丙种球蛋白的制备.docx

丙种球蛋白的电泳制备相关概念： 【别名】 免疫血清球蛋白，普通免疫球蛋白，人血丙种球蛋白，丙种球蛋白，静脉注射用人免疫球蛋白。 丙种球蛋白药理作用： 注射丙种球蛋白是一种被动免疫疗法。它是把免疫球蛋白内含有的大量抗体输给受者，使之从低或无免疫状态很快达到暂时免疫保护状态。由于抗体与抗原相互作用起到直接中和毒素与杀死细菌和病毒。因此免疫球蛋白制品对预防细菌、病毒性感染有一定的作用。适应症： 丙种球蛋白是血液中一种蛋白质，它通常来源于许多人献的血液。含有健康人群血清所具有的各种抗体，因而有增强机体抵抗力以预防感染的作用。主要用于免疫缺陷病以及传染性肝炎、麻疹、水痘、腮腺炎、带状疱疹等病毒感染和细菌感染的防治，也可用于哮喘、过敏性鼻炎、湿疹等内源性过敏性疾病。电泳基本原理：电泳带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。其他电泳技术：1、纸电泳2、乙酸纤维素薄膜电泳3、凝胶电泳4、等电聚焦电泳5、等速电泳6、双向凝胶电泳（二维电泳）盘状电泳的原理：聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子的大小，形状的不同，在电场的作用下，产生不同的速度而分离的方法。它是利用丙烯酰胺和双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子的凝胶物。它同时兼有分子筛和电泳效应。当样品通过凝胶进行电泳时，便可以根据其样品中各分子的电荷和分子量的不同而泳动出不同的区带。由于聚丙烯酰胺凝胶化学性质较琼脂稳定，很少带有侧基，在电泳过程中，吸附作用与电渗作用均小，所以该技术的分辨率均高于其它琼脂电泳技术盘状电泳法的三个效应：1、 样品浓缩效应2、电荷效应3、分子筛效应在这三重效应的共同作用下使血清蛋白中不同的蛋白质分离开来。影响电泳速度的因素： 电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗作用、粒子的迁移率、吸附作用。制备丙种球蛋白的方法 丙种球蛋白的两种分离制备的方法层析法（如：Sephadex G-50）定义:是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理以获得分离的方法。电泳法（如：聚丙烯酰胺凝胶电泳)定义：利用溶液中带有不同量的电荷的阳离子或阴离子，在外加电场中以不同的迁移速度向电极移动，而达到分离目的的分析方法。电泳仪的安装：装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。竖直电泳槽， 在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。 其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。实验器材：试剂： 猪血清样品、分离胶缓冲液、凝胶溶液、10%过硫酸铵（AP）、电极缓冲液、固定液、染色液、脱色液仪器： 圆盘电泳槽、电泳仪、电泳玻璃管、滴管、烧杯、刻度吸管、加样枪、注射器等。实验步骤：1.装管取已准备好的玻管，从一端量至7cm处，用笔划线。起始端用胶布包封好后，插入橡皮塞中，垂直放好。2. 配胶：分离胶的制备：（1）、将清洁、无破碎干燥的小玻管一端，用胶布贴封后，朝下垂直放入有机玻璃凝胶玻管架的孔中，并在小玻管的7.0 cm处作一记号。（2）、用自动取液器吸取上述配好的分离凝胶贮液沿着小玻管内壁小心准确加入7.0 cm高。（3）、凝胶溶液加完后，随即吸取蒸馏水，加至管中的凝胶表面，使其表面覆盖一水层（水封，1.0cm 高）。在灌胶和封水的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。（4）、将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约30-60分钟后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，即可加浓缩胶浓缩胶的制备：（1）、轻轻倒掉分离胶玻管上端的液体，并用吸水纸吸去未倒净的液体（但不能触及胶面）然后先小心用浓缩胶贮液洗涤凝胶表面1-2次，再小心加入该浓缩胶贮液1.5 cm高。（2）、随后同样加1.0cm高的蒸馏水层覆盖胶表面。大约也在20-40分钟后，待浓缩胶出现乳白色时，表明胶已聚合完毕。3.灌胶及封胶将混匀好的胶液，用滴管缓慢注入玻璃管，当加到液面距离电泳玻璃管上口 1cm 时停止。注意在加的过程中不要混进空气， 随即用注射器经针头沿凝胶管壁缓慢加入蒸馏水至管满，防止氧化，室温下聚合15-20min。4.制样取血清30ul，加0.025%溴酚蓝5ul，20%蔗糖65ul，混匀即可。5.加样 等胶完全凝结后，用滤纸小心吸去表面的水层（切勿破坏胶面的完整性）。将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧，然后分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液，下槽的液面应没过玻璃管的下管口及电极丝，上槽的液面应没过玻璃管口0.5-1cm；排气泡。用微量注射器或加样枪吸取 50l 样品小心的加入玻璃管内6、装置凝胶管： 将加好样品的凝胶管的加样端（上端），插入上电泳槽孔中，然后将已插满凝胶管的上电泳槽放入加有电极溶液的下电泳槽内。此时凝胶玻管下端管口易产生气泡，可通过轻轻摆动凝胶玻管以去除气泡，插入上电泳槽的玻管上端，用滴管轻轻滴满电极溶液，以免产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，内槽装阴极缓冲液,外槽用阳极缓冲液恒压电泳,先40V约1.5h,当样品进入分离胶时,电压升至60V约1.5h。 7.剥胶 电泳结束后，取下玻璃管，用带长针头的注射器从浓缩胶一端紧贴玻璃管壁缓慢插入针头，一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管。靠水流的压力和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开，待水流从另一端流出时，再慢慢将针头退出（注意操作中不要把胶条搅碎）。然后用洗耳球轻轻在胶管的一端加压，将胶条从玻璃管中缓慢滑出。8、固定 剥胶完毕后，将胶条置于固定液中固定20-30分钟9.染色 将胶条放入考马斯亮蓝染色液中，室温染色50-60分钟。10.脱色 将胶条以自来水冲洗两次，然后在脱色液中脱色约 10 分钟，共3次。注意事项：1丙烯酰胺等试剂是有毒试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。2制胶时，要充分摇匀。 3凝胶柱面应平整，操作过程切勿产生气泡，否则电泳区带不整齐。 4、电泳中电流应保持稳定，避免电流强度过高，而产生大量的热使分离失败。 电泳开始，样品应于5min10min内进入凝胶柱内为佳。5脱色染液回收。6.固体胶切忌倒入水池。注释：加入溴酚蓝的目的: 溴酚蓝呈蓝色，而蛋白质是白色，在凝胶中不明显。再则，溴酚蓝的相对分