附加2_质粒提取和电泳.ppt

分子生物学技术 质粒提取和电泳,授课人：张侠 综合楼514,复习：质粒,质粒载体,是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链dna分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状。,筛选标记 mcs（多克隆位点） 复制原点,质粒dna与基因组dna的区别,大肠杆菌遗传物质,1、部位不同： 2、大小不同：,质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体dna的百分之一。 基因组dna分子量较大，细菌基因组约含3000个基因，5106 bp。 基因组dna容易断裂线性化。,一、质粒提取方法,质粒的大小、质粒的量、质粒的纯度要求，决定使用不同的方法。,质粒过大：温和裂解,质粒大小适中：碱裂解，煮沸法,如：,大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂,小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法,质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等 （满足各种转基因实验的要求） 要求不同的纯化方法,特点：小量质粒制备、最简便、快捷 应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）、测序、转染,质粒提取试剂盒,常用方法：小量碱裂解法,满足不同需要的试剂盒,纯化原理：离子交换柱层析等,小量制备质粒kit,大量制备质粒kit,去除内毒素制备质粒kit,二、碱裂解法提取质粒的基本原理,质粒dna较染色体dna小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点。 强碱和sds裂解细菌，碱变性条件下，染色体dna双螺旋解开而变性，而质粒dna部分解开，双链不会完全分离。 ph调至中性，变性的质粒dna又恢复到原来的构型，而染色体dna不能复性，与蛋白质一起沉淀。,怎样去除蛋白质？ 留有质粒dna的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后，用乙醇沉淀质粒dna，即得到质粒dna。,三、操 作 步 骤,1、培养细菌使质粒扩增 2、收集和裂解细菌 3、分离和纯化质粒dna,基本过程如下：,1) 细胞悬浮液（溶液i）-悬浮菌体 50 mmol/l 葡萄糖 25 mmol/l tris-hcl ph 8.0 10 mmol/l edta.na2 ph 8.0 2) 细菌裂解液（溶液ii） -裂解菌体 0.2mol/l naoh 1% sds,碱裂解法提取质粒试剂：,3）中和液（溶液iii） -中和naoh 60 ml 5mol/l 醋酸钾 11.5ml 冰醋酸 28.5ml 水 4）20mg/ml rnase-降解细菌rna 工作浓度3050 g/ml,质粒dna的制备,（1）（细菌的收获：） 取1.5 ml 工程菌液6,000转/分，离心2min， 弃上清。 （2）（细菌的裂解：） 加入200l预冷的细胞悬浮液（溶液i）悬浮细菌 加入200l细菌裂解液（溶液ii）， 颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。 注： 粘稠 ：开盖后出现拉丝现象，证明dna已经游出。 （3）（中和：）加入150l中和液，上下颠倒混合后置 冰上 5min， 12,000转/分， 4离心 5min。,碱裂解法提取质粒操作步骤,（去除蛋白质） （4） 将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的te饱和的酚/氯仿/异戊醇(25：24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 5min。 （5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min， 12,000转/分 离心 5min 。 （沉淀dna） （6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇， 置-20沉淀1015 min。,（7） 12,000 转/分离心5min。 弃上清，室温干燥质粒dna 5-10min。 （去除rna） （8）用20l含rnase的水溶解质粒dna， 轻轻吹打混合。 37 保温10min,20 l质粒dna溶液,取出10 l放于另一个离心管中备用,剩余10 l用于下一步酶切,各种溶液的作用,溶液i主要成分：edta、tris-hcl，edta是一种螯合剂，螯合ca、mg离子，作用：悬浮细胞，螯合金属离子使dnase失活。 溶液ii主要成分：naoh、sds（十二烷基硫酸钠，一种阴离子的去污剂），作用：使细胞壁肽聚糖在碱性条件下水解，核酸和pr.变性。 溶液iii主要成分：乙酸钾、冰乙酸，作用：和sds中的na离子置换，中性条件下使质粒dna复性，变性蛋白-sds+染色体dna沉淀。,取10 l 的质粒dna 加2 l 上样液混匀。 加到0.8%琼脂糖凝胶的加样孔内。 电泳条件：100v 40min。 电泳结束后照像保存，结果分析。,四、质粒dna的琼脂糖凝胶电泳,质粒dna的3种形式泳动速度:超螺旋线性开环,质粒dna的存在形式有3种: 1、共价闭环dna：常以超螺旋形式存在； 2、开环dna：质粒dna两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子； 3、线性dna：因质粒dna的两条链在同一处断裂而造成。,开环,超螺旋,线性,*转化后的培养板在37c 培养12-16h； 卫星菌：培养时间过长,重组质粒的鉴定,平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞,提取的质粒,质粒电泳筛选重组质粒,重组质粒的进一步酶切鉴定,质粒电泳,空