骨髓内皮细胞增殖研究论文.docx

骨髓内皮细胞增殖研究论文特征码dhpsvvkwzpwypvowqflj 80 l和20 l mtt溶液，放入培养箱孵育4小时，吸去液体，各孔加入dmso 150 l，振荡10分钟，使结晶充分溶解。选择492 nm波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值（od492）。 生长曲线纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于96孔板中，每孔5 000个细胞，加0.2 ml含15%新生牛血清的基本培养液，并加入25 ng/ml的rmgmcsf。共种6组，每组3孔，培养5天后，分别于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后计数细胞，每次3孔，求平均值，做出生长曲线。按公式 dt=t1g2/(1gn-1gn0)算出第1代内皮细胞生长的倍增时间。细胞周期的流式细胞术检测无菌条件下取小鼠骨髓单个核细胞，按2106个细胞种于6孔培养板中（2 ml培养体系中含15%新生牛血清的endom），置于37、5% co2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入两种不同培养体系，对照组加含15%新生牛血清的imdm，实验组加15%新生牛血清的imdm和100 ng/ml的rmgmcsf，每组各10孔，置于co2培养箱培养3天后，用胰酶消化细胞， 200g, 离心5分钟，用pbs洗涤细胞2次之后，用300 l pbs重悬细胞，加入冰冷的乙醇（-20）约700 l（终浓度为70%），将细胞放于-20过夜处理后，用流式细胞仪检测细胞周期。细胞传代培养取小鼠骨髓单个核细胞，按2106个细胞种于6孔培养板中（2 ml体系中含15%新生牛血清的endom），置于37、5% co2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入15%新生牛血清的imdm培养液和100 ng/ml的rmgmcsf，促使细胞融合，再按14传代于6孔板中，同样加入15%新生牛血清的imdm和100 ng/ml的rmgmcsf，等细胞生长至融合，按14传代，加入相同培养体系。按上述方法传4代后，绘制生长曲线，方法同前。公式 dt=t1g2/(1gn-1gn0)算出第4代内皮细胞生长的倍增时间，并与第1代的倍增时间进行比较。统计学处理实验数据为3次结果，以meansd表示。不同处理组两组间比较采用t检验，应用spss软件分析，p<0.05表示有统计学意义。结 果细胞形态每孔种入小鼠骨髓内皮细胞5 000个，对照组加基础培养液,实验组在基础培养液的基础上分别加入rmgmcsf 5、10、25 ng/ml。与对照组相比，实验组集落数均明显增多（图3），说明rmgmcsf对小鼠骨髓内皮细胞的增殖有明显刺激作用。rmgmcsf对内皮细胞增殖的影响小鼠骨髓内皮细胞培养5、10天，分别进行mtt的检测，结果表明rmgmcsf对小鼠骨髓内皮细胞生长促进作用明显，各组与对照组相比差异显著（p<0.01） （图4）。gmcsf对ec细胞周期的影响运用流式细胞仪检测细胞周期，观察gmcsf对ec细胞周期的影响。结果显示gmcsf使细胞进入s期的比例为9.3%，与对照组2.1%相比有明显差别。此结果说明gmcsf能够促使细胞进入s期，加快细胞的分裂，从而促进了细胞的增殖（图5）。figure 5. effect of gmcsf on cell cycle of endothelial cells. a: group treated by gmcsf. b: control group.体外扩增传代对内皮细胞增殖的影响图6为小鼠骨髓第1代和第4代内皮细胞的生长曲线。利用计算公式dt=t1g2/(1gn-1gn0)计算出第1、4代细胞生长的倍增时间分别为30.250.55小时、31.670