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生物化学实验测试班级：0641101 学号：2011212275 姓名：程婧1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理是怎样？答: 1聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（以后简称单体）在水溶液中聚合而成的亲水性高聚物，是一种透明而不溶于水并有韧性的凝胶。 2制备凝胶时需要的原料是：丙烯酰胺，亚甲基双丙烯酰胺（双体，用作交联剂）。在水溶液中用催化剂引发聚合。常用的催化剂有：二甲氨基丙腈（DMAPN）；过硫酸铵，四甲基乙二胺；过硫酸铵或加核黄素后用紫外光（波长 2537毫微米）引发聚合。 3聚合时丙烯酰胺分子通过加成反应形成长链，双体的作用是在长链之间形成交联，成为具有三维网状结构的凝胶（见图1）。所以在凝胶电泳中除了具有电泳的分离外还具有分子筛作用，从而增高了它的分辨能力。 4聚合时，根据分离的需要，可以用改变单体溶液浓度或增减双体比例的办法制成孔度大小不同的凝胶。在分离血清蛋白时，我们采用的丙烯酰胺总浓度为65%，内含单体96%（T一65，c一4%）。 5聚合物分子中含有很多酰胺基，所以凝胶具有良好的亲水性。能在水中溶胀但不溶解。 2. 蛋白质含量测定有哪些方法？其原理分别是怎样?一、染料法实验原理:在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量实验原理:在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(CO-NH2)，或与此相似的基团如CH2-NH2，CS-NH2，C(NH)NH2的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(CO-NH)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。三、酚试剂法测定血清蛋白质含量（改良Lowry法）实验原理：蛋白质分子中所含肽键在碱性条件下与铜络合生成复合物产生紫红色化合物（双缩脲反应），同时使肽链展开，蛋白质中半胱氨酸、络氨酸、色氨酸和组氨酸均能使钨酸、钼酸同时失去1个，2个或者3个氧原子，还原成多种还原型的混合酸，并且有特殊的蓝颜色（最大吸收峰波长为745750nm,反应式一）其蓝色深浅与蛋白质含量在一定范围内成正比，由此可测出样品中蛋白质的含量。同时蛋白质肽键发生烯醇化反应（反应式二）能使钼离子在pH10时螯合在肽结构中，形成复合物，从而使电子转移到混合酸的显色剂上，大大增加了酚试剂对蛋白质的敏感性。四、紫外吸收法实验原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。3. 电泳的基本原理？综述电泳是电泳涂料在阴阳两极，施加于电压作用下，带电荷的涂料离子移动到阴极，并与阴极表面所产生的碱性物质作用形成不溶解物，沉积于工件表面。它包括四个过程： 1、电解（分解）在阴极反应最初为电解反应，生成氢气及氢氧根离子OH ，此反应造成阴极面形成一高碱性边界层，当阳离子与氢氧根作用成为不溶于水的物质，涂膜沉积，方程式为：H2OOH+H 2、电泳动（泳动、迁移）阳离子树脂及H+ 在电场作用下，向阴极移动，而阴离子向阳极移动过程。3、 电沉积（析出）在被涂工件表面，阳离子树脂与阴极表面碱性作用，中和而析出不沉积物，沉积于被涂工件上。 4、电渗（脱水）涂料固体与工件表面上的涂膜为半透明性的，具有多数毛细孔，水被从阴极涂膜中排渗出来，在电场作用下，引起涂膜脱水，而涂膜则吸附于工件表面，而完成整个电泳过程4. 蛋白质分离纯化方法有哪些？（1） 根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）；密度梯度离心（蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快）；凝胶过滤(一种柱层析) （2） 利用溶解度差别分离：（等电点沉淀法）由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小)；盐溶与盐析(利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度) （3） 根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离； （4） 蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的） （5） 根据配体特性的分离亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质） (6)低温有机溶剂沉淀法: 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行5. 试述碱性磷酸酶的分离纯化的步骤与方法？步骤：1. 称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml, 进行匀浆。转入离心管，并加2ml 0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。记录体积a，取0.1ml作为A液于EP管，待测比活性用。2. 在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅拌 2min，室温放置30min，纱布过滤，置于离心管。3. 滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后3000r/min 5min。弃上清，沉淀用4ml 0.5M Mg(AC)2溶解。记录体积b。取0.1ml作为B液于EP管，待测比活性用。4. (1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上清于另一离心管。(2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min 5min，弃上清，沉淀用4ml 0.01M Mg(AC)2、NaAC混合液搅拌混悬。5. (1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上清于离心管，弃沉淀。(2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min 5min，弃上清，沉淀用3ml 0.5M Mg(AC)2溶解,记录体积c。取0.1ml作为C液于EP管,待测比活性用。6. （1）其余悬液中缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min， 取上清（弃沉淀）（2）上清中缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min，弃上清（3）沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。作为D液用于比活性测定。方法：葡聚糖G50再次纯化溶菌酶 凝胶的处理 商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需在水中溶胀，溶胀必须彻底，否则会影响色谱的均一性。故在实验前先称取5克葡聚糖G50于烧杯中加入510倍水，让其自然溶胀24小时以上，经这样处理的凝胶才能准备装柱。 装柱 用0.02 mol/L pH8.0 PBS溶液将凝胶调成稀薄的浆状液，盛于烧杯中，然后在轻微地搅拌下使凝胶缓慢地沉降于柱内，松开流出口夹子，让其