西北农林科技大学生命学院大三上基因工程实验报告.docVIP

西北农林科技大学基因工程实验报告小麦GAPDH截短体重组与表达小麦 GAPDH 截短体的重组与表达(一) 实验思路：小麦总RNA提取RT-PCR扩增小麦GAPDH基因pGEX-4T-1质粒提取目的蛋白诱导表达目的蛋白Western Blotting检测表达载体构建菌株转化(二) 实验及仪器：高速冷冻离心机、低温冰箱、液氮罐、研钵、剪刀、镊子、PCR扩增仪、台式离心、恒温水浴锅、微量移液器、培养皿、带帽试管、涂布器、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）、恒温摇床、1.4ml EP 管、培养皿、电转印、摇床、紫外灯、恒温水浴箱、电泳仪系统、凝胶成像系统等(三) 实验步骤：1. 小麦总 RNA 提取（Trizol 法）1.1 材料：小麦幼苗 1.2 试剂配制及器具处理 0.1%的 DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） 器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和 1.5ml 和 0.2ml 的 EP 管等用纱布刀、镊子和药匙等 160烘烤 6h 以上。 无 RNA 酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶 （1802h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的 DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 Trizol 试剂 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和 DEPC 处理过的水配制 75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 氯仿（最好用新的）。 异丙醇（最好用新的）。 1.3 操作步骤 1.3.1 Trizol 法提取总 RNA 先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取 50100mg 组织粉末加入已盛有 1ml 的 Trizol 液的 EP 管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10%），充分混合均匀。 室温放置 5min，然后加入 200L 的氯仿，盖紧 EP 管并剧烈摇荡 15 秒钟。 12000rpm 离心 10min，取上层水相于一新的 EP 管中 （千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入 500L 异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置 10min，12000rpm 离心 10min。 小心地弃去上清液，加入 1ml 的 75%乙醇，涡旋混匀，4下 12000rpm 离心 5min。 重复步骤。 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥 510min （注意不要干燥过分，否则会降低 RNA 的溶解度）。用 30L DEPC 处理过的水将 RNA 溶解，必要时可 5560 水浴10 min。RNA 可进行 mRNA 分离，或贮存于 70%乙醇并保存于-70。 注意 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上RNA 沉淀在70%，乙醇中可在 4保存一周，-20保存一年。2. RT-PCR 扩增目的基因 cDNA 2.1 试剂 RNA 模板 Olig (dT)18 反转录缓冲液 dNTP M-MULV 反转录酶 RNA 抑制剂（RNasin） Premix EX Taq DNA 聚合酶 PCR 特异引物 2.2 操作步骤 2.2.1 RNA 的反转录 采用 Thermo Scientific (Fermentas) RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit6L（需加入 RNA 约 1mg）Total RNA1LOligo dT primer5LH2O（nuclease-free）12L65 5min，补加下列试剂：5 Reaction buffer4LRibolock RNase Inhibitor1L10mM dNTP Mix2LRevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase1L20L42 60min70，5min，-20保存2.2.2 PCR 扩增目的基因 2.2.2.1 用表达引物扩增目的基因（25L 体系）2PCR Mix12.5cDNA1引物 GAPDH1-11引物 GAPDH1-21ddH2O9.5total25LPCR程序：95 1min95 10s58 20s 35cycles 72 45s 72 10min 16PCR产物进行电泳并做胶回收3. 核酸琼脂糖电泳分析 3.1 试剂 TAE 缓冲液（50）：用时需稀释 50 倍 点样缓冲液 Loading buffer（10）：含 0.25%溴酚蓝和 40%甘油 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml 溴乙啶，注意 EB 具致癌作用。 琼脂糖 3.2 操作步骤 3.2.1 琼脂糖凝胶的制备 称 1g 琼脂糖加入 100ml TAE 缓冲液中加热熔化。 3.2.2 胶板制备 将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入 TAE 缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面 2mm。 3.2.3 点样 每个样品中加入 1/10 体积 Loading buffer（10），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。 3.2.4 电泳 接通电源，80V 电压电泳 40min 左右，当溴酚蓝到达凝胶前沿约 2 处时停止电泳。 3.2.5 观察及照相 将凝胶取出，在 EB 溶液中浸泡 10min 后，用凝胶成像系统照相。4. pGEX 4T-1质粒的提取4.1 实验材料 含质粒的大肠杆菌 4.2 试剂 质粒提取试剂盒(天根生物科技) 4.3 操作步骤 4.3.1 培养细菌 将带有质粒的大肠杆菌接种于 LB 平板培养基上，37培养 24 h，然后从平板上挑取单菌落，接种于 5 mL 液体培养基中，37培养 12 h。 4.3.2 提取步骤 柱平衡步骤：向吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入 500L 的平衡液 BL， 12,000rpm（13,400g）离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） 取1-5 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心，12,000rpm（13,400 g）离心 1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。 向留有菌体沉淀的离心管中加入 250L 溶液 P1（请先检查是否已加入 RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。 向离心管中加入 250L 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。 向离心管中加入 350L 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时将出 现白色絮状沉淀。12,000rpm（13,400g）离心 10min，此时在离心管底部形成沉淀。 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm（13,400g）离心 30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱 CP3 放入收集管中。 向吸附柱 CP3 中加入 600L 漂洗液 PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（13,400g）离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3 放入收集管中。 重复操作步骤 7。 将吸附柱 CP3 放入收集管中，12,000rpm（13,400g）离心 2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 将吸附柱 CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50-100L 洗脱缓冲液 EB，室温放置 2 min，12,000rpm（13,400g）离心 2min 将质粒溶液收集到离心管中。 4.3.3 琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA 5. 表达载体和目的片段的酶切5.1 试剂 BamH Sal BamH buffer 质粒提取试剂盒 5.2 操作步骤 5.2.1 在 LB 液体培养基中接入带 pGEX 4T-1 质粒的菌种，在 37下 200rpm 摇菌过夜。参见实验 8 的方法提取质粒。 5.2.2 质粒 DNA 和目的片段的酶切 管号pGEX 4T-132LPCR 产物32LddH2O10L10LBamHBuffer（10）5L5LBamH1L1LSal2L2L6. 载体和外源 DNA 的连接反应 6.1 试剂 目标 DNA 片段（PCR 扩增产物） 载体（pGEX 4T-1 酶切回收产物） 10ligation 缓冲液 T4 DNA 连接酶 ddH2O 6.2 操作步骤 取一个 200L 的 EP 管依次加入下列试剂： 2buffer：5 LpGEX 4T-1 酶切回收产物：1 LPfu扩增并酶切回收的片段：3 LT4 连接酶：1 L离心30Sec，使反应体系充分混合，1622连接 34h。7. 感受态细胞的制备及转化（氯化钙法）7.1 实验材料 大肠杆菌 Top 10 或 BL21（DE3）PlysS 7.2 试剂 LB 培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录 2） 氨苄青霉素 7.3 操作步骤 7.3.1 感受态的制备 从 LB 平板上挑取单克隆于 5ml LB 培养基中，37 200rpm 摇菌 1216h。 将活化过的菌按 15的体积比接种到新的 LB 液体培养基中，37 200rpm 摇菌约 2h，OD 600 约为 0.4。 取 1.5ml 摇好的菌液于一个1.5ml 的 EP 管中，4 4000rpm 离心 3min，弃上清。 加 250L 0.1M 的 CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，4 6000rpm 离心 1min 弃上清。 加 200L 0.1M 的 CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。置于 4 存放。12h 内使用效果最佳。 注意：无菌操作和保持低温。 培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。 如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。 7.3.2 转化 将盛有感受态细胞的 EP 管放置于冰上 10min，加入 10L 连接产物（若加质粒，则 只需加 1L），温和混匀，冰浴 2030min。 42热激 90S。冰浴 510min。 加入 800L LB 液体培养基，37培养 4560min。4000rpm 离心 2min，弃去 800L 上清液，剩余混匀用来涂板。 取含有 50100g/ml Amp 的 LB 平板培养基（若进行蓝白斑筛选，在培养皿上先涂布 4L 200mg/ml 的 IPTG 和 40L 20mm/ml 的 X-Gal），涂板。 37倒置培养 1620h。 8. 克隆的筛选和快速鉴定 8.1 试剂 Taq DNA 聚合酶 10buffer（含 MgCl2） dNTP Loading buffer 8.2 操作步骤 8.2.1 提取质粒测定 取一培养皿在底部标记，待转化的细菌菌落长直径到 2mm 时，用接种针（或用灭菌的牙签、小枪头）挑取单克隆菌落，划在培养皿上作好标记的方格内；同时在对应编号的培养管中接种，培养管中含5ml LB 液体培养基。 培养皿 37培养 6h 后 4保存。培养管 37振荡培养 12h 左右。用培养管中的菌液提取质粒。酶切电泳检查质粒或进行质粒 PCR 鉴定。 8.2.2 菌落 PCR 鉴定法 直接用接种针或牙签挑取少许菌体加入 20的 PCR 反应体系中。 试剂体积（20L） 2PCR Mix 10L 引物 GAPDH1-1 1L 引物 GAPDH1-2 1L 模板(单菌落) 1个ddH2O 8L PCR程序： 94 3min 94 30s 58 30s 30 cycles 72 45s 72 10min 电泳检测 PCR 产物，挑选对应的阳性克隆菌落。 9. 目的基因诱导表达 分别挑取对照菌和重组菌菌落，接入 5ml 含 Amp（100g/ml）的 LB 培养液，37振荡培养过夜。 分别取 500L 过夜培养物接入 5ml 含 Amp（100g/ml）的 LB 培养液，37振荡培养 2h 左右，至对数中期（OD 600=0.50.6）。 向诱导管中加入 IPTG 使其浓度达到 0.6mmol/L，25振荡培养过夜，收菌取样进行蛋白电泳检测。10. Western Blotting 10.1 试剂 10.1.1 细菌培养和诱导表达 LB 液体培养基 IPTG Amp 10.1.2 电泳试剂 30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺 29.0g，甲叉双丙烯酰胺 1.0g，加水至 100ml，棕色瓶 4保存。 1.5 mol/L Tris-HCl 分离胶缓冲液 pH8.8（4）：取18.15g Tris，用1 mol /L HCl 调pH至 8.8，加水至 100ml，4保存。 0.5 mol /L Tris-HCl 浓缩胶缓冲液，pH6.8（8）：取 11.96g Tris，用1 mol /L HCl 调至pH 6.8，加水至 100ml，4保存。 电极缓冲液（pH8.3）：取 14.49g 甘氨酸，3.02g Tris，加 100ml 10%SDS，加水至 1 升，4保存。 10% SDS：取 10g SDS 加水至 100ml，完全溶解后室温保存。 10%过硫酸铵溶液（AP）：临用前现配。 染色液（0.25%考马斯亮蓝 R-250、50%甲醇、7%乙酸）：考马斯亮蓝 R-250 2.5g、甲醇（可用无水乙醇代替）500ml、70ml 冰乙酸，溶解后补足水至总体积 1000ml。 脱色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用无水乙醇代替）300ml，冰乙酸 70ml，补足水至 1000ml。 样品缓冲液（2）：H 2O 2.4ml，浓缩胶缓冲液 1.0ml、甘油 0.8ml、10% SDS 3.2ml，beta -巯基乙醇 0.4ml，0.025%（W/V）溴酚兰 0.2ml。 TEMED（四甲基乙二胺）10.1.3 转移和杂交试剂 转移缓冲液：3.03g Tris、14.4g 的 Glycine、200ml 甲醇、定容到 1L。 TBS：0.1M 的 Tris、0.9%的 NaCl、pH 7.5 TTBS：TBS 中含 0.1%的 Tween-20 预染的蛋白 marker 硝酸纤维素膜 脱脂奶粉 anti-GST 单克隆抗体 goat-anti-mouse-IgG-HRP（HRP，horseradish peroxidase，辣根过氧化物酶） 3,3diaminobenzidine（DAB，二氨基联苯胺） DAB 增强剂 10.2 电泳 准备步骤 将凝胶板水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。梳子临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在灌胶架上。 按下表配制适合浓度的分离胶，摇匀后迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，小心在胶上覆盖一层 25%的乙醇。H2O4.1029%Acr+1%Bis3.344分离胶缓冲液(pH8.8)2.5010% SDS0.05TEMED0.0210%过硫酸铵0.02总体积10ml在分离胶聚合的过程（约 30min）中，按下表配制 5%的浓缩胶，注意 TEMED 应在灌胶前才加入。H2O3.675（ml）29%Acr+1%Bis0.658浓缩胶缓冲液(pH6.8)0.62510% SDS0.05TEMED0.0510%过硫酸铵0.05总体积5ml分离胶聚合完全后，倒去乙醇，用滤纸吸干胶面上的残余水。 灌注浓缩胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。浓缩胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。将胶板固定于电泳槽上，上下槽各加入电极缓冲液。 上样 1）将实验 10 获得的细胞裂解液按 1：1 比例加入 2SDS 上样缓冲液混合，100沸水浴10min。10000rpm 离心 1min，置冰上用上清液来点样电泳。 2）用微量进样器加样，每个点样孔中加入 20L 样品，同时点蛋白 marker。每次应洗涤加样器，最后在空白加样孔中加入等体积的 SDS 样品溶解液。 电泳装好冷凝水系统，打开电源，电压为 100V，电泳直至染料到达离凝胶底部 1cm 处。 染色从电泳装置上卸下胶板，小心撬开玻璃板取出凝胶，将胶板放入考马斯亮蓝 R250染色液中染色 2h 以上。 脱色移出凝胶放入脱色液中脱色至本底无色为止。根据电泳结果分析诱导菌株有无表达目的基因。 10.3 杂交 将电泳后的胶板取出，裁取和胶等大的硝酸纤维素膜，按照：海绵-滤纸-胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序装入电转印槽中，注意硝酸纤维素膜一定要朝向正极一侧。 加入转膜缓冲液，放在冰水浴中 60V 电压（150mA）转印 2h。（整个过程应带手套操作） 取出硝酸纤维素膜用 TBS 冲洗一次。室温下，在脱色摇床上用含 10%脱脂奶粉的 TBS封闭硝酸纤维素膜 1h。倒掉封闭液，用 TTBS(含 0.1%的吐温-20)洗膜 10min。 取 1L anti-GST 单克隆抗体（一抗），稀释在 500L 含少量脱脂奶粉（2%的奶粉）的TTBS（含吐温-20，0.05%）中，将稀释的一抗均匀点在一干净的塑料膜（长和宽大约分别是膜的 2.5 倍和 1.5 倍）上，要求点一抗的面积同硝酸纤维素膜等大。小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在一抗上，注意排除气泡，同时保持湿度。25放置 2h（或 4过夜）。 用 TBS 洗膜 2 次，用 TTBS（含吐温-20，0.05%）洗 1 次，每次需持续约 10min。 取 1L goat-anti-mouse-IgG-HRP（二抗），稀释在 500L 含 2%的奶粉的 TTBS（含吐温-20，0.05%）中，同样，将稀释的二抗均匀点在一干净的塑料膜上。小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在二抗上，注意排除气泡，同时保持湿度。25放置 1h。 TTBS（含吐温-20，0.05%）洗膜 45 次，每次 5min，将硝酸纤维素膜装入杂交袋中。 在 EP 管中按 1ml BAD 增强剂兑 50L DAB 配制显色液，配好的显色液避光保存，30min内有效。 在杂交袋中加入显色液，室温下显色 230min，当有清晰的棕褐色条带出现时，用水冲洗硝酸纤维素膜终止反应，观察并分析结果，干燥保存。(四) 实验结果：1) 小麦总RNA提取及电泳分析图1-1 小麦总RNA2) pGEX 4T-1质粒的提取及RT-PCR的cDNA的电泳检测图1-2 pGEX 4T-1及目的片段cDNA3) 表达载体及目的基因酶切图1-3 pGEX4T-1及目的基因4) 克隆筛选及快速检测图1-4 重组质粒电泳图图1-5 重组质粒及双酶切电泳5) 质粒DNA双酶切及胶回收图1-6 质粒DNA双酶切回收6) Western Blotting图1-7考马斯亮蓝染色目的蛋白I- I+ I- I+ T- T+ M I- I+ I- I+图1-8 western blotting图注：I-:对照组I+:实验组（IPTG诱导）T-:Top10对照组（不加入IPTG）T+:实验组（加入IPTG）M: marker(五) 实验数据：1) 如图1-1所示，RNA提取并不是非常成功，基本出现了各沉降级的代表RNA，电泳条带最下端为18s RNA，各泳道RNA均出现降解，图中泳道的黑块为过量的loading bu