总酚与单宁的测定.doc

一、单宁红葡萄酒颜色的稳定很大程度上取决于单宁荷花色素苷发生的缩合反应，由于这种物质的存在，葡萄酒成熟过程中的颜色趋于稳定。单宁也是呈味物质，它与多糖和肽缩合，使酒更为柔和。有氧时缩合为浅黄色，有收敛性;无氧时为棕红色，无收敛性。1、 高锰酸钾氧化法 原理：利用酒中的单宁色素和其他非挥发性还原物质，在酸性条件下，能被高锰酸钾所氧化，而酒中的单宁色素又能被活性炭吸附除掉，据此测出酒中单宁色素的含量。 试剂a.0.1mol/L高锰酸钾（1/5KMnO4）标准溶液：称取3.3g高锰酸钾，溶于100mL水中，缓缓煮沸15min，冷却后用水稀释至1000mL，置于暗处保存一周。以4号玻璃漏斗过滤于干燥的棕色瓶中。标定：准确称取0.2g（准确至0.0002g）于105110烘至恒重的基准草酸钠置入250mL三角瓶中，加100mL（8+92）硫酸溶液溶解，加热至6070，趁热用高锰酸钾溶液滴定至溶液呈粉红色。同时做空白试验。计算公式如下： 高锰酸钾浓度（1/5KMnO4，mol/L）=m/(V-V0)*0.06700)式中 m-草酸钠的质量，g V-测定时消耗高锰酸钾溶液的体积，mL V0-空白试验消耗高锰酸钾溶液的体积，mL 0.06700-消耗1mL 1mol/L高锰酸钾（1/5KMnO4）标准溶液相当于草酸钠的质量，g/mmolb.0.05mol/L高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：将0.1mol/L高锰酸钾（1/5KMnO4）标准溶液稀释至原浓度的1/2c.靛红纸试剂（靛蓝二黄酸钠，靛胭脂）：称取靛红1.5g，溶于50mL硫酸中，用水稀释至1000mL。d.粉末活性炭测定步骤用容量瓶取酒样100mL，倾入蒸发皿中，置于沸水浴中，除去挥发物（一般蒸发掉一半溶液即可），然后取下冷却至室温，返回原容量瓶中，洗涤蒸发皿34次，将洗涤液并入容量瓶中，定容摇匀，得处理液取上述处理后的酒样50mL于100mL烧杯中，加入2g左右粉末活性炭用玻璃棒搅匀，静置5分钟，过滤。滤液收集于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，得处理液。要求滤液无色透明。吸取10mL处理液，置于1000mL三角瓶中，加入水500mL及10mL靛红指示剂，以0.05mol/L(1/5KMnO4）高锰酸钾标准溶液滴定至金黄色即为终点。记下消耗高锰酸钾标准溶液的毫升数V1。同样取处理液10mL，同上操作，记下消耗的高锰酸钾标准溶液毫升数V2。计算单宁含量（以没食子单宁酸计，g/L）=（V1-V2）*c*0.04157*（1/V）*1000式中：V1-滴定处理液时高锰酸钾标准溶液的体积，mL; V2-滴定处理液时高锰酸钾标准溶液的体积，mL; c-高锰酸钾（1/5 KMnO4）标准溶液的浓度，mol/L; V-取样量，mL 0.04157-消耗1mL1mol/L高锰酸钾（1/5 KMnO4）标准溶液相当于没食子单宁酸的质量，g/mmol讨论a. 本方法测定为单宁色素的含量，也可称为“高锰酸钾氧化值”。b. 活性炭用量随酒样颜色的深浅适量增减c. 滴定速度不要太快（每秒钟一滴），但要连续，间断滴定会影响反应终点。d. 正在发酵的红葡萄酒需经过过滤后再测定，样品太浑浊会影响终点的判定。2、 福林-丹尼斯法 原理单宁类化合物在碱性溶液中，将磷钼酸和林钨酸盐还原成蓝色化合物，蓝色的深浅程度与单宁含酚基的数目成正比。如试样中含有其他酚类化合物或其他还原物质，也会被同时测定。因此，这一方法又称为多酚的测定。 试剂与仪器e. 福林丹尼斯（FolinDenis）试剂：在750mL水中，加入100g钨酸钠（NaWO42H2O）、20g磷钼酸（H3PO412MoO3）以及50mL磷酸，回流2h，冷却，稀释至1000mL。f. 碳酸钠饱和溶液：每100mL水中加入40g无水碳酸钠，放置过夜。次日加入少许少许水合碳酸钠（Na2CO310H2O）作为晶种，使结晶析出，用玻璃棉过滤后备用。g. 单宁酸标准溶液：称取0.5000g单宁酸，用水溶解，定容至100mL（5mg/mL）。h. 可见光分光光度计。i. 恒温水浴槽。 测定步骤j. 单宁的提取：取葡萄果实10.0020.00g（视单宁含量而定）破碎,于250mL三角瓶中，加水50mL，放入60恒温箱中过夜。次日将清夜过滤至250mL容量瓶中，残渣中加入30mL热水，在80水浴中提取20分钟。清夜滤入容量瓶中，再加30mL热水，在80水浴中提取20分钟。如此重复34次，直至提取液与10g/L三氯化铁溶液不生成绿色或蓝色产物为止。将容量瓶中溶液稀释至刻度，静置过夜或取一部分离心待测。k. 标准曲线的制备：称取0.5000g单宁酸，用水溶解，定容至100mL,浓度为5000mg/L，定为标准溶液。分别吸取0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10ml单宁酸标准溶液用水分别定容至50mL。上述溶液的浓度分别为0、50、100、150、250、500、750、1000mg/L。分别取1mL第二步的稀释液，加入含有70mL水的100mL容量瓶中，加入福林-丹尼斯试剂5.0mL及饱和碳酸钠溶液10.0mL，加水至刻度，充分混匀。30分钟后以空白作参比，在波长760nm处测定吸光值。（也可选650nm，本实验室通常不用650nm）。绘制曲线，以吸光值为纵坐标，以第二步中的单宁酸浓度值为横坐标绘制标准曲线。l. 试样的测定：吸取12mL(视单宁含量而定）试样提取液（或葡萄酒）的上清液，置于盛有70mL水的100mL容量瓶中，加入5mL福林-丹尼斯试剂及10mL饱和碳酸钠溶液，加水至100mL，充分混匀。30分钟后以水代替试样制成的空白作参比，在760nm（或650nm）波长处测定吸光度，由吸光度从标准曲线查处相应的单宁含量。 计算单宁含量（以单宁酸计，g/L）=c*（1/V）*250*（1/1000）*（1/m）*1000式中 c-试样吸光度从标准曲线求得单宁含量，mg/100mL; V-取提取液（或酒样）体积，ml； 250-提取液总体积，ml，酒样不乘以250； 1000-mg换算成g m-称取试样质量，g。讨论a. 本法在室温显色25分钟后颜色达最大深度，且于3h内稳定。b. 在波长650nm处比色与在760nm处比色，其结果基本相同。二、总酚1 原理葡萄酒中的酚类来自葡萄树和陈酿时木桶浸出的单宁型的复杂物质。酚类以其特殊的芳香或其他物质溶于葡萄酒中，总酚的含量一般红葡萄酒高于白葡萄酒。本方法采用福林肖卡试剂（FolinCiocalteu），其原理同福林丹尼斯法。2 试剂与仪器 福林-肖卡试剂（FolinCiocalteu）：称取100g钨酸钠（Na2WO42H2O）和25g钼酸钠（Na2MoO42H2O），将两者溶解于700ml水中，倒入2L的圆底烧瓶中，加入50ml85磷酸和100ml浓盐酸，放入几粒玻璃珠，给烧瓶上连续回流冷凝器，用文火回流10h（可不连续）。回流后用50ml水冲洗冷凝管上的附着物，然后取下。加150g硫酸锂（LiSO42H2O）和几滴溴水（边加边摇）至金黄色，加热沸腾15分钟，去除残余溴，用水稀释至1000ml，于棕色瓶中保存。、 400g/L碳酸钠溶液：称取400g无水碳酸钠溶于1L沸水中，冷却至室温后，加数块结晶碳酸钠晶种，24h后过滤。 5mg/mL酚标准溶液：称取0.500g五倍子酸（没食子酸），用水溶解，定容至100mL。 可见分光光度计。3 测定步骤 标准曲线的绘制：吸取酚标准溶液0ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、5.0ml分别置于100ml容量瓶中，并用水定容。此溶液的酚浓度（以没食子酸计）分别是0mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、125mg/L、150mg/L、250mg/L。从各溶液中分别吸取1ml放入另外的100ml容量瓶中，各加入60ml水，混合，并加入5ml福林-肖卡试剂，充分混合。在30s至8min内加15ml200mg/L碳酸钠溶液，加水定容至刻度，混匀，再20下放置2h后，在波长765nm（或650nm）1cm比色