至1L。充分摇匀，贮于棕色瓶中，此为钼锑混合液。 临用前(当天)，称取左旋抗坏血酸(C6H8O5，化学纯)1.5g，溶于100mL钼锑混合液中，混匀，此即钼锑抗试剂。有效期24小时，如藏于冰箱中则有效期较长。此试剂中H2SO4为5.5molL-1(H+)，钼酸铵为10gL-1，酒后酸氧锑钾为0.5gL-1，抗坏血酸为15gL-1。(7)磷标准溶液：准确称取在105烘箱中烘干的KH2PO4(分析纯)0.2195g，溶解在400mL水中，加浓H2SO45mL(加H2SO4防长霉菌，可使溶液长期保存)，转入1L容量瓶中，加水至刻度。此溶液为50gmL-1P标准溶液。吸取上述磷标准溶液25mL，稀释至250mL，即为5gmL-1P标准溶液(此溶液不宜久存)。5.2.2.4 操作步骤（1）待测液的制备：准确称取通过100目筛子的风干土样0.501.0g(注1)，置于50mL开氏瓶(或100mL 消化管)中，以少量水湿润后，加浓H2SO48mL，摇匀后，再加7072%HClO4 10滴，摇匀，瓶口上加一个小漏斗，置于电炉上加热消煮(至溶液开始转白后继续消煮)20min。全部消煮时间约为4060min。在样品分解的同时做一个空白试验，即所用试剂同上，但不加土样，同样消煮得空白消煮液。将冷却后的消煮液倒入100mL容量瓶中(容量瓶中事先盛水3040mL)，用水冲洗开氏瓶(用水应根据少量多次的原则)，轻轻摇动容量瓶，待完全冷却后，加水定容。静置过夜，次日小心地吸取上层澄清液进行磷的测定；或者用干的定量滤纸过滤，将滤液接收在100mL干燥的三角瓶中待测定。（2） 测定：吸取澄清液或滤液5mL(对含P，0.56gkg-1以下的样品可吸取10mL)，以含磷(P)在2030g为最好注入50mL容量瓶中，用水冲稀至30mL，加二硝基酚指示剂2滴，滴加4molL-1NaOH溶液直至溶液变为黄色，再加2molL-1(1/2 H2SO4) 1滴，使溶液的黄色刚刚褪去(这里不用NH4OH调节酸度，因消煮液酸浓度较大，需要较多碱去中和，而NH4OH浓度如超过10gL-1就会使钼蓝色迅速消退)。然后加钼锑抗试剂5mL，再加水定容50mL，摇匀。30min后，用880nm或700nm波长进行比色(注2)，以空白液的透光率为100(或吸光度为0)，读出测定液的透光度或吸收值。（3）标准曲线：准确吸取5gmL-1，P标准溶液0、1、2、4、6、8、10mL，分别放入50mL容量瓶中，加水至约30mL，再加空白试验定容后的消煮液5mL，调节溶液pH为3，然后加钼锑抗试剂5mL，最后用水定容至50mL。30min后进行比色。各瓶比色液磷的浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0gmL-1P。5.2.2.5 结果计算 从标准曲线上查得待测液的磷含量后，可按下式进行计算： 土壤全磷(P)量 (gkg-1)V/