毕赤酵母的摇瓶发酵方法.doc

毕赤酵母的摇瓶发酵方法：一、 摇瓶发酵方法:毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，1、酵母菌株生长阶段；2、 脂肪酶诱导表达阶段。1、 酵母生长阶段。准备试剂：1000ml BMGY培养基，1000ml BMMY培养基，10X的甲醇，摇瓶1L（灭菌），温控摇床，50ml离心管（灭菌）。紫外分光光度计，石英比色皿。以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。（1） 往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMGY培养基，然后加入约1ml脂肪酶菌株（培养基：菌液=100：1），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过）。置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母生长，OD600=2.0-6.0，时间约为15-24小时。（2） 将发酵液转入50ml离心管，1500g-3000g离心5min。去掉上清，用BMMY培养基将菌体浓度稀释至OD600=1.0，约有500ml左右。将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中，每个摇瓶150ml发酵液（绝不能超过200ml）。（3） 将摇瓶置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母表达脂肪酶，每24小时加入一次5%的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%。连续诱导表达48小时。（4） 将发酵液进行12000rpm/min离心5min，取上清（若上清仍混浊，可反复离心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。BMGY培养基的配制（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（Yeast Extract）,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甘油 100ml。BMMY培养基的配制方法（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甲醇 100ml。10X的甲醇的配制：取甲醇（AR 上海医药集团有限公司）5ml，加入无菌水95ml，配置成5%的甲醇溶液，用0.22M的微孔滤膜（millipore公司）过滤除菌，该溶液在常温下的保质期为两个月。10X的YNB配制方法(1000ml)：称取YNB（生化试剂，上海生物工程公司，不含硫酸铵）34g,加入100g硫酸铵，待完全溶解后，用0.22M的微孔滤膜（millipore公司）过滤除菌。该溶液在常温下的保质期可以达1年。10X的磷酸缓冲液的配制方法：分别配制1M 的K2HPO4和KH2PO4，然后将132ml的K2HPO4和868ml的KH2PO4混合，调节PH至6.0；调PH用磷酸或者KOH，然后1210C高温灭菌20min。该溶液在常温下的保质期可以达1年以上。10X的甘油的配制方法（1000ml）：取100ml的甘油加水至1000ml，然后1210C高温灭菌20min。该溶液在常温下的保质期可以达1年以上。5问：在下是初学者，关于毕赤酵母的诱导表达有些问题：+ E* v1 H0 A$ F3 s+ X “每24h 向培养基中添加100甲醇至终浓度为0.5 1.0%”这里的甲醇浓度如何控制？4 _/ z L! e: j/ F4 n: 还有，关于BMMY的甲醇浓度有些材料里的是0.5% ，有的是1.0%，应该是哪个？“每24h 向培养基中添加100 甲醇至终浓度为0.5 1.0%”这里的甲醇浓度和BMMY中的甲醇浓度是要一致的吗？$ 7 J* E3 L% b9 ?/ u 另外一个小问题，配10%甘油时，移入量筒的100%甘油一部分会粘在管壁上，难免最后配成的10%甘油会有所偏差，这样要不要紧？操作上是否有问题？+ c* h5 5 I) % P j 参考见解1：, k4 N s* v! x1 J: “每24h 向培养基中添加100 甲醇至终浓度为0.5 1.0%”# % W# B* i3 v 我可以给你解释一下：# q, b k! c4 i0 V; h5 o* U F 1、它的意思是每隔24小时，不断的添加 纯甲醇（指的是甲醇试剂含有100 甲醇，不含有其他的成分）至终浓度为0.5 1.0%，指的是添加的甲醇占总体积的0.5 1.0%（即每100升培养基含有甲醇0.5 1.0升，如果是质量体积比则是每100毫升培养基含有甲醇0.5 1.0克）$ M; f0 d& + I, R% J4 p 2、只要你添加的量在以上的这个范围就可以，当然可以根据实验的实际情况进行调整，但是一般要在此范围内。& m9 5 k& c& b* 8 w 3、配10%甘油时，注意先加入部分水后在称取甘油加入，然后在定容到所需要的体积，这样就可以避免甘油粘在管壁上，甘油易溶于水，配好后，再粘在管壁上就不会影响了。! O. _( q( G* o1 I/ X, u1 D 4、建议你对实验的基础知识多多学习，你会又很大进步的！& G/ h* A1 M8 j 参考见解2：5 l4 L4 b- P9 l 1、如何确保加入后甲醇浓度在此范围内？你可以进行检测啊！只要检测你的培养基中剩余的甲醇含量即可，可以计算出你应该加多少甲醇，24小时可以检测一次。 w M7 E) e q& W& R6 M7 e0 Q8 M 2、至于为什么24小时加一次，具体原因我不是很清楚，但是我觉得应该是发酵中(尤其是发酵瓶）培养基的体积太小，不能太多的取样，取样太多会影响体积、蒸发量、无菌等指标的。而且在这个时间内酵母在甲醇终浓度为0.5 1.0%中生长在其许可范围内，其甲醇消耗不会超过这个范围的，时间安排也比较合理，所以可能是个经验值吧！其实不需要考虑甲醇的消耗，只要检测它的剩余即可，根据剩余可以计算出你需要加入的甲醇体积或者质量。- U: C& X$ - P% J% s 3、另外你不一定一次就加入，可以连续的在24小时加入，不过操作就非常麻烦了，发酵罐还可以，摇瓶怎么办呢！ 2 w: h- r( q+ 4 O