动物细胞工程课件.ppt

2.2 动物细胞工程,2.2 动物细胞工程,生产单克隆抗体,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,动物细胞工程常用的技术手段技术：,皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，1014天后就要被身体排斥。,如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？,动物细胞培养技术,从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,一、动物细胞培养 1 、动物细胞培养的概念,原理：,细胞增殖,人耳鼠,“人耳鼠”再出风头 2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。,在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。,动物细胞培养过程,1、选材：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 原因：细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。,2.将组织细胞分散成单个细胞,将组织块剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间，这样组织就会分散成单个细胞。,思考：为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,单个细胞容易和周围环境进行物质交换获得营养物质、氧气等，排出代谢废物； 分散成单个细胞培养能使细胞水平操作的其他技术得以实现 。,1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？,P44旁栏,用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。 不能用胃蛋白代替 因为两者的最适pH不同，动物细胞培养适宜的pH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（最适pH 2.0）没有活性，而胰蛋白酶(最适pH 7.2-8.4)的活性较高。,胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？,P44寻根问底,胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。,动物组织,单个细胞,细胞悬液,贴壁生长,分瓶培养,10代细胞,50代细胞,不死细胞,原代培养,传代培养,胰蛋白酶,剪碎,加培养液,接触抑制,少数癌变,少数,3. 配制细胞悬液，进行原代培养及传代培养,1、细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁。 要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 2、细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,细胞接触抑制,细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。,4.如何界定原代培养和传代培养？,原代培养: 将动物组织消化后的初次培养。 传代培养: 对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培养。,动物组织块,细胞悬液,原代培养,传代培养,胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞,幼龄动物的器官组织；动物胚胎,动物细胞培养过程,细胞贴壁 接触抑制,原代培养 传代培养,加入培养液,用胰蛋白酶等处理贴壁细胞,适宜条件,不死性细胞,多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？,P46讨 论,充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）,适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境,无菌无毒环境、充足营养（血清或血浆）、适宜温度、PH、气体环境。,4、体外培养动物细胞需要物质和环境条件,无菌、无毒的环境 对培养液、培养用具进行无菌处理； 在培养液中加抗生素； 定期更换培养液。,充的营足养 葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、 微量元素、血浆或血清,为什么要加血清呢？,温度和PH 36.50.5 ；PH = 7.27.4 气体环境O2和CO2 C02的主要作用是维持培养液的PH。 含 95% 空气加 5% CO2 混合气体,1、大规模的生产生物制品。 2、作为基因工程的受体细胞。 3、检测判断物质的毒性。 4、用于生理、病理、药理等方面的研究。,三、动物细胞培养技术的应用：,5、 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植,1、大规模的生产生物制品。 2、培养的动物细胞作为基因工程的受体细胞。 3、检测判断物质的毒性。 4、培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于 等，为 及其他疾病提供理论依据。,三、动物细胞培养技术的应用：,筛选抗癌药物,治疗和预防癌症,（五）、动物细胞培养技术的应用,（3）细胞的生理、药理、病理研究,（1） 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植,（2） 基因工程的受体细胞,植物组织培养和动物细胞培养的比较,全能性,增殖,蔗糖,动物血清,细胞株、细胞系,细胞,或细胞分泌蛋白,植物组织培养和动物细胞培养的比较,前景展望,资料一：,培养的动物细胞可以用于检测有毒物质。许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。现在动物细胞培养已经成为检测有毒物质的快速而灵敏的有效手段。,资料二：,人工关节软骨再生,1.第一次手术: 从病人关节软骨中未 受力的部分，取出一片约为葡萄干大小的健康软骨组织。 2.分离软骨细胞并经三星期的体外 培养，使细胞数增加约1020倍。 3.第二次手术: 清理软骨受损的部分，从下方骨头部位取出一片约与伤口大小相同的骨膜，缝在伤口上方，再将软骨细胞注射到骨膜下方。,资料三：,结果: 经过复健一年后即可恢复正常的生活。,二.动物细胞核移植技术和克隆动物,将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）。,1.动物细胞核移植概念：,（难度高）,克隆动物：用核移植的方法得到的动物。,(二)、体细胞核移植的过程：,请看教材P48图2-21,思考： 1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？ 2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？,M中期卵母细胞,诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成 细胞分裂和发育进程。,卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。,胚胎 移植,体细胞核移植过程 （体细胞克隆动物）,、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。,、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？,10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变,思考题,3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞,思考题,1996年，英国人Ian Wilmut成功获得体细胞克隆羊“多利”，这是世界上第一例利用成年体细胞核获得的克隆动物.,277次乳腺细胞核移植实验； 获得29个发育为8细胞的“胚”； 13头代孕母亲； 1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。,多莉羊的培育过程,3.体细胞核移植技术的应用前景：,1.加速家畜遗传改良的进程,2.保护濒危物种,3. 生产医用蛋白质及组织器官的移植,4.了解胚胎发育和衰老过程； 5、追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病,4、体细胞核移植技术存在的问题 P50,（1）成功率非常低 （2）克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷 （3）食品的安全性问题存在争议,思考与探究,1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？,细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。 所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。 同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。,思考与探究,2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？,动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力 要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头 名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为 30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目 前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般 为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。 （1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。,可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。,（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？,从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。,4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。,研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。 应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,2、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是 （ ） A获得不死性的细胞 B10代以内细胞 C原代细胞 D传代细胞,1、动物细胞工程技术的基础是 （ ） A.动物细胞融合 B.单克隆抗体 C.胚胎移植 D.动物细胞培养,A,D,课堂反馈练习,3、在动物细胞培养的有关叙述中正确的是：（ ） A、动物细胞培养的目的只是为了获得大量的细胞 分泌蛋白 B、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散 C、细胞的癌变发生在原代培养向传代培养的过渡 过程中 D、培养至50代后传代细胞遗传物质没有发生改变,B,4、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（ ）,无毒的环境 无菌的环境 培养基需要加入血清 温度与动物体温相似 需要O2，不需要CO2 CO2能调节培养液PH,A、 B、 C、 D、 ,D,5、动物细胞培养的特点 （ ） 细胞贴壁 有丝分裂 细胞分化 接触抑制 减数分裂 原代培养一般传110代 A、 B、 C、 D、,A,6、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答： （1）容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自_。 （2）容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是 ，然后用 酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是 。,动物胚胎或幼龄动物,剪碎,胰蛋白,使细胞与培养液充分接触，便于培养,（3）培养首先在B瓶中进行，瓶中的培养基成分有 _等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养到第 代，到这时的培养称为_ 。 （4）为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用 处理，然后配置成 ，再分装。 ,动物血清,10,原代培养,胰蛋白酶,细胞悬浮液,知识拓展,2.为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的是什么物质？,细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。 分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。 用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。,知识拓展,3.体细胞核移植技术为什么要选择M期的卵母细胞做受体细胞？,细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有M期卵母细胞和受精卵（合子）。早期核移植技术中常用受精卵，后来基本上用M期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于M期卵母细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺