高岭的论文大花蕙兰组织培养.doc

ANYANG INSTITUTE OF TECHNOLOGY本 科 毕 业 论 文 大花蕙兰组织培养技术研究Research on Tissue Culture of Cymbidium GrandiJlorum此为拉丁学名，用斜体！ 系（院）名称： 生物与食品工程学院 专 业 班 级： 07生物工程（1）班 学 生 姓 名： 高 岭 指导教师姓名： 刘 彦 珍 指导教师职称： 讲 师 2011 年 5 月毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得安阳工学院及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。作 者 签 名： 日 期： 指导教师签名： 日期： 使用授权说明本人完全了解安阳工学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。作者签名： 日 期： 目 录中文摘要、关键词1英文摘要、关键词2引 言3第1章绪论51.1 大花蕙兰生物学特性51.1.1 根51.1.2 茎61.1.3 叶61.1.4花61.1.5果实.71.2大花蕙兰人工繁殖.81.3大花蕙兰市场前景 8第2章试验材料与方法92.1 试验材料和器材92.2试验方法92.2.1培养基的制备92.2 2材料的选取和灭菌92.2.3培养条件10第三章结果与分析103.1 不同外植体对原球茎诱导的差异103.2不同基本培养基对侧芽萌发诱导的差异113.3不同外植体对原球茎增值的差异.113.4 不同生根培养基对幼芽生根的差异13结论14致谢15参考文献16大花蕙兰组织培养技术研究摘要：以大花蕙兰嫩叶、茎尖、花梗侧芽、花梗节间为外植体，进行原球茎诱导，探求大花蕙兰组织培养的最适外植体；通过不同培养基及各种激素配比组合进行原球茎诱导、增值及试管苗生根试验，探索各阶段最优培养基配方。结果表明：茎尖诱导大花蕙兰形成的原球茎比率最高，诱导率达71.3，最佳培养基配方为MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+100mlL椰乳，其次是花梗腋芽，其比率为65.2%，；MS+0.5 mgL NAA+1.0 mgL 6-BA是大花蕙兰原球茎增殖的最佳培养基，增殖系数达8.98；生根最适培养基为是MS +1.0mg/L IBA +0.5 mg/L NAA关键词：大花蕙兰 最适外植体 原球茎增殖 生根 培养基 Research on Tissue Culture of Cymbidium GrandiJlorumAbstract:We induce the growth of the protocorn to seek the best explants of stem tip,lateral bud of preduncle and the internode of peduncle of the Cymbidium hybridum as the explants. And we search the best matching of the culture medium and the hormone by expiring protocorn inducing in very stage. It turns out that stem tip is the best explants. Its inductivity is as high as 71.3%. The best matching of culture medium is MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+100mlL oZ.Coco.Lopez. The best culture medium of protocorns breading is MS+0.5 mgL NAA+1.0 mgL 6-BA. The best culture medium of roots growth is MS +1.0mg/L IBA +0.5 mg/L NAAKey Words: Cymbidium hybridum; The best explants; Protocorn breading; Rootage; Culture medium19引 言 兰花在植物分类学上属于兰科(Orchidaceae)植物，是单子叶植物，为多年生草本，附生、地生、或腐生。兰科植物按生态习性可分为地生兰和气生兰两种，生于地上而有球茎、鳞茎、块茎者称为地生兰，主要产于中国，故也称为中国兰。如我国及东南亚特产的兜兰、茎脊兰、鹤顶兰等。气生兰都产于热带和弧热带，大都以气生根着生于树林的枝干或岩石上，其花的形和色，大而鲜艳，具有很高的观赏价值。此类兰花有蝴蝶兰属、石斛兰属、卡特兰属、文心兰属、树兰属、万代兰属等。兰科是显花植物中最大的科之一，估计有800个属，3一35万个原生种。另外，在英国国际散氏兰花杂种登记目录正式登记的人工杂交种约4万种以上，而且每年以1000种以上的数目在增加。我们常见的中国兰和洋兰，只是兰科植物中部分有观赏价值的栽培种类，还有大量的野生兰科植物分布于世界各地，有待于我们去发掘、保护、引种栽培和杂交育种。 兰花传统的繁殖方式主要是分株繁殖，然而一株健壮的兰花每年只能长出一至数个芽，繁殖系数极低，一般只能增殖13倍。许多珍稀品种无法大量繁殖，不能满足市场的需求，致使一些稀有品种的售价，每个叶芽高达几千元甚至几万元以上。不少品种在栽培条件下很少结种,同时由于兰花的种子极小，胚发育不完全，没有提供营养的胚乳或其它组织，因此不易发芽，要借助共生的菌类供给养料才能萌发。许多名贵品种实际上是一些自然突变体，如果这些品种通过有性生殖产生种子，再由种子繁殖后代，那么这些后代中的绝大多数个体将会丧失原品种具有的独特观赏价。另外，由于长期无性繁殖，造成带病毒植株日益增多，使兰花的优良品质下降。因此如何运用生物技术快速繁殖名优兰花就格外引人注目。 大花蕙兰(Cymbidium grandiflorium)，是兰科兰属(Cymbidium)中的一部分大花附生种类及其杂交种，是世界上栽培最普及的洋兰之一，仅次于膏特兰(Cattleya)和蝴蝶兰(Phalaenopsis)。它是一种名贵的气生兰，具有雍容华贵的外貌，色彩鲜艳的花朵，享有“兰花皇后”的美誉。尤其是当今的大花蕙兰品种，都是经过一百余年多代杂交选育出的优良品种。与原种比较，花型规整，花瓣宽，花朵优美，色彩艳丽而丰富，花茎直立而挺拔，花朵数目多且排列紧密，深受国内外兰花爱好者的欢迎，具有较大的市场潜力。如近期风靡日本、台湾等地的女皇就是由火花系统的品种与建兰杂交而育成的，其花草直立，花径为7-8cm，花为金黄色，具芳香味。真正是把大花蕙兰的花大、色艳和传统国兰悠雅花香的韵味相结合了。据报道，近几年的元旦春节市场上只有少量大花蕙兰销售，有四枝花一盆的，其售价可达500-600元，两枝花一盆的也可卖到150多元，并且极为旺销。但人多是一些花卉公司以整盆的方式从国外进口在国内销售的，价格昂贵。大花蕙兰如能在国内大批量种植，其售价完全可被普通消费者接受。 笔者选择大花蕙兰不同的外植体进行快速繁殖技术研究，旨在确定适合工厂化育苗的最适外植体及最优培养基配方，为大花蕙兰的大规模生产提供理论依据。第一章 绪 论1.1 大花蕙兰的生物学特性大花蕙兰(Cymbidium guandiflorium)是兰科(Orchidaceae)兰属中的一部分大花附生种类及其杂交种，具有假鳞茎，呈椭圆形，粗大；叶长5080厘米，叶宽24厘米，株高60150厘米不等，花葶40150厘米不等，叶色浅绿至深绿，标准花茎每盆35支，每支着花620朵。它是世界上栽培最普及的洋兰之一。大花蕙兰品种丰富，带有香味的品种有开黄色花的黄金小神童，开繁色花的台湾小姐，粉红色花的幸运阿里等。花型可分为大花、中花、小花等，花色有金黄、粉红、玫瑰红、艳红、洁白、黄绿等。1.1.1根中间空一格，以下同地生兰根是丛生的须根系，肉质，间或从须上生出分节支根，兰根概无根毛。一般蕙兰径约O5厘米，兰根内贮丰富的水分和养料，按根的结构可分为内、中、外三部分，最外层为包围全根的根皮组织，主要起着吸收和保护水分的作用，所以，对兰花浇水不宜过勤，否则土壤过湿，容易引起根部腐烂。根皮之内为皮层组织，皮层细胞都是活细胞，有的含有针状结晶，有的含有共生的根菌。当肉质根折裂时，其中有一粗约01厘米的黄白色纤维梗，称为中心梗，不易折断。兰根有兰菌与它共生，借此得到更多养料，促使繁茂，所以我国传统采移兰花必须带些宿土，且忌用利器挖掘，也就是这个道理。112茎地生兰没有明显的茎，只有根茎与花茎之别。在根、叶相接处有一肥大的假球茎，其形式有柱形、梭形、卵形、球形和扁球形，都向上着生，全露或微露在泥面上，在栽种时不应将它全部埋没泥中。假球茎的人小按种类不同而相异，大花蕙兰一般高约1-1.5厘米，径宽为l厘米左右。健壮的假球萃外面全由绿色叶片包覆着，至衰老后，叶片枯萎缩。裸露的假球茎呈黄色或黄绿色，这时假球茎上残留着枯老纤细的丝状叶痕物。假球茎按我国艺兰中俗称芦头、蒲头、龙头等，其中贮藏养料和水分，一般能有二、五年生命，当进入衰老期，还能衍生假球莲，每当黄霉至盛夏或初秋时季，从假球摹基部滋生出叶芽和花芽。另一种茎是花摹(即花葶、花梗)，外面包覆着数层苞叶1.1.3叶叶可分为寻常叶和苞叶二种。从假球茎上簇生出的叶称为寻常叶，呈线形或带形，无明显叶柄，叶束都一次长成，全缘或边缘有细锯齿，平行脉，常绿硬革质，叶面大多为暗绿色，叶背较淡，叶梢尖锐或圆钝。叶片中央的中脉向叶背凸出或微凸，借以支撑兰叶向上着生，虽受风吹飘摇仍不易折断。每五至七、八叶组成束(每束在我国兰艺中俗称为“筒”或“庄”，每束应以三片叶起算)。蕙兰每束标准应有35片叶，其他类稍多些。按我国传统艺兰，对蕙兰叶型，结合花瓣瓣型总结经验，认为凡叶尖起沟，兜到基部为佳，梅瓣的叶性较硬，水仙瓣之叶性糯，凡肥阔厚实，绝大多数出荷瓣或阔瓣花。另一种叶，就是包在花茎上的变态叶，由于退化变成膜质鳞片状，基部为鞘形，俗称为壳，在植物学上称为苞叶，它主要起着保护花蕾作用。苞叶基部最外两张有硬角质，内部几张呈现软膜状，蕙兰的苞叶的人小、宽窄、色彩都与瓣型有关。1.1.4花兰属的花都为不整齐花，花单生或由多个具长短略等的花，着生在长花茎上，排列成总状花序。就其花的构造来讲，有六瓣一蕊(柱蕊)，分为三轮。最外面一轮是形状相似的三片萼片，艺兰术语称为外三瓣。中间一轮三片俗称内三瓣，其上侧二片纵生平行，比外三瓣略短，俗称捧瓣；下侧一片俗称唇瓣或舌呈绒毛状，上面散布红色或紫红色点块，具有这种颜色者称为荤瓣花，如舌上呈纯绿、白、微黄色称为素瓣花。最里层，为雌雄蕊所组成的柱蕊，俗称鼻或香子，它是蕴藏香气的部分。柱蕊顶端为雄蕊，外有花粉盖，内有花粉室，含有花粉块，花药无柄，花粉块的下部有伸长的粉柄块，即胚茎，其基部有胶粘盘。在柱蕊的顶端微向前的下面有一凹洞，内有粘液，这粘液常被昆虫作为传粉时的媒个物。雌蕊由三枚结合的心皮组成，子房下位，侧膜胎座，胎座内含有多数倒生胚珠。1.1.5果实兰花的雌蕊受精后，花瓣逐渐凋萎，而子房逐渐膨人成绿色棍棒状，大约经过612个月，种果成熟，果皮由黄绿色转成褐色。果实概为柱形，具有三角，果实形状依种类不同而异，这是有助于鉴别分类的。兰科植物的果实均为蒴果，呈三角或六角形，每角自项至基部有粗约03厘米的长棱，称为果脊柱。当果实成熟时，每一果瓣平面中央的果脊枉自蒴果顶端弹开，果瓣产生倒锥形裂缝，便于种子从裂口溅出。兰花种子极为微小，细如灰尘，一般呈长纺锤形，用肉眼几乎辨认不清，每粒种子只有0305微毫克重量，它没有胚乳，只有一个简单的胚，外面包疏松、透明、不易透水的种皮，种皮上有许多增厚的术质化的条纹，胚内含有很少的养分，绝人部分为脂肪类的含物。由于兰花种子微小，数量多(每一蒴果内含有种子约一万粒左右)，同时种皮有很人的浮力和具有特别抗水湿能力，所以当种子外溅后，随水流传播亦无影响。兰花发芽率共低，又不易保存，以成熟后播种为好。1.2大花蕙兰的人工繁殖兰花的繁育分为有性繁殖和无性繁殖两种。有性繁殖主要利用播种繁殖，但兰花的很多品种在栽培条件下结种率很低，同时由于兰花的种子极小，胚发育不完全，没有提供营养的胚乳和其他组织，所以不易发芽，要借助共生的菌类供给养料才能萌发。许多兰花名贵品种实际上是一些自然突变体，如果用种予繁殖后代，往往造成这些后代中绝大多数个体丧失原品种具有的独特观赏价值。此外，有性繁殖还有繁育周期长的缺点，因此有性繁殖一般不作为工业化生产的繁育手段。兰花无性繁殖方式主要利用分株繁殖，然而一株健壮的兰花每年只能长出数个芽，年增殖率l一3倍，繁殖系数偏低。许多珍菇品种由于无法大量繁殖，致使一些品种的售价居高不下，每个叶芽高达几千元甚至万元以上。另外长期的无性繁殖造成病毒在植物体内积累，致使高中档兰花的品质下降。在欧洲、北美、澳大利亚、日本、韩国、台湾等国家和地区，植物组织培养技术已广泛应用于兰花的繁殖并成功地进行大规模商品化栽培生产，兰花正作为一种产业在迅速地发展。大花蕙兰是兰科兰属部分种类的杂交种，1889年在英国首次杂交成功的世界上第一个大花蕙兰人工杂交品种为韦奇(Cymbidium X vietchii)。由于当时播种技术有限，一定程度上限制了当时杂交育种工作的进行，之后随着繁殖技术的不断发展，进行了深入的杂交育种T作，不断出现新的杂交种。四五十年代大花蕙兰的杂交育种开始进入发展的鼎盛时期。1966年在美国长滩举办的第五届兰花会议的展览会中，大花蕙兰的杂交新晶种一举摘取了40枚奖牌，随后随着商品化的发展，大花蕙兰逐渐走俏世界花卉市场。由于大花蕙兰在市场上很受欢迎，新品种增加很快，每年都会出现一些新品种。随着新的栽培技术的应用与发展，无菌试管苗、组织培养等快繁技术的不断改进与发展，促使生产大花蕙兰的企业、公司遍及全球各地。1.3大花蕙兰的市场前景大花蕙兰在我国花卉市场中占有一个非常重要的位置，我国在发展人花蕙兰生产上在许多方面具有很大的优势，包括：首先，我国具有丰富的种质资源。兰科植物分布广泛，主要分布在热带、亚热带地区，大花蕙兰、兜兰、万代兰、蝴蝶兰及其它洋兰的原生种在中国均有分布，主要分布云南、广西、贵州、广东、台湾省华南和西南等地。其次，生产成本较低。针对中国劳动力价格低廉的优势，其它国家和地区的企业己经把工厂建在中国，比如同是洋兰家族的蝴蝶兰，至2004年，台湾拥有蝴蝶兰生产商300多家，其中己经有40多家进入人陆生产销售。最后，我国具有庞大的市场潜力。春节是大花蕙兰的主要销售期，是典型的节日高档礼品花卉。我国的大花蕙兰市场潜力巨人，随着经济水平的逐渐提高，人们对其需求也在逐年增加人花蕙兰，不但在年宵花卉中占据高档花卉的主要市场，而且在平日鲜切花、盆花、租摆用花市场中也占有重要部分。目前进口的优质人花蕙兰主要集中在人城市的花卉市场中，且消费群体还为少数，但随着经济的发展，大花蕙兰生产生产成本降低导致的产品价格下降，中小城市的市场和中低收入的群体将有可能成为新的消费群体。第二章 实验材料和方法2.1实验材料和器材从花市采购花期中的大花蕙兰，以大花蕙兰的叶片、花梗节间、花梗腋芽和茎尖作为外植体。 本实验所用到的实验器材有：天平、烧杯、玻璃棒、量筒、培养皿、广口瓶、移液管、药匙、培养基分装漏斗架、牛皮纸、剪刀、记号笔、称量纸、电炉、灭菌锅、pH计、超净工作台等。2.2试验方法2.2.1培养基的制备培养基的制备路线如下图所示 下图最好用文本框的形式固定，这样表内容不容易分裂！（点击上面插入文本框，在文本框内输入内容）：水、药品、糖 混合定容加热调节pH分装 琼脂 +水 加热预溶 灭菌 放冷凝固接种选用White、MS、12MS和B5为基本培养基，在此基础上添加不同浓度的细胞分裂素和生长激素组合配比试验。所有的培养基均用8.00g/L的琼脂固化，蔗糖浓度为25g/L，pH5.6，添加0.50g/L的活性炭(Ac)以防止外植体褐化，然后分装，在121条件下灭菌30 min。2.2.2材料的选取和灭菌选择大花蕙兰的叶片、花梗节间、花梗侧芽、茎尖等部位进行诱导培养。将采集的外植体用自来水冲洗干净，剪成小段放入烧杯中，滴入5滴洗洁精，震荡浸泡10min左右，流水冲洗干净后，在无菌工作台上进行表面消毒。在超净工作台上先用75酒精表面灭菌30 s，无菌水冲洗3次，再放入0.1Hgcl2溶液中浸泡，叶片、茎尖浸泡5min，花梗节间、花梗侧芽浸泡10min，其间不断摇动，然后用无菌水冲洗45次；用无菌滤纸吸干材料表面水分待接种。2.2.3培养条件温度25士2，环境湿度60-80，初期在黑暗条件下培养7-9d，以防止褐化，然后在光强度为2000-2500lx，每天光照11-13h条件下培养。第三章 结果与分析3.1不同外植体对原球茎诱导的差异外植体的接种：将大花蕙兰的嫩叶基部切去少许，正面朝上接种在培养基上；在解剖镜下用解剖针剥去茎尖外层幼叶，露出半球形的圆滑顶端生长点，用解剖刀切取带有1-2个叶原基的长约0.2-0.4mm的茎尖，直立向上接种在培养基上；将含侧芽的花梗节切去两端，切成1.5cm左右长的茎段，不含侧芽的节间切成0.4-0.6cm的小段，按生长极性分别插入到培养基中，以上每处理均为30瓶，每瓶接4个外植体。结果见表1表1不同外植体对大花蕙兰原球茎的诱导率整个图表内容字号应该小一级！下同培养基外植体消毒成活率诱导率MSMSMSMS嫩叶茎尖花梗侧芽花梗节间22.376.462.540.135.471.365.233.1由表l可知，在接种32d后，茎尖的消毒成活率最高达76.4，其次为花梗侧芽，成活率为62.5，花梗节间的成活率为40.1，叶片最差，为22.3；各外植体的原球茎（花梗侧芽萌发形成丛生芽）的诱导率，以茎尖最高，为71.3，花梗侧芽为65.2，花梗节间最低，为33.1%，叶片原球茎诱导率稍高于花梗节间，为354。3.2不同基本培养基对侧芽萌发诱导的差异在1/2 MS、MS、White、B5各培养基上分别接种带有侧芽的大花蕙兰花梗小段，每处理均为30瓶，每瓶接种4个外植体，重复3次，32d后统计各处理诱导率，结果见下表。诱导系数=形成丛生芽数成活外植体数100；诱导系数=形成原球茎总数形成原球茎外植体数。表2 不同基本培养基对大花蕙兰侧芽原球茎的诱导率培养基类型激素浓度（mg/L）椰乳浓度 （ml/L）诱导率（%）诱导系数6-BA NAA1/2MSMSWhiteB52.0 0.52.0 0.52.0 0.52.0 0.5100100100100617052542.142.181.922.19侧芽在各种培养基上培养10d左右时，芽体膨大伸长，幼芽突出，约30 d后小叶伸出，梗节处出现丛生芽。统计各培养基出芽情况，由表2可以看出， 在各培养基相同激素浓度条件下，MS培养基对大花蕙兰侧芽原球茎诱导效果最好，诱导率为70，诱导系数为2.18，其次是1/2MS培养基，诱导率也超过60%，B5培养基虽然诱导系数不低，但其诱导率偏低。3.3不同培养基对原球茎增值的差异将初代培养且生长正常的大花蕙兰原球茎转移到增殖培养基上。每个处理5瓶，每瓶5块，重复3次，30 d后统计数据，结果见表3。增殖系数=增殖原球茎总数增殖外植体数。表3 不同培养基对大花蕙兰原球茎的增殖系数编号培养基增值系数123456789101112131415161718MS+ NAA 0.20 mgL+ 6-BA 1.00 mgL MS+ NAA 0.50 mgL+ 6-BA 1.00 mgL MS+ NAA 1.00 mgL+ 6-BA 1.00 mgL MS+ NAA 0.20 mgL+ 6-BA 2.00 mgL MS+ NAA 0.50 mgL+ 6-BA 2.00 mgL MS+ NAA 1.00 mgL+ 6-BA 2.00 mgL MS+ NAA 0.20 mgL+ 6-BA 3.00 mgL MS+ NAA 0.50 mgL + 6-BA 3.00mgL MS+ NAA1.00 mgL + 6-BA 3.00mgL MS+ NAA 0.20 mgL+ KT0.20 mgL MS+ NAA 0.50 mgL+ KT0.20 mgL MS+ NAA 1.00 mgL+ KT0.20 mgLMS+ NAA 0.20 mgL+ KT0.50 mgL MS+ NAA 0.50 mgL+ KT0.50 mgL MS+ NAA1.00 mgL + KT0.50 mgL MS+ NAA 0.20 mgL + KT1.00 mgL MS+ NAA 0.50 mgL + KT1.00 mgL MS+ NAA1.00 m gL + KT1.00 mgL 8.058.988.527.888.278.117.327.117.436.445.107.465.385.475.814.124.593.78由表3可以看出，2号培养基的原球茎增殖系数最高，为8.98，18号最差，仅为3.78。细胞分裂素对大花蕙兰原球茎增殖的影响，6-BA效果明显好于KT；6-BA浓度中，2.00mgL和1.00mgL处理的增值系数虽然比较接近，但总体上后者效果要优于前者。当6-BA浓度为1.00mgL时，NAA浓度为0.50 mgL增值效果最好。24不同生根培养基对幼芽生根的差异 将5cm左右的丛生芽分成单株，接种到各生根培养基上，每个处理50瓶，每瓶1株，21天后长出绿色的粗根，统计各处理出根情况见表4表4 不同生根培养基对大花蕙兰幼芽的生根率编号培养基激素（mg/L）IBA NAA接种芽数/个生根芽数/个生根率/%12345678910MSMSMSMSMS1/2MS1/2MS1/2MS1/2MS1/2MS 0 0 0.5 0.5 0.5 0 1.0 0.5 1.0 1.0 0 0 0.5 0.5 0.5 0 1.0 0.5 1.0 1.0505050505050505050502629313533343836434152.058.062.070.066.068.076.072.086.082.0由表4生根率可以看出，诱导大花蕙兰生根的基础培养基中，1/2MS培养基普遍优于MS培养基，其中9号培养基生根率最高，达86.0%，和它接近的是10培养基，生根率也超过80%，由此可知，诱导大花蕙兰生根的最适培养基配方为MS +1.0mg/L IBA +0.5 mg/L NAA结 论本次对大花蕙兰组织培养的研究，对其整个操作实验过程都进行了深入的调查研究，为大花蕙兰的快速繁殖提供了可靠的工艺设计方案，同时也对一些技术问题作出了解答。（1）大花蕙兰组织培养过程中，采用同样培养基处理时，茎尖比花梗侧芽、叶片作为外植体效果都好。但用茎尖时，会损伤母株，造成浪费。而花梗侧芽离基质远，侧芽有苞片包被，带菌少，灭菌后，成活率也较高；叶片离基质近，带菌多，灭菌后成活率低。因此大花蕙兰外植体以花梗铡芽最好，既不浪费材料，接种后成活率又高，成活率在60%以上。（2）常见组培的基本培养基中，1/2 MS、MS、White、B5均能诱导出原球茎，从原球茎发生的数量和质量看，以MS效果最好。（3）对大花蕙兰原球茎进行增殖培养的最适培养基配方为MS+ 0.50mg/L NAA+ 2.00mgL6-BA。（4）大花蕙兰生根的诱导和培养基盐分浓度有关，低浓度下有利于根的萌发，激素浓度配比中，以1.0mg/L IBA 和0.5 mg/L NAA配比最适宜根的诱导。致 谢从论文选题到搜集资料，从写稿到反复修改，期间经历了喜悦和彷徨，在写作论文的过程中心情是如此复杂，但是最后，终于把我的论文写作任务成功完成，心情是无比的激动。首先，非常感谢我的导师刘彦珍老师。他为人随和热情，治学严谨细心，在论文的写作和措辞等方面他总会以“专业标准”严格要求我。从选题、定题开始，包括实验过程一直到最后论文的反复修改、润色，刘彦珍老师始终认真负责地给予我深刻而细致地指导，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。正是刘老师的无私帮助与热忱鼓励，我的毕业论文才能够得以顺利完成，谢谢刘老师。当然，也非常感谢我的室友们。同时也在忙于写作论文和做毕业试验的他们在百忙之中抽出时间帮助我搜集文献资料，帮助我理清论文写作思路，对我的论文提出了诸多宝贵的意见和建议。对室友的帮助表示真挚的感谢。参考文献你看对参考文献要求是否每篇要在文章中标注？1丁兰，付庭治兰花生物工程研究进展J明北师范大学学报(自然科学版)，2000，36(3)：111-1662胡松华大花蕙兰史略J，花卉，1995，53(1)：143卢思聪，潜力华贵夺目一派雍容的大花蕙兰J，中国花卉报4卢思聪，石雷大花蕙兰北京：中国农业出版社，2005 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