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文档简介

西北农林科技大学基因工程实验报告小麦GAPDH截短体重组与表达小麦 GAPDH 截短体的重组与表达(一) 实验思路:小麦总RNA提取RT-PCR扩增小麦GAPDH基因pGEX-4T-1质粒提取目的蛋白诱导表达目的蛋白Western Blotting检测表达载体构建菌株转化(二) 实验及仪器:高速冷冻离心机、低温冰箱、液氮罐、研钵、剪刀、镊子、PCR扩增仪、台式离心、恒温水浴锅、微量移液器、培养皿、带帽试管、涂布器、无菌操作台(含酒精灯、接种环、灭菌牙签等)、恒温摇床、1.4ml EP 管、培养皿、电转印、摇床、紫外灯、恒温水浴箱、电泳仪系统、凝胶成像系统等(三) 实验步骤:1. 小麦总 RNA 提取(Trizol 法)1.1 材料:小麦幼苗 1.2 试剂配制及器具处理 0.1%的 DEPC H2O(DEPC:焦碳酸二乙酯) 器具处理:试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和 1.5ml 和 0.2ml 的 EP 管等用纱布刀、镊子和药匙等 160烘烤 6h 以上。 无 RNA 酶灭菌水(DEPC H2O):用将高温烘烤的玻璃瓶 (1802h)装蒸馏水,然后加入 0.1%的 DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。 Trizol 试剂 75%乙醇:用新打开的无水乙醇和 DEPC 处理过的水配制 75%乙醇(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。 氯仿(最好用新的)。 异丙醇(最好用新的)。 1.3 操作步骤 1.3.1 Trizol 法提取总 RNA 先在研钵中加入液氮,再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末,用液氮预冷的药匙取 50100mg 组织粉末加入已盛有 1ml 的 Trizol 液的 EP 管中(注意研磨粉末总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10%),充分混合均匀。 室温放置 5min,然后加入 200L 的氯仿,盖紧 EP 管并剧烈摇荡 15 秒钟。 12000rpm 离心 10min,取上层水相于一新的 EP 管中 (千万不要将中间的沉淀层和下层液混入,否则重新离心分离),加入 500L 异丙醇,温和颠倒混匀。室温放置 10min,12000rpm 离心 10min。 小心地弃去上清液,加入 1ml 的 75%乙醇,涡旋混匀,4下 12000rpm 离心 5min。 重复步骤。 弃去上清液(尽量将残余液体除去),室温或真空干燥 510min (注意不要干燥过分,否则会降低 RNA 的溶解度)。用 30L DEPC 处理过的水将 RNA 溶解,必要时可 5560 水浴10 min。RNA 可进行 mRNA 分离,或贮存于 70%乙醇并保存于-70。 注意 整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。 加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上RNA 沉淀在70%,乙醇中可在 4保存一周,-20保存一年。2. RT-PCR 扩增目的基因 cDNA 2.1 试剂 RNA 模板 Olig (dT)18 反转录缓冲液 dNTP M-MULV 反转录酶 RNA 抑制剂(RNasin) Premix EX Taq DNA 聚合酶 PCR 特异引物 2.2 操作步骤 2.2.1 RNA 的反转录 采用 Thermo Scientific (Fermentas) RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit6L(需加入 RNA 约 1mg)Total RNA1LOligo dT primer5LH2O(nuclease-free)12L65 5min,补加下列试剂:5 Reaction buffer4LRibolock RNase Inhibitor1L10mM dNTP Mix2LRevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase1L20L42 60min70,5min,-20保存2.2.2 PCR 扩增目的基因 2.2.2.1 用表达引物扩增目的基因(25L 体系)2PCR Mix12.5cDNA1引物 GAPDH1-11引物 GAPDH1-21ddH2O9.5total25LPCR程序:95 1min95 10s58 20s 35cycles 72 45s 72 10min 16PCR产物进行电泳并做胶回收3. 核酸琼脂糖电泳分析 3.1 试剂 TAE 缓冲液(50):用时需稀释 50 倍 点样缓冲液 Loading buffer(10):含 0.25%溴酚蓝和 40%甘油 溴乙啶染色液(EB):10mg/ml 溴乙啶,注意 EB 具致癌作用。 琼脂糖 3.2 操作步骤 3.2.1 琼脂糖凝胶的制备 称 1g 琼脂糖加入 100ml TAE 缓冲液中加热熔化。 3.2.2 胶板制备 将凝胶槽清洗干净,在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖,待凝胶完全凝固后,将凝胶槽移至电泳槽(槽中已加入 TAE 缓冲液),拔掉梳子。注意:缓冲液要高出胶面 2mm。 3.2.3 点样 每个样品中加入 1/10 体积 Loading buffer(10),混匀后小心地加入点样孔中,要避免相互污染。 3.2.4 电泳 接通电源,80V 电压电泳 40min 左右,当溴酚蓝到达凝胶前沿约 2 处时停止电泳。 3.2.5 观察及照相 将凝胶取出,在 EB 溶液中浸泡 10min 后,用凝胶成像系统照相。4. pGEX 4T-1质粒的提取4.1 实验材料 含质粒的大肠杆菌 4.2 试剂 质粒提取试剂盒(天根生物科技) 4.3 操作步骤 4.3.1 培养细菌 将带有质粒的大肠杆菌接种于 LB 平板培养基上,37培养 24 h,然后从平板上挑取单菌落,接种于 5 mL 液体培养基中,37培养 12 h。 4.3.2 提取步骤 柱平衡步骤:向吸附柱 CP3 中(吸附柱放入收集管中)加入 500L 的平衡液 BL, 12,000rpm(13,400g)离心 1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子) 取1-5 mL过夜培养的菌液,加入离心管中,使用常规台式离心,12,000rpm(13,400 g)离心 1min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。 向留有菌体沉淀的离心管中加入 250L 溶液 P1(请先检查是否已加入 RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。 向离心管中加入 250L 溶液 P2,温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。 向离心管中加入 350L 溶液 P3,立即温和地上下翻转 6-8 次,充分混匀,此时将出 现白色絮状沉淀。12,000rpm(13,400g)离心 10min,此时在离心管底部形成沉淀。 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱 CP3 中(吸附柱放入收集管中),注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(13,400g)离心 30-60 sec,倒掉收集管中的废液,将 吸附柱 CP3 放入收集管中。 向吸附柱 CP3 中加入 600L 漂洗液 PW(请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(13,400g)离心 30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CP3 放入收集管中。 重复操作步骤 7。 将吸附柱 CP3 放入收集管中,12,000rpm(13,400g)离心 2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 将吸附柱 CP3 置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加 50-100L 洗脱缓冲液 EB,室温放置 2 min,12,000rpm(13,400g)离心 2min 将质粒溶液收集到离心管中。 4.3.3 琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA 5. 表达载体和目的片段的酶切5.1 试剂 BamH Sal BamH buffer 质粒提取试剂盒 5.2 操作步骤 5.2.1 在 LB 液体培养基中接入带 pGEX 4T-1 质粒的菌种,在 37下 200rpm 摇菌过夜。参见实验 8 的方法提取质粒。 5.2.2 质粒 DNA 和目的片段的酶切 管号pGEX 4T-132LPCR 产物32LddH2O10L10LBamHBuffer(10)5L5LBamH1L1LSal2L2L6. 载体和外源 DNA 的连接反应 6.1 试剂 目标 DNA 片段(PCR 扩增产物) 载体(pGEX 4T-1 酶切回收产物) 10ligation 缓冲液 T4 DNA 连接酶 ddH2O 6.2 操作步骤 取一个 200L 的 EP 管依次加入下列试剂: 2buffer:5 LpGEX 4T-1 酶切回收产物:1 LPfu扩增并酶切回收的片段:3 LT4 连接酶:1 L离心30Sec,使反应体系充分混合,1622连接 34h。7. 感受态细胞的制备及转化(氯化钙法)7.1 实验材料 大肠杆菌 Top 10 或 BL21(DE3)PlysS 7.2 试剂 LB 培养基(液体和固体培养基配置方法参见附录 2) 氨苄青霉素 7.3 操作步骤 7.3.1 感受态的制备 从 LB 平板上挑取单克隆于 5ml LB 培养基中,37 200rpm 摇菌 1216h。 将活化过的菌按 15的体积比接种到新的 LB 液体培养基中,37 200rpm 摇菌约 2h,OD 600 约为 0.4。 取 1.5ml 摇好的菌液于一个1.5ml 的 EP 管中,4 4000rpm 离心 3min,弃上清。 加 250L 0.1M 的 CaCl2(灭菌预冷)温和悬浮菌体,4 6000rpm 离心 1min 弃上清。 加 200L 0.1M 的 CaCl2(灭菌预冷)温和悬浮菌体,即为感受态细胞。置于 4 存放。12h 内使用效果最佳。 注意:无菌操作和保持低温。 培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。 如果要求高转化效率,不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。 7.3.2 转化 将盛有感受态细胞的 EP 管放置于冰上 10min,加入 10L 连接产物(若加质粒,则 只需加 1L),温和混匀,冰浴 2030min。 42热激 90S。冰浴 510min。 加入 800L LB 液体培养基,37培养 4560min。4000rpm 离心 2min,弃去 800L 上清液,剩余混匀用来涂板。 取含有 50100g/ml Amp 的 LB 平板培养基(若进行蓝白斑筛选,在培养皿上先涂布 4L 200mg/ml 的 IPTG 和 40L 20mm/ml 的 X-Gal),涂板。 37倒置培养 1620h。 8. 克隆的筛选和快速鉴定 8.1 试剂 Taq DNA 聚合酶 10buffer(含 MgCl2) dNTP Loading buffer 8.2 操作步骤 8.2.1 提取质粒测定 取一培养皿在底部标记,待转化的细菌菌落长直径到 2mm 时,用接种针(或用灭菌的牙签、小枪头)挑取单克隆菌落,划在培养皿上作好标记的方格内;同时在对应编号的培养管中接种,培养管中含5ml LB 液体培养基。 培养皿 37培养 6h 后 4保存。培养管 37振荡培养 12h 左右。用培养管中的菌液提取质粒。酶切电泳检查质粒或进行质粒 PCR 鉴定。 8.2.2 菌落 PCR 鉴定法 直接用接种针或牙签挑取少许菌体加入 20的 PCR 反应体系中。 试剂体积(20L) 2PCR Mix 10L 引物 GAPDH1-1 1L 引物 GAPDH1-2 1L 模板(单菌落) 1个ddH2O 8L PCR程序: 94 3min 94 30s 58 30s 30 cycles 72 45s 72 10min 电泳检测 PCR 产物,挑选对应的阳性克隆菌落。 9. 目的基因诱导表达 分别挑取对照菌和重组菌菌落,接入 5ml 含 Amp(100g/ml)的 LB 培养液,37振荡培养过夜。 分别取 500L 过夜培养物接入 5ml 含 Amp(100g/ml)的 LB 培养液,37振荡培养 2h 左右,至对数中期(OD 600=0.50.6)。 向诱导管中加入 IPTG 使其浓度达到 0.6mmol/L,25振荡培养过夜,收菌取样进行蛋白电泳检测。10. Western Blotting 10.1 试剂 10.1.1 细菌培养和诱导表达 LB 液体培养基 IPTG Amp 10.1.2 电泳试剂 30%丙烯酰胺溶液:丙烯酰胺 29.0g,甲叉双丙烯酰胺 1.0g,加水至 100ml,棕色瓶 4保存。 1.5 mol/L Tris-HCl 分离胶缓冲液 pH8.8(4):取18.15g Tris,用1 mol /L HCl 调pH至 8.8,加水至 100ml,4保存。 0.5 mol /L Tris-HCl 浓缩胶缓冲液,pH6.8(8):取 11.96g Tris,用1 mol /L HCl 调至pH 6.8,加水至 100ml,4保存。 电极缓冲液(pH8.3):取 14.49g 甘氨酸,3.02g Tris,加 100ml 10%SDS,加水至 1 升,4保存。 10% SDS:取 10g SDS 加水至 100ml,完全溶解后室温保存。 10%过硫酸铵溶液(AP):临用前现配。 染色液(0.25%考马斯亮蓝 R-250、50%甲醇、7%乙酸):考马斯亮蓝 R-250 2.5g、甲醇(可用无水乙醇代替)500ml、70ml 冰乙酸,溶解后补足水至总体积 1000ml。 脱色液(30%甲醇、7%乙酸):甲醇(可用无水乙醇代替)300ml,冰乙酸 70ml,补足水至 1000ml。 样品缓冲液(2):H 2O 2.4ml,浓缩胶缓冲液 1.0ml、甘油 0.8ml、10% SDS 3.2ml,beta -巯基乙醇 0.4ml,0.025%(W/V)溴酚兰 0.2ml。 TEMED(四甲基乙二胺)10.1.3 转移和杂交试剂 转移缓冲液:3.03g Tris、14.4g 的 Glycine、200ml 甲醇、定容到 1L。 TBS:0.1M 的 Tris、0.9%的 NaCl、pH 7.5 TTBS:TBS 中含 0.1%的 Tween-20 预染的蛋白 marker 硝酸纤维素膜 脱脂奶粉 anti-GST 单克隆抗体 goat-anti-mouse-IgG-HRP(HRP,horseradish peroxidase,辣根过氧化物酶) 3,3diaminobenzidine(DAB,二氨基联苯胺) DAB 增强剂 10.2 电泳 准备步骤 将凝胶板水洗涤干净,然后使其自然风干或烘干。梳子临用前用无水乙醇擦拭,让其挥发至干。安装玻璃板、板条,并将玻璃板固定在灌胶架上。 按下表配制适合浓度的分离胶,摇匀后迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶,小心在胶上覆盖一层 25%的乙醇。H2O4.1029%Acr+1%Bis3.344分离胶缓冲液(pH8.8)2.5010% SDS0.05TEMED0.0210%过硫酸铵0.02总体积10ml在分离胶聚合的过程(约 30min)中,按下表配制 5%的浓缩胶,注意 TEMED 应在灌胶前才加入。H2O3.675(ml)29%Acr+1%Bis0.658浓缩胶缓冲液(pH6.8)0.62510% SDS0.05TEMED0.0510%过硫酸铵0.05总体积5ml分离胶聚合完全后,倒去乙醇,用滤纸吸干胶面上的残余水。 灌注浓缩胶,立即插入干净的梳子,避免产生气泡。浓缩胶聚合完全后,小心拔出梳子,用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次,以除去未聚合的丙烯酰胺。将胶板固定于电泳槽上,上下槽各加入电极缓冲液。 上样 1)将实验 10 获得的细胞裂解液按 1:1 比例加入 2SDS 上样缓冲液混合,100沸水浴10min。10000rpm 离心 1min,置冰上用上清液来点样电泳。 2)用微量进样器加样,每个点样孔中加入 20L 样品,同时点蛋白 marker。每次应洗涤加样器,最后在空白加样孔中加入等体积的 SDS 样品溶解液。 电泳装好冷凝水系统,打开电源,电压为 100V,电泳直至染料到达离凝胶底部 1cm 处。 染色从电泳装置上卸下胶板,小心撬开玻璃板取出凝胶,将胶板放入考马斯亮蓝 R250染色液中染色 2h 以上。 脱色移出凝胶放入脱色液中脱色至本底无色为止。根据电泳结果分析诱导菌株有无表达目的基因。 10.3 杂交 将电泳后的胶板取出,裁取和胶等大的硝酸纤维素膜,按照:海绵-滤纸-胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序装入电转印槽中,注意硝酸纤维素膜一定要朝向正极一侧。 加入转膜缓冲液,放在冰水浴中 60V 电压(150mA)转印 2h。(整个过程应带手套操作) 取出硝酸纤维素膜用 TBS 冲洗一次。室温下,在脱色摇床上用含 10%脱脂奶粉的 TBS封闭硝酸纤维素膜 1h。倒掉封闭液,用 TTBS(含 0.1%的吐温-20)洗膜 10min。 取 1L anti-GST 单克隆抗体(一抗),稀释在 500L 含少量脱脂奶粉(2%的奶粉)的TTBS(含吐温-20,0.05%)中,将稀释的一抗均匀点在一干净的塑料膜(长和宽大约分别是膜的 2.5 倍和 1.5 倍)上,要求点一抗的面积同硝酸纤维素膜等大。小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在一抗上,注意排除气泡,同时保持湿度。25放置 2h(或 4过夜)。 用 TBS 洗膜 2 次,用 TTBS(含吐温-20,0.05%)洗 1 次,每次需持续约 10min。 取 1L goat-anti-mouse-IgG-HRP(二抗),稀释在 500L 含 2%的奶粉的 TTBS(含吐温-20,0.05%)中,同样,将稀释的二抗均匀点在一干净的塑料膜上。小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在二抗上,注意排除气泡,同时保持湿度。25放置 1h。 TTBS(含吐温-20,0.05%)洗膜 45 次,每次 5min,将硝酸纤维素膜装入杂交袋中。 在 EP 管中按 1ml BAD 增强剂兑 50L DAB 配制显色液,配好的显色液避光保存,30min内有效。 在杂交袋中加入显色液,室温下显色 230min,当有清晰的棕褐色条带出现时,用水冲洗硝酸纤维素膜终止反应,观察并分析结果,干燥保存。(四) 实验结果:1) 小麦总RNA提取及电泳分析图1-1 小麦总RNA2) pGEX 4T-1质粒的提取及RT-PCR的cDNA的电泳检测图1-2 pGEX 4T-1及目的片段cDNA3) 表达载体及目的基因酶切图1-3 pGEX4T-1及目的基因4) 克隆筛选及快速检测图1-4 重组质粒电泳图图1-5 重组质粒及双酶切电泳5) 质粒DNA双酶切及胶回收图1-6 质粒DNA双酶切回收6) Western Blotting图1-7考马斯亮蓝染色目的蛋白I- I+ I- I+ T- T+ M I- I+ I- I+图1-8 western blotting图注:I-:对照组I+:实验组(IPTG诱导)T-:Top10对照组(不加入IPTG)T+:实验组(加入IPTG)M: marker(五) 实验数据:1) 如图1-1所示,RNA提取并不是非常成功,基本出现了各沉降级的代表RNA,电泳条带最下端为18s RNA,各泳道RNA均出现降解,图中泳道的黑块为过量的loading bu

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