《细胞生物学》综合性实验项目申报表.doc

9综合性、设计性实验项目指导书细胞生物学实验项目： 不同处理条件对植物细胞骨架的影响 龙岩学院 学院（系）年 月 日实验学时： 6 学时实验类型：（综合、设计）设计每组人数： 4 人组适用专业：一、实验目的通过本实验的学习，使学生了解在体外，温度、紫外线、化学性药物等对细胞骨架系统装配的影响，训练学生如何设计实验步骤来验证书本的知识点，使知识点掌握得更牢固，从而培养学生动手操作能力，独立思考问题，并通过查阅资料解决问题的能力，为今后遗传学的学习、毕业论文的完成等奠定基础。 二、实验原理细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管、中间纤维。一些细胞骨架系统的装配和去装配在时间和空间上是高度有序的，在体外，它们在温度、离子、化学药物等因素的作用下，可进行装配或去装配过程。三、实验要求实验前，学生必须先预习细胞骨架系统的组成，骨架系统在体外的装配条件等相关知识内容，查阅关于温度、紫外线、秋水仙素对体外细胞骨架系统装配的影响等资料文献，并写出具体的实验方案四、主要仪器、试剂显微镜、普通冰箱、低温冰箱、紫外灯、培养箱等五、实验方案（一） 考马斯亮蓝法显示细胞骨架1、蛋白质的细胞化学：（1）蛋白质是细胞中重要的结构和功能成分，某些染料能与蛋白质的氨基酸残基结合，产生颜色反应，借以对蛋白质进行显示。这种对蛋白质直接染色的细胞化学方法并不多，特异性也不强。（2）目前，应用最广泛的方法是利用免疫标记技术对蛋白质进行特异性显示，通过荧光标记细胞骨架成分的单克隆抗体对细胞骨架蛋白进行显示。2、细胞中的细胞骨架成分：（1）、细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构。其概念具有狭义和广义之分：狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同包括微丝、微管和中间纤维；广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。（2）、细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100 的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250 染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。3、实验用品(1) 材料 洋葱（或其他）(2) 器材 显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH 计(3) 试剂1. 0.01mol/L 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3） 50ml0.15mol/L NaCl双蒸馏水加至1000ml2. PB0.2mol/L Na2HPO4 77ml0.2mol/L NaH2PO4 23ml3. M-缓冲液咪唑(PH 6.7) 50mmol/LKCl 50mmol/LMgC12 0.5mmol/LEGTA 1mmol/LEDTA 0.1mmol/L巯基乙醇 1mmol/L甘油 4mmol/L用1mol/L HCl 调pH 至7.2。4. 1%的Triton X-100/M-缓冲液5. 0.2%考马斯亮蓝R250 染液甲醇 46.5ml冰醋酸 7ml蒸馏水 46.5ml6. 3%戊二醛- PB 溶液（PH7.3）4、实验方法和步骤：（1）、洋葱表皮细胞取材后，用PBS液轻轻漂洗。（3次， 3min/次）（2）、用1%TritonX-100/M缓冲液处理15min （30min），室温或者37均可。（3）、M缓冲液轻轻洗细胞3次（3-5min/次），M缓冲液有稳定细胞骨架的作用。（4）、3%戊二醛-PBS液固定细胞5-15min（不制备永久装片，甲醇-冰醋酸混合液。固定15-25min？）。（5）、PBS液洗涤细胞若干次（3次，3-5min/次），用滤纸吸干。（6）、0.2%考马斯亮蓝R250染色30min，小心用水漂洗，空气干燥，封片，观察。（蒸馏水洗2次，滴加二甲苯透明？，制成水装片）（7）、用普通光学显微镜观察，可见到深蓝色的纤维束，粗细不等，基本上平行排布，张力纤维是一种动态结构，在充分贴壁铺展的细胞中纤维挺直、丰富，形态比较典型，当将贴壁培养的细胞从基质表面除下时，细胞变圆，张力纤维随之消失。取洋葱内皮1cm 左右置于含PBS 液的载玻片上湿润后，吸去PBS加2 滴1%Triton X-100/M-缓冲液，15-30 min吸去缓冲液，M缓冲液轻轻洗细胞3次，加3%戊二醛-PB 溶液，固定25min？加PBS 洗2 次，共3min加0.2%考马斯亮蓝R250 染色30min用PBS 洗2 次，共2min，吸干镜检并绘图图4-4 细胞骨架标本制作过程5、实验操作注意事项：（1）、每一次加液或染色后，应用PBS 洗2 次，并用滤纸吸干。PBS冲洗应适度，否则洋葱表皮细胞吸收大量水分易使液泡过分涨大，影响实验结果的观察。（2）、实验操作中，Triton的抽提是最关键的步骤，应注意抽提适度,建议应控制在30min 左右。（二）不同处理条件对植物细胞骨架的影响每小组4人，自选温度、紫外线、秋水仙素等处理当中的某一因素，观察这个因素对洋葱细胞骨架系统的影响。设计这个因素的三个或三个以上梯度，对洋葱细胞处理相同的时间后，观察洋葱细胞骨架系统的状态，并拍摄出显微镜观察的结果。文献中参考方案：1 洋葱细胞骨架制备的关键条件优化取洋葱内表皮8 张，大小约0.5cm0.5cm，放到培养皿中，然后用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡8min，加入1%Triton X- 100 分别处理洋葱内表皮10min、15min、25min 和45min 以优化最佳观察条件。2 各种处理2.1 温度处理方法撕取洋葱鳞茎上的鳞叶,置于4 个培养皿中,分别在- 18 冰箱、4 冰箱、50 培养箱和20 (对照) 中处理1h。2.2 紫外线照射方法撕取洋葱鳞茎上的鳞叶,置于2 个培养皿中,分别在紫外灯下照射0min (对照组) 和60min。2.3 Ca2+ 处理方法取大小为0.5cm0.5cm的洋葱鳞茎表皮8 张，分别取2 张浸入0.05mol/L、0.10mol/L 和0.15mol/L 的CaCl2溶液中处理2h，另外两张不做处理，设为对照。取大小为0. 5cm 0. 5cm 的洋葱鳞茎表皮8 张,其中2 张浸入0. 1mol/L 的CaCl2 溶液中处理1h ,两张处理2h ,两张处理4h ,另外两张不做处理,设为对照。2.4酸碱处理方法取大小为0. 5cm 0. 5cm 的洋葱鳞茎表皮16 张, 分别浸入pH 2、 pH 11处理1、2、 3、 4小时。2.5 秋水仙素处理方法取大小为0.5cm0.5cm 的洋葱鳞茎表皮4 张，2 张浸入0.1%的秋水仙素溶液中处理24h，另2 张不做处理。2.6 渗透压处理方法高渗溶液处理0.5、 1、 2 小时3. 细胞骨架的制片与观察首先将洋葱片放入装有pH 值6.8 磷酸缓冲液的小玻璃瓶中，使其下沉；然后吸去磷酸缓冲液，用1%Triton X- 100 处理25min（抽提骨架以外的蛋白质）；吸去Triton X- 100 后，用M- 缓冲液洗3 次，每次3min，洗涤的同时可以稳定细胞骨架；再用3%戊二醛固定15min；吸去戊二醛后，用PBS 洗3 次，每次3min；用0.2%考马斯亮蓝R250 染色15min；用蒸馏水洗涤2 次；取出洋葱鳞茎内表皮，展平在载玻片上，空气干燥；最后镜检。复习思考作业题1、绘图表示微丝在洋葱表皮细胞中的分布；2、总结在实验的处理步骤中，Triton抽提起到了什么样的作用？3