蛋白质分离纯化技术.ppt

第二章 蛋白质的分离与纯化,1,第二章 蛋白质的分离与纯化,一、蛋白质的测定技术 紫外分光光度法 比色法 二、蛋白质的分离提取 蛋白质材料的处理 蛋白质的粗分离 蛋白质的纯化 三、蛋白质的结构解析,2,一、蛋白质的测定技术,3,定义：蛋白质浓度或含量的测定 方法： 凯氏定氮法 紫外分光光度法 比色法 双缩尿法（Biuret法） Folin酚试剂法（Lowry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法） BCA法,4,测定蛋白质含量的是我们研究蛋白质功能等方面的基础，这种技术也广泛应用于食品质量检测方面等。,在选择方法时应考虑： 实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质； 溶液中存在的干扰物质； 测定所要花费的时间。,5,一、凯氏定氮法（ Kieldahl Method）,测定蛋白质含量的经典方法。 目前测定蛋白质含量的标准方法。 测定试样中总有机氮最准确和重现性最好的方法之一。 原理： 蛋白质的含氮量约16%，含氮量因构成蛋白质的氨基酸残基的不同有所差别，在14-19%之间。 测定蛋白质样品的含氮量，乘以6.25即为蛋白质的含量（以蛋白质平均含氮量16%计算）。,6,测定分两步： 用沸浓硫酸消化，并以硫酸铜为催化剂，使碳、氢分别以二氧化碳及水蒸汽形态逸去，而氮转为铵盐。此过程需时较长，可达数小时。 加碱，并将氨自碱液中蒸至标准酸液中，测定中和氨所消耗的酸量，计算出样品中含氮量，再乘以625（经验平均值），则得蛋白质含量。,7,反应：以甘氨酸为例 CH2COOH | + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O+NH3 (1) NH2 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 硫酸铜为催化剂（促进有机含氮化合物分解完全），K2SO4以提高溶液的沸点（290 oC提高到400 oC ）。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。,8,特点： 时间较长； 蛋白质中含氮量通常并不确定，因为不同蛋白质含 氮量不相同，使得计算所得蛋白质量只是具有相当误差的近似值； 若欲得精确值，需预先将蛋白质分离，可以以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 当有其他含氮化合物时有干扰。 凯氏法有常量法、半微量法及微量法（可测样品含氮量为0.10 mg以下 ）。,9,二、紫外分光光度法,紫外（或可见）分光光度法：以溶液中物质的分子或离子对紫外（或可见）光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。,朗伯-比耳定律：A=lg(1/T)=Kbc A为吸光度,T为透射比,是透过光强度比上入射光强度。c为吸光物质的浓度 ，b为吸收层厚度。 物理意义：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比。,10,紫外分光光度法测定蛋白质含量的 实验原理 1.蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基含有共轭双键，使蛋白质具有吸收近紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。 2.蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。,11,紫外分光光度法,标准曲线：以标准蛋白的吸光度A为纵坐标，其浓度c为横坐标的标准曲线。 测出被试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。,分光光度法测量图,12,常用的方法（四种） A280法 因蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这两种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1 1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。 许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值有文献数据可查。 A238法(肽键测定法) 蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱,与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238,以A238为纵座标,蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。,13,A280与A260吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm和260nm处都有吸收，其吸收高峰在260nm附近。 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45A2800.74A260 (mg/ml) A215与A235吸收差法 215nm和235nm光吸收差值在一定范围与蛋白质浓度成正比。 用215nm和235nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差。 对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用215nm和235nm光吸收差法。 干扰物质的影响较多。,14,优点：紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 缺点： 1.测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。 2.若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。 3.蛋白质的最大吸收波长因pH的改变而有变化。,15,三、比色法（colorimetry）,定义： 以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。 比色分析对显色反应的基本要求： 1.反应应具有较高灵敏度和选择性； 2.反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定； 3.反应生成的有色化合物和显色剂的颜色差别较大等。,理论基础：朗伯-比尔定律(AKbc),16,（一）双缩脲法（Biuret法）,原理：双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物（540nm），称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。,17,紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。 测定范围为110mg/mL蛋白质。 干扰物质：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。,18,双缩脲法（Biuret法）过程,标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20-25）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。,样品的测定：取2-3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。,19,双缩脲法（Biuret法）,特点： 较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。 主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。,20,（二）Folin酚试剂法（Lowry法）,实验原理:蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu2+反应，生产紫红色蛋白质-Cu2+复合物，这一复合物中的氨基酸残基（主要是酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸）还原Folin酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐，产生钼兰和钨兰复合物的深兰色（745-750nm），颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。 此法中由于加入Folin酚试剂强化了双缩脲反应，增加显色量，灵敏度为双缩脲法的100倍。 Folin酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。,21,Folin酚试剂法（Lowry法）,优点：灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。 缺点： 1.费时间较长，要精确控制操作时间（显色随时间不断加深）； 2.标准曲线也不是严格的直线形式，干扰物质较多。由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5g。通常测定范围是20250g 。,22,Folin酚试剂法（Lowry法）,注意： 对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。如酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素、硫酸纳、硝酸纳、三氯乙酸、乙醇、乙醚、丙酮等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。 测定时，加Folin-酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性条件下稳定，上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。,23,（三）考马斯亮蓝法（Bradford法）,1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。,24,实验原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置(max),由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸和赖氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。,25,考马斯亮兰G-250,考马斯亮蓝法（Bradford法）,优点： 1.灵敏度高，比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 2.测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定。 3.干扰物质少。如干扰Lowry法的K、Na、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇等均不干扰此测定法。,26,考马斯亮蓝法（Bradford法）,缺点： 1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。 2.仍有一些物质干扰此法的测定，如：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。 注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。 校正：0.05mg /ml BSA溶液的A595约为0.29。,27,（四）二奎琳甲酸法 BCA( bicinchoninic acid)法,原理：Bicinchoninic acid (BCA)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。,28,BCA,与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定