魔芋葡甘露聚糖的酶解.doc

魔芋葡甘露聚糖的酶解方法一实验所需原料： 魔芋精粉； 0.2mol/lPBS缓冲液（需用Na2HPO412H2O，NaH2PO42H2O配制）； -甘露聚糖酶（10000u/g）； DNS试剂（由3，5-二硝基水杨酸，NaOH，酒石酸钠，苯酚，偏重亚硫酸钠配制）。实验所需器材及仪器： 1000ml容量瓶(2个)； 滴定管（量取或配制溶液时使用）； 250ml锥形瓶； 恒温水浴锅； 恒温振荡器； 冷冻离心机； 紫外-可见分光光度计； 移液枪 预实验： 1. PBS缓冲液的配制： （1）母液的配制： 0.2mol/L Na2HPO4：称取71.6g，溶于1000mL水 0.2mol/L NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO42H2O，溶于1000mL水 （2）pH6.0 87.7mL 0.2mol/L NaH2PO42H2O +12.3mL Na2HPO412H2O pH7.0 38mL 0.2mol/L NaH2PO42H2O +62mL Na2HPO412H2O pH8.0 5.3mL 0.2mol/L NaH2PO42H2O +94.7mL Na2HPO412H2O 这只是大致比例，精确pH值需用pH计配制。 2.DNS试剂的配制方法 （1）称取3，5-二硝基水杨酸6.3g，NaOH 21.0g充分溶解于500mL煮沸的蒸馏水中（煮沸是为了加速溶解）。 （2）加入酒石酸钠182.0g，苯酚5.0g，偏重亚硫酸钠5.0g于上一步的溶液中，加热搅拌至全部溶解，冷却，用蒸馏水定容至1000mL。 （3）充分溶解后盛于棕色瓶中，储存1周后使用。 实验步骤： 打开水浴锅，设定温度 为50. 用量筒量取100ml一定pH的PBS缓冲液于锥形瓶中，塞上塞子置于水浴锅中加热，至50（可用温度计量）。 用称量纸称取0.25g的魔芋精粉备用。待锥形瓶中缓冲液温度达50后将称好的魔芋精粉缓慢加入到锥形瓶中，边加边摇荡锥形瓶（防止结块，同时加时也要避免因魔芋粉粘到瓶壁上而造成损失）。全部加入后要定期振荡锥形瓶以使瓶壁上粘附的魔芋精粉都能充分溶胀（每隔3min振荡50次）。溶胀时间为40min。 用称量纸称取一定量的-甘露聚糖酶备用。待魔芋精粉溶胀完全后小心加入到锥形瓶中，混匀。置于恒温振荡器中反应一定时间( )。 反应完后取出锥形瓶置于沸水水浴锅中煮沸8min灭酶活，得到酶解液。 取适量酶解液于离心管中，放到离心机中离心10min，转速为5000r/min。（注意离心机使用时应遵循对称、等重的原则。） 离心结束后取出离心管。用移液枪移取2ml上清液于10ml的带塞试管中，再加入2mlDNS试剂（显色作用）及4ml同种pH值的PBS缓冲液（稀释作用）。将试管放入沸水浴中煮沸5min，观察试管中颜色的变化。该步为定性测定还原糖。 用紫外-可见分光光度计测定上一步中所得的显色后溶液的吸光度，以定量测定还原糖。 一、魔芋胶总糖和游离还原糖含量测定1)魔芋胶总糖含量测定该总糖是指KGM(不含淀粉)提取液被酸完全水解后所有还原性单糖之总，总糖计算公式：魔芋胶总糖质量分数=还原糖总量(g)/魔芋胶量(g)100%2)魔芋胶游离还原糖含量测定游离还原糖是指样品水解前的还原糖，游离还原糖含量计算公式：魔芋胶游离还原糖质量分数=游离还原糖量(g)/魔芋胶量(g)100%3)魔芋胶葡甘露聚糖含量计算KGM是指样品中魔芋胶总糖含量与游离还原糖含量之差乘以09(换算系数)，计算公式：魔芋胶葡甘露聚糖质量分数=还原糖总量(g)-游离还原糖量(g)/魔芋胶量(g)09100%二、魔芋胶水解率测定-葡甘聚糖酶水解魔芋胶一定时间,取样、灭酶、离心,取上清液适当稀释后用DNS法测定还原糖(以甘露糖计)量。魔芋胶水解率按公式(4)计算:魔芋胶水解率=酶解液还原糖量(g)-游离还原糖量(g)/魔芋胶总糖量(g)100%三、酶解液平均聚合度测定平均聚合度(DP)是指魔芋胶总糖量与酶解液还原糖量之比值。数值越接近1,表示酶解越彻底。当制备魔芋葡甘露低聚糖时,该比值一般控制在1819之间7。平均聚合度