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外文文献及翻译题目： 利用固定化过氧化氢酶 回收纺织品漂染的废水专 业 食品科学与工程 学 生 姓 名 梁金龙 班 级 B食品072 学 号 0710308119 指 导 教 师 郑 清 利用固定化过氧化氢酶回收纺织品漂染的废水Silgia A. Costa1, Tzanko Tzanov1, Filipa Carneiro1, Georg M. Gbitz2 &Artur Cavaco-Paulo1,1纺织工程系, 米尼奥大学, 4810吉马尔, 葡萄牙2环境生物技术系, 格拉茨技术大学, 8010格拉茨, 奥地利作者联系方式 (Fax: +351 253 510293; E-mail: arturdet.uminho.pt)关键词：过氧化氢酶的固定化，酶稳定，过氧化氢，纺织印染摘要 过氧化氢酶固定在氧化铝载体上并用戊二醛交联，在再循环塔反应器和CSTR反应器中研究贮存稳定性，温度和pH值对酶的活性。固定化酶的在的活性维持在44，pH值11（30C），对照组是活性为90，pH值7（80C），过氧化氢酶固定化的半衰期时间被提高到2小时（pH12，60C）。用过氧化氢漂白织物后，洗涤过程中的残留水被固定化酶处理，可以用于再次印染时，记录实验数据。1 序言 由于新的法规的出台，从生态经济的角度来看（Dickinson1984年），对于纺织行业中存在的成本和剩余水域的污染问题，必须给予更多的关注。过氧化氢是一种漂白剂，广泛应用于工业纺织工艺（Spiro & Griffith1997年）。在去除H2O2时，会消耗大量的水和能源（Weck 1991, Sthr & Petry 1995），以避免对氧气敏感的染料（Jensen 2000）产生后续问题。过氧化氢酶可用于降低过氧化氢的含量（Vasudevan & Thakur 1994, Emerson et al. 1996），从而减少水分消耗或方便回收印染洗涤液。过氧化氢酶的使用主要问题出在漂白时温度和清洗液碱度过高。以前，我们试图通过筛选新的嗜热嗜碱的微生物（Paar et al. 2001）或使用不同的酶稳定剂（Costa et al. 2001）来解决此问题。但是染料与蛋白质之间的潜在相互作用（Tzanov et al. 2001a, b）表明，可溶性过氧化氢酶的使用是不恰当的。固定化过氧化氢酶的使用还有一种选择(Costa et al. 2001, Amar et al. 2000)。在这项研究中，我们对氧化铝进行共价固定并使用戊二醛作为交联剂，这种方法在商业中得到验证。本项研究的目的就是探讨过氧化氢酶的固定化动力学，及其稳定性和工艺条件，这将使我们能够应用此系统，以处理可能被用于清洗染色的反复使用的酒。2 材料和方法2.1 酶 Terminox（EC1.11.1.6），50L以上，由AQUITEX- Maia提供，葡萄牙产。2.2 过氧化氢酶的固定化 取Al2O3颗粒或薄片（Aldrich），直径分别为3和7毫米，在45摄氏度下，先经浓度4%的-氨丙基三乙氧基硅烷(Sigma)烷基化，再放入丙酮中浸泡24小时。用蒸馏水洗涤硅烷化载体后，放入浓度为2戊二醛水溶液中室温下浸泡2小时（Aldrich），重复清洗一次并在60C下干燥1小时。取五克的烷基化载体，室温24C下浸泡在25毫升粗酶制剂中（Costa et al. 2001）。得出，每克Al2O3颗粒中含固定化蛋白质的量为18mg，每克Al2O3薄片中含固定化蛋白质的量为14mg。2.3 游离酶和固定化酶的活性测定 游离的过氧化氢酶的活性测定方法是，将26mmol/L的过氧化氢与50mmol/L钾磷酸盐缓冲液在pH 7、30C下反应降解，然后用分光光度法在240nm处测吸光度。其活性的是利用过氧化氢的摩尔吸光系数（39.4 mol/L cm）（Aebi 1974）测定的。固定化酶在恒温反应器中恒温，循环速率1mlmin-1，后在pH 7、30C下用一个批处理CSTR反应器与过氧化氢反应，调节浓度浓度从0.015mol/L增加至2mol/L，该反应器装有固定化过氧化氢酶5克(Costa et al. 2001)，酶和底物作用后通过反应柱。剩余的过氧化氢测定用高锰酸钾滴定法和测试盒法。过氧化氢酶的活性从1nmolmin-1mg-1结合蛋白中测定。2.4 蛋白检测 酶被固定化后，上清溶液中的蛋白含量可用Bradford法测定。结合蛋白被的含量可以作为起始和残余蛋白浓度差异的度量。2.5漂白后的洗液 实验所用的残留水水是从一纺织公司（TAS, Portugal）收集而来，此前用于洗去漂白棉纺织物中存在的过氧化物(52.5 g H2O2 l1 (50% v/v) 。面料是在一个有六个连续洗箱的洗衣机中洗涤的。2.6 染色条件 染色是使用试剂为，一种含量为1.5%的活性染料Evercion Blue HER（来自永光化学。工业，台湾），Na2SO4 (50 g l1), Na2CO3 (20 g l1)。染色使用的洗涤水，用固定化酶处理。染色实验均在80C下进行，试验时间为60分钟。图1.过氧化氢被固定化过氧化氢酶降解的速率单位：molH2O2min-1mg-1蛋白：柱式反应器中的球状颗粒载体用（）表示，批式搅拌反应器中的球状颗粒载体用（+）表示，柱式反应器中的薄片载体用（）表示。（每个实验做三次，误差控制在4%以内）。图2.pH对游离和固定化过氧化氢酶的影响过氧化氢酶活性用26mmol/L过氧化氢测定，温度为30，实验时间2小时，pH值从6变化至12。（6-7用磷酸钾溶液; 8-9用Tris-HCL溶液；10-12，用50碳酸钠溶液做缓冲溶液，浓度控制在50mmol/L）。 2.7 色差(E) 采用反射率测量仪器测量在淡水和经过氧化氢酶处理的洗涤液的色差，该仪器由Datacolor生产，根据CIELab色彩模型，色差在D65标准光源下测定。图3.温度对游离和固定化过氧化氢酶的活性的影响。使用26mM的过氧化氢和50 mM磷酸盐缓冲液在pH7下的反应器中反应，时间2小时。活性的响应值分别为：8mol min1 mg1蛋白和12mol min1 mg1蛋白（每组实验三分，误差控制在4%以内）。图4.漂白后，用固定化过氧化氢酶处理的洗液。E *为纺织品在淡水和用固定化过氧化氢酶处理的洗液之间的色差（每组实验三次，误差控制在4%以内）。3 结果与讨论3.1 利用固定化过氧化氢酶转化底物的速率 反应器中的酶反应速率随过氧化氢浓度（图1）增加而增加，H2O2为1M以上时，速率维持不变。过氧化氢酶的失活可能通过增加过氧化氢的含量或者是有机过氧化物的形成来实现。这通常与酶的血红素辅基的修改有关(Lafuente等. 1999)。3.2 pH值和过氧化氢酶的活性随温度的变化 自由和固定化过氧化氢酶在pH 7（图2显示）的活性最高。但可根据其pH敏感性得出一个重要的区别：固定化酶在碱性pH值有较高的活性。载体上共价结合的过氧化氢酶可能会通过限制蛋白质变性，从而提高失活的可能性，这可能是分子内和分子间交联的结果。 相对于游离酶，固定化过氧化氢酶的热稳定性，在高于50C时十分显著（图3）。支持物和生物催化剂之间，可以通过共价键连接，或者通过所谓的耦合建立连接。耦合分子很大程度上提高了生物催化剂的流动性，使其可以在一定情况下，比直接键合的流动性更高。作为交联剂或耦合剂而使用的戊二醛使得蛋白质的结构更加灵活，并且具有更好的耐热性（Duhalt 1999）。作为交联剂或耦合剂呈现的蛋白质结构更加灵活，耐热变性（Duhalt 1999）使用的戊二醛。表1.pH为7 -12，温度30C和60C下，自由和固定化过氧化氢酶的半衰期为的研究（每组实验做三次，误差控制在4%以内）。表1 在不同pH下的半衰期过氧化氢酶温度(C)在不同pH下的半衰期7 8 9 10 11 12游离30612 387 362 192 102 8固定化6018 14 11 6 0.07 0.0530882 235 214 199 65 3560287 109 71 61 16 23.3 游离的和固定化的过氧化氢酶的储存稳定性 过氧化氢酶的pH和热稳定性长期在工业中作为基本准则。游离的和固定化的过氧化氢酶都随着温度和碱性的提高而下降（图1）。但是固定化过氧化氢酶在所示最高pH和温度下活性保持的更好。来自不同的洗箱中的洗液的过氧化氢含量、温度、pH岁洗箱先后顺序依次降低：H2O2：0.059, 0.019, 0.009, 0.007, 0.005, 0.004 g l1 ；温度：从90 C降至 40 C；pH 从11降至4.5。 因此，利用酶法对底物染色的给色量从左至右依次增加（图4）。相对于用游离酶处理过的漂白液， 用固定化酶处理的漂白液具有更小的色差。3.4 漂白后，分别用游离和固定化过氧化氢酶处理的洗液 在印染中，假设在同样的工艺条件下，固定化过氧化氢酶的这种的显著地改善可以归因于固定化催化剂的高效。 固定化酶而不是游离酶的应用，避免了在染料池中蛋白质存在的影响，从而避免了变性蛋白质与任何染料之间的的相互作用(Tzanov 等. 2001b)。结果表明，印染，洗涤后的第二个洗箱，没有必要使用，在纺织品染色方面，通过这种方法，即可以满足商业中使用CIELab模型的条件。结语在本实验中，固定在氧化铝颗粒和块状物上的过氧化氢酶被用于降解塔反应器和反应釜中的过氧化氢，而结合底物的塔反应器更适合在实践中的应用，因为其对过氧化氢的降解速率更快。这两种反应器对酶的抑制发生在第五浓度大于1M时。酶的共价固定化技术会导致酶在一定pH和温度下具有更高的性能。固定化过氧化氢酶比游离酶的活性更高，在温度30C，pH从6至11下会保持90%的初始活性，此外，固定化酶可以在更高的温度和碱性条件下使用。例如，在pH为12的溶液中保持35小时，酶的活性仅仅减少了50%。固定化过程使酶碱在性条件（pH6-12）和较高温度下（60C）储存时，而且用固定化酶处理的回收水在使用时具有很好色彩一致性，因此，洗涤液的回收利用大大节省了能源和时间。参考文献:1 Aebi He (1974) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd edn. In: Bergmeyer HU, ed. Weinheim: Verlag Chemie, pp. 272284.2 Amar E, Tadasa K, Fujita H, Kayahara H (2000) Novel stabilization pattern of thermolysin due to the binding substrate induced by electrostatic change in enzyme active site caused by the temperature elevation. Biotechnol. Lett. 22: 295300.3 Costa SA, Tzanov T, Paar A, Gudely M, Gbitz GM, Cavaco- Paulo A (2001) Immobilization of catalase from Bacillus SF on alumina for the treatment of textile bleaching effuents. Enzyme Microb. Technol. 28: 815819.4 Daumantas M, Charles W, Tong VP, Chandra G, Rex L (1999) Protection of enzymes by aromatic sulfonates from inactivation by acid and elevated temperatures. J. Mol. Catal. B Enz. 7: 2136.5 Dickinson K (1984) Preparation and bleaching. Rev. Prog. Coloration 14: 17.6 Duhalt VR (1999) Cytochrome c as a biocatalyst. J. Mol. Catal. B Enz. 7: 241249.7 Emerson D, Peteu SF, Worden MR (1996) A catalase microbiosensor for H2O2. Biotechnol. Tech. 9: 673678.8 Jensen PN (2000) Catalase enzyme. Tex. Chem. Color. 32: 2324.9 Lafuente RF, Rodrguez V, Mateo C, Lorente GF, Arminsen P, Sabuquillo P, Guisn JM (1999) Stabilization of enzyme (Damino acid oxidase) against H2O2 via immobilization and postimmobilizaion techniques. J. Mol. Catal. B Enz. 7: 173179.10 Paar A, Costa S, Tzanov T, Gudelj M, Robra KH, Cavaco-Paulo A, Gbitz GM (2001) Thermoalkalistable catalases from newly isolated Bacillus sp. for treatment and recycling of textile bleaching effluents. J. Biotechnol. 89: 142153.11 Spiro MC, Griffith PW (1997) The mechanism of H2O2 bleaching. Tex. Chem. Color. 29: 12.Sthr R, Petry R (1995) Enzymes biocata