DB14∕T 1506-2017 大豆皂苷测定方法

ICS 65.020.20 B 05 DB14 山西省地方标准 DB 14/ T 15062017 大豆皂苷测定方法 2017 - 12 - 10 发布 2018 - 02 - 10 实施 山西省质量技术监督局 发 布 DB14/ T 15062017 I 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 化学结构 1 5 测定原理 2 6 试剂 2 7 仪器设备 2 8 测定步骤 2 9 结果计算 3 10 重复性 . 4 DB14/ T 15062017 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山西农业大学提出并归口。 本标准起草单位：山西农业大学农学院。 本标准主要起草人：岳爱琴、杜维俊、赵晋忠、王敏、徐海军、张永坡、高春艳、郭东东、刁秀楠。 DB14/ T 15062017 1 大豆皂苷测定方法 1 范围 本标准规定了大豆皂苷测定的术语和定义、化学结构、测定原理、试剂、仪器设备、测定步骤、计 算结果和重复性。 本标准适用于大豆种子、根、茎、叶以及种皮中大豆皂苷的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 22464 大豆皂苷 NY/T 1252 大豆异黄酮 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1  大豆皂苷  大豆中的一类重要的次生代谢产物，是由大豆皂醇A和大豆皂醇B两种苷元和-D-葡萄糖、-D- 半乳糖、-D-木糖、-D-葡萄糖醛酸、-L-鼠李糖、-L-阿拉伯糖六种糖基及其乙酰化糖基等组成 的五环三萜齐墩果酸型皂苷。 4 化学结构 大豆皂苷根据结构不同将其分为A类、DDMP类、B类和E类皂苷，见表1。皂苷组分的化学结构见图1。  表1 大豆皂苷组成的种类 -R A类皂苷 DDMP类 B类 E类 Aa系列 Ab系列 A0系列 1. -D-葡萄糖基-(12)-O-D-半乳糖 Aa Ab A0-g g Ba Bd 2.-L-鼠李糖基-(12)-O-D-半乳糖 Au Ac A0-g g Bb Be 3. -D-半乳糖 Ae Af A0-g g Bb Be 4. -D-葡萄糖基-(12)-O-L-阿拉伯糖 Ax Ad A0-a a Bx Bf 5. -D-鼠李糖基-(12)-O-D-阿拉伯糖 Ay Az A0-a a Bc Bg 6. -L-阿拉伯糖 Ag Ah A0-a a Bc Bg DB14/ T 15062017 2 图1 皂苷组分的化学结构 5 测定原理 大豆皂苷溶液在波长205 nm处有最大吸收峰， 在一定范围内， 峰面积与大豆皂醇的浓度成正比关系。  6 试剂 6.1 试剂 6.1.1 超纯水，乙醇（分析纯），冰乙酸（分析纯），乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），冰乙酸（色 谱纯）。 6.1.2 提取液（含 0.01%乙酸的 70%乙醇溶液）：取 700 mL 无水乙醇加 0.1 mL 冰乙酸，然后加水稀释 至 1 000 mL。 6.2 标准品 6.2.1 大豆皂苷 Aa（98%）、大豆皂苷 Ab（98%）、大豆皂苷 Ba（98%）、大豆皂苷 Bb（98%）。 6.2.2 大豆皂苷标准液：准确称取大豆皂苷标准品 Aa、Ab、Ba、Bb 各 5 mg，置于 5 mL 容量瓶中，用 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。大豆皂苷标准品含量为 1 mg/mL。 7 仪器设备 所需仪器设备包括： a) 具有紫外检测器的高效液相色谱-质谱联用仪； b) 振动球磨仪； c) 感应量为 0.0001 g 的电子天平； d) 漩涡震荡仪； e) 台式离心机。 8 测定步骤 DB14/ T 15062017 3 8.1 提取 提取步骤如下： a) 将大豆各材料置于震荡研磨仪中，1 600 rpm 震荡 30 s，材料备用； b) 准确称取 0.100 g 样品，放入 10 mL 的离心管中，加入 5 mL 提取液（70%乙醇+0.01%乙酸）；  c) 放入漩涡振荡器中，漩涡震荡 2 min，浸提 24 h； d) 室温下 3 000 r/min 离心 10 min；取上清液 2 mL，用 2 倍体积的正己烷萃取脱脂，用 0.22 m 滤膜过滤后密封保存备用。 8.2 高效液相色谱-电喷雾质谱联用仪分析条件 8.2.1 色谱柱：Hypersil Gold，1502.1 mm，5 m；柱温为 30 。 8.2.2 流动相比例见表 2，A 为含 0.025冰乙酸的乙腈溶液，B 为含 0.025冰乙酸的超纯水溶液。 表2 流动相比例 时间/t/min 0 15 20 25 30 35 40 A(%) 90 70 60 60 0 0 90 B(%) 10 30 40 40 100 100 10 8.2.3 流速：1.0 mL/min。 8.2.4 检测器：二极管阵列检测器，205 nm 波长。 8.2.5 进样体积：10 L。 8.2.6 电喷雾质谱条件： 质谱扫描：负离子扫描模式； 扫描范围：4001500； 喷雾电压为：3.5 kV； 鞘气的压力：30 psi； 辅助气的压力：5 psi； 毛细传输管温度：350 。 8.3 色谱测定 在相同色谱条件下，分别将标准溶液和样品溶液注入高效液相色谱-质谱仪分析，运行完之后采用 选择性离子抽提模式抽提大豆皂苷各组分的离子色谱图，以质荷比定性，根据4个标准品的标准曲线以 峰面积进行定量。 9 结果计算 9.1 A 系列皂苷单体组分的计算 A系列皂苷单体组分的计算，见公式（1）。 DB14/ T 15062017 4 式中： Xi样品中大豆皂苷组分的含量（ug/g）； Xa大豆皂苷标准品Aa的含量（ug/mL）； Ma大豆皂苷标准品Aa的峰面积； V样品总体积，单位为微升（mL）； M样品质量，单位为克（g）。 计算结果保留三位有效数字。 9.2 B 系列、DDMP 系列和 E 系列皂苷单体组分的计算 B系列、DDMP系列和E系列皂苷单体组分的计算，见公式（2）。 Xi样品中大豆皂苷组分的含量（ug/