课件：分子流行病学th.ppt

第一章 分子流行病学 Molecular Epidemiology,第三篇 流行病学的应用,本章要点,第一节 概述 第二节 研究内容 第三节 研究方法 第四节 发展与应用前景,第一节 概 述,随着科学技术的发展，流行病学的发展总体上经历了三个大的转折。 19至20世纪初，医学微生物学与免疫学的发展，给流行病学研究提供了病原学与血清学的证据，从而有力地推动了传染病流行病学的发展； 20世纪中叶，现代统计学方法的建立与电子计算机出现，为分析性流行病学与多因素分析奠定了基础，从而得以深入地研究慢性疾病的复杂病因； 现代分子生物学与免疫学的迅猛发展，单克隆抗体与基因工程技术的产生，使流行病学能在基因与分子水平上研究疾病与健康的影响因素，观察疾病的流行病学规律，乃至揭示暴露因素引起疾病的致病机制。分子生物学等现代生物学技术引入了流行病学研究，在此基础上产生了一门崭新的分支学科分-分子流行病学。,一 产生的背景,(一)疾病预防控制中的需求 传染性疾病 耐药性质粒；病原体变异；新发现传染病。 慢性非传染病 多病因、多阶段、多基因、长潜隐期。 人群易感性 生物个体间的遗传和环境不同，易感性差异很大；传统流行病学无法有效测量。 实验医学 实验医学的病因假设和防治措施的人群检验。,(二)分子生物学的快速发展,理论的突破 如：DNA双螺旋结构，遗传中心法则，遗传密码子，RNA逆转录，断裂基因，操纵子模型，限制性内切酶，DNA聚合酶，DNA连结酶，染色体外遗传物质等。 技术的创新 凝胶电泳技术，核酸体外扩增，DNA测序，蛋白质测序，分子杂交，基因克隆，色谱技术，计算机应用。,二 分子流行病学的产生与发展,概念的演变 定义 分子流行病学的发展,(一)概念的演变,国外： 1972年提出“流感分子流行病学”的名词。 1977年英国的定义：分子流行病学是应用精细技术进行生物材料的流行病学研究。,1986年定义：分子流行病学的核心在于把先进的实验室方法和分析流行病学结合起来，从而查明环境和宿主病因。 1993年定义：分子流行病学是在流行病学中应用生物标志或生物学测量。 1996年定义：分子流行病学狭义上讲是测量作为暴露和效应的生物标志信息大分子：DNA、RNA和蛋白质。,国内： 1988年：分子生物学理论和技术应用于流行病学的边缘学科，主要是通过对造成某一疾病流行的病原体，在基因水平上分析其特征，从而更准确地解决传染源和传播途径等有关流行病学问题。 1992年：利用分子生物学原理和技术，从分子乃至基因水平上研究医学事件在人群和环境生物群众的分布及其决定因素和调控手段的学科。,(二)定义,分子流行病学 是阐明人群和医学相关生物群体中生物标志的分布及其与疾病/健康的关系和影响因素，并研究防治疾病、促进健康的策略与措施的科学。 生物标志（biological marker，biomarker，简称M） 指能代表生物结构和功能的可识别物质。分子事件（molecular event）或分子生物标志（molecular biomarker）主要指代表生物结构和功能的生物大分子特征。如DNA、RNA、蛋白质等。,分子流行病学与血清流行病学,应用血清学方法对血清中各种成分（包括抗原、抗体、代谢产物、生化物质、营养成分及遗传因子等）的出现和分布进行研究，以阐明疾病及健康状态在人群中的分布及其影响因素，并在采取预防措施后应用血清学方法来考核其效果。 1950年Paul等首先提出“血清流行病学” 。 1960年WHO建立了三个血清参考库，分别设在美国耶鲁大学、原捷克斯洛伐克布拉格流行病学和微生物学研究所和南非约翰内斯堡医学中心。,分子流行病学与人类基因组流行病学,1998年由Khoury和Dorman提出人类基因组流行病学(human genome epidemiology, HuGE)的概念，定义：应用流行病学与基因组信息相结合的研究方法，开展以人群为基础的研究，评价基因组信息（基因或基因变异及其相应编码的产物）对人群健康和疾病的流行病学意义。,(三)分子流行病学的发展,研究内容更加丰富 从最初研究传染病的传染源、传播途径，病原体检测鉴定等，到疾病和健康状态相关生物标志的分布、影响因素、人群易感性、防治效果评价及病原生物的群体进化与变异规律和检测手段研究等。 研究手段越来越多 除应用传统流行病学的群体调查研究方法外，还应用分子生物学方法和技术。 应用范围不断扩大 不仅限于预防医学，流行病学、基础医学、生物学、遗传学、环境科学和人类学等领域也有应用。,三、与传统流行病学关系,健 康 者,“海平面”,图16-1 疾病的“冰山现象”,亚临床者,患者,I、病例为基础 II、冰山现象 III、生物标志为基础,分子流行病学与传统流行病学既是一个统一体，又有各自不同的特征。我们把从暴露到疾病发生的连续过程称为暴露发病连续带（EDC），从暴露到健康的连续过程称为暴露健康状态连续带（EHC）。 传统流行病学在研究暴露与疾病关系时，常常使用“黑箱”原理。虽然发病和死亡测量可以直接反映人群疾病和健康状态，但由于黑箱的存在，使暴露与疾病关系的判断显得缺乏直接证据；而且对于疾病易感性的研究也仅仅限于在整个发病过程中的粗略估计，无法判断EDC进程中不同阶段的易感性情况。分子流行病学则不仅可以阐明EDC/EHC进程中不同阶段的暴露效应关系(即因果关联)，也可以研究EDC/EHC不同阶段机体易感性的具体特征和意义，以揭示传统流行病学中的“黑箱”秘密，使其成为“白箱”，以阐明疾病发生、发展过程及其规律；而“白箱”中的各种生物标志，又可以成为分子流行病学进一步研究的工具，作为暴露标志、易感性标志、效应标志研究人群中疾病/健康的影响因素、防治策略与措施，并准确评价其效果。因此，从“黑箱”到“白箱”，再到“工具箱”是分子流行病学研究的重要内容，也是分子流行病学对流行病学发展的最大贡献。,健 康 疾 病,主观感觉,客观指标,健康指标,疾病指标,模式I 暴露因素 健康态 潜在疾病态临界疾病态亚临床态临床态 机体易感性因素,模式II,健康疾病连续带示意图,亚健康态,潜在疾病态,健康态,临床态,亚临床态,临界疾病态,任何生命现象都具有生物分子基础，疾病的发生、发展过程也表现为一系列相关分子事件的相互作用及分布变迁，传染病是这样，慢性非传染性疾病也是这样，这就是分子水平的疾病自然史，也称为健康疾病连续带(health-disease continuum，HDC)。,A 暴露 疾病 易感性,分子流行病学,B 暴露内暴露早期生物学效应结构和功能变异临床疾病 易感性 暴露内暴露早期生物学效应续发生物学效应健康状态 易感性 传统流行病学与分子流行病学的关系,传统流行病学,传统流行病学在研究暴露与疾病关系时，使用“黑箱”原理。虽然发病和死亡测量能反映人群疾病和健康状态，但由于黑箱的存在，使暴露与疾病关系的判断显得缺乏直接证据；而且对于疾病易感性的研究也仅限于在整个发病过程中的粗略估计，无法判断EDC进程中不同阶段的易感性情况。 分子流行病学则不仅可以阐明EDC/EHC进程中不同阶段的暴露-效应关系(即因果关联)，也可研究不同阶段机体易感性的具体特征和意义，揭示 “黑箱”秘密，使其成为“白箱”，以阐明疾病发生、发展过程及其规律. “白箱”中的各种生物标志，又成为分子流行病学进一步研究的工具，作为暴露标志、易感性标志、效应标志研究人群中疾病健康的影响因素、防治策略与措施，并准确评价其效果。,第二节 研究内容,生物标志（测量指标）的研究 暴露测量及其与疾病的关系 效应测量及其与疾病的关系 易感性测量及其与疾病的关系 疾病防治效果评价,生物标志,暴露标志 与疾病或健康状态有关的暴露因素的生物标志，包括外暴露标志和内暴露标志。 效应标志 指宿主暴露后产生功能性或结构性变化的生物标志，如突变的基因、畸变的染色体等。 易感标志 指宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志。主要与遗传特征、生长发育、营养、免疫、机体活动等有关。,生物标志 暴露测量 效应测量 易感性测量 防治效果评价,外暴露标志 是指暴露因素进入机体之前的标志和剂量 如病毒、细菌、生物毒素、吸烟烟雾、环境物质等 内暴露标志 指暴露因素进入机体之后的标志 对生物性病原因子，可以是生物病原因子本身、其代谢产物或与宿主体内生物大分子结合产物，像病毒整合基因、生物毒素-DNA加合物等 对非生物性病原因子,可以是体内转运分子、代谢产物或与宿主靶体结合物等,实用性 EDC不同阶段的候选生物标志的特性、在疾病过程中的意义、检测方法等都需要进行深入研究，然后根据研究目的和生物标志与所要代表EDC进程中特定阶段的关联程度进行筛选。 可信性 可信性强 有效性 灵敏度和特异度，注意区分流行病学的灵敏度和实验室测量中所谓的敏感性的不同,生物标志检测方法,暴露测量,外暴露研究 指环境因素暴露，分为生物性因素和非生物性因素。作为分子流行病学测量的生物标志一般是生物性病原因子，如病原生物、生物毒素等。,生物标志 暴露测量 效应测量 易感性测量 防治效果评价,生物性病原因子检测鉴定 流感嗜血杆菌 病原生物进化变异规律研究 根据病原体的基因型或其它分子生物学特征，判断它们之间的遗传关系，从而确定传染病或传播途径。 确定传播途径 S.munchen菌感染 非生物性因素的暴露测量确定其与内暴露和早期生物效应的关系，为进一步的病因研究提供依据。吸烟烟雾,内暴露研究,传染性疾病 感染状况 传染源追踪,慢性非传染性疾病 内暴露水平：由于个体差异以及物质的特性和暴露途径的不同等，外暴露水平有时不能确切评判其在疾病中的意义。而体内暴露水平的测量不仅可以研究外暴露与内暴露的关系，也可以为下一步确定其与早期生物效应之间的关系提供有力的证据。Fg:血液中烟草代谢产物可替宁-吸烟暴露相关 生物作用水平：,效应测量,传染病 免疫效应:阐明流行规律、制定防控对策，免疫效果评价 病理性效应:了解感染情况及影响因素，致病特征及预后。 慢性非传染病 健康状态:通过人群中健康状态相关生物标志的分布及其影响因素如生长、发育和衰老等，可以为阐明健康分布规律、制定促进健康的策略和措施、评价干预效果提供科学依据。,生物标志 暴露测量 效应测量 易感性测量 防治效果评价,易感性测量,遗传性疾病 Huntington病应用分子流行病学方法很快确定了HD基因紧密连锁遗传位点D4S10及其DNA标志。 慢性非传染病 载脂蛋白E(apoE)不同基因型在动脉粥样硬化和冠心病发病中的易感性是不同的。 传染病 不同基因特征的人群对HIV、HBV的易感性也具有很大差异。,生物标志 暴露测量 效应测量 易感性测量 防治效果评价,疾病防治效果评价,预防接种效果评价 预防接种相关发病研究 慢性非传染病防治效果控制,生物标志 暴露测量 效应测量 易感性测量 防治效果评价,第三节 研究方法,测量指标 标本采集 现场调查研究方法 实验室检测技术 研究设计 资料分析,测量指标的选择的原则,生物标志应特异、稳定 标本采集、储存方便 检测方法比较简单、实用，而且操作规范，便于 与同类研究结果比较 检测方法灵敏度和特异度高,测量指标,暴露指标 最好能代表接触剂量或生物作用剂量 易感性指标 一般选择抗体水平作为传染病易感性指标， 易感基因及其表达产物等作为心脑血管病、恶性肿瘤、糖尿病、遗传病等慢性非传染病的易感性标志。,效应指标 一般以最早期生物效应标志作为探索暴露因素的致病作用或干预措施的短期效果评价指标，如抗体产生、代谢异常、基因表达异常等 选择结构和功能改变作为确定暴露的致病作用和早期诊断、早期预防的指标 临床诊断标志作为干预措施长期效果评价或预后的指标,标本采集,生物标本 一般包括病原的和人体的生物标本。常用的有：微生物标本、血液（血清）标本、组织标本、其他生物标本（如唾液、胃液、尿液、精液、粪便等） 生物标本库 通常将储存有一种类型或多种类型生物标本，并能保持它们的生物活性以供研究之用的系统称为生物标本库(biological specimen bank, BSB)，如血清库、组织库、病原生物库等。,生物标本采集和储存 分子流行病学研究成功的关键 要求 在采集和储存过程中不能受到“污染” 储存的生物标本在任何时候进行检测都可以获得一致的结果 所有的生物标本都应有详细的背景材料和鉴别标识,现场调查研究方法,一般需要的样本量相对较小 不宜作大规模现场调查研究 分子流行病学在横断面研究中多是小样本抽样调查，在分析性研究中多为病例对照研究、队列与病例对照结合的巢式病例对照研究、病例-病例研究等，在实验性研究也多采用小样本随机对照试验。,实验室检测技术,核酸技术 核酸电泳图谱 核酸酶切电泳图谱 核酸分子杂交 核酸体外扩增 核酸序列分析 蛋白质技术 凝胶电泳、蛋白转印杂交、蛋白质测序 酶学技术 多位点酶电泳法 生物芯片技术 基因芯片 其他技术 免疫学技术 如酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光免疫试验(FIA) 等；色谱技术 如高效液相色谱技术(HPLC)等,研究设计,研究目的 充分考虑创新性、实用性、可行性 测量指标 生物标志是否特异、稳定，标本采集是否方便，是否有灵敏而特异的检测方法 测量方法 简便、成熟，灵敏度和特异度高 调查方法与样本 样本有代表性，适量 结果与分析 设计中要预测研究结果，并根据选择的测量指标和测量方法确定资料分析方法 质量控制 注重现场质量控制的同时，特别重视实验室的质量控制 注意事项 预实验,资料分析,传统流行病学分析 生物标志发生率、检出率 血清流行病学分析 抗体的几何平均滴度、阳 转率、感染率等 遗传多态性分析 等位基因频率、遗传多态 度、杂合度等 遗传关系分析 基因型、克隆、克隆群,基因型(genotype)：具有相同遗传结构的一类生物体。 克隆(clone)：广义 许多生物特征（表型或基因型）相同的生物体，虽然分离来源、地区、时间可能不同，但它们的这些特征几乎只能解释为共同来源，则这些生物体称为一个克隆。狭义 一个生物体的无性繁殖群体，称为一个克隆。 克隆群(clone cluster)：遗传关系非常紧密的多个生物克隆，可以划分为一个克隆群。,实例一 研究题目 波兰某工业区环境中芳香族化合物暴露人群的DNA加合物研究 测量指标 DNA加合物/淋巴细胞DNA（介质） 测量方法 采集血液淋巴细胞，应用荧光检测竞争ELISA法和DNA加合物32P后标记技术。 研究设计 采用横断面分析研究；选择煤焦油作业工人为暴露组，当地城市居民和近郊农民分别为对照组。排除年龄、吸烟、其他职业暴露等因素的影响；比较3组DNA加合物水平。,结果分析 结果：当地城市居民（19例）与煤焦油作业工人（63例）的DNA加合物水平相似，而近郊农民（15例）的DNA加合物水平与煤焦油作业工人相比,仅为后者的二分之一或三分之一。结论：环境中芳香族化合物（煤焦油）暴露可导致体内DNA加合物水平升高。 质量控制 每份标本都同时在2个不同实验室进行检测。结果具有很好的一致性(r=0.66, p0.01)。,实例二 研究题目 应用HBV-DNA序列多态性研究HBV的传播 测量标志 第2551-2650位点核酸序列/血清HBV-DNA（介质） 测量方法 ELISA法和PCR法 研究设计 类病例对照研究：96名HBeAg阳性儿童和用ELISA检测HBV血清阳性的97名父母；假设该位点核酸序列在儿童与父母之间分配是随机的。 结果分析 结果：该序列在儿童和父母之间是非随机分配的（P0.00005);结论：HBV具有家庭内传播。 质量控制 关于家庭成员之间1%的序列差异的解释。排除了PCR错配可能。,实例三 研究目的 应用PCR测序追踪HIV传染源 测量指标 HIV/外周血单核细胞（介质） 测量方法 PCR和核酸测序 研究设计 横断面调查：1名牙科医生（HIV携带者，可疑传染源），7名HIV感染者（都曾接受该牙医的治疗）；35名当地与牙医无关的HIV感染者。比较这些HIV毒株之间的关系。 结果分析 牙医的HIV株与其曾治疗的5名病人的HIV株具有克隆关系，而与其他毒株遗传关系较远。结论：牙医是其曾治疗的5名病人的HIV的传染源。,第四节 发展与应用前景,传染病预防控制 慢性非传染病预防控制 健康状态研究,传染病预防控制,病原体耐药、新病原体的出现、病原体变异、发病谱的变化、传染源的判定、传播途径复杂化、疫苗免疫效果下降等，大多需要应用分子流行病学来解决。 病原体研究：如病原体的分布及其影响因素、病原体的流行病学分类和检测鉴定、病原体群体进化变异规律及影响因素 人群感染和传染源研究：如感染类型及群体发病谱、传染源确定等。 传播途径研究：确认与流行传播规律、传染来源追踪等。 人群易感性研究：群体中对重要传染病的特异抗体进行检测、易感基因分布及其与流行的关系等研究。 疫苗及免疫预防制剂的研究：免疫效果研究、高效安全新型疫苗研制等。 防治对策和措施研究及其效果评价：如干预对感染率、发病率、发病谱的影响，免疫预防效果评价、疫苗相关病例的研究、疫苗逃逸病例的研究等。,慢性非传染病预防控制,暴露测量更加科学、准确；如将暴露测量分为外暴露、内暴露、生物作用剂量等； 细微效应可以察觉，可以测定健康疾病连续带不同阶段的效应指标； 易感性研究深入到基因和分子水平； 防治措施效果评价更加有效。,健康状态研究,医学研究对象是病人，在漫长的医学实践中，主要是探讨疾病的发生原因、诊断、治疗和预防。现代医学则不仅表现在防治疾病，也非常重视促进健康。流行病学不仅关注病人群体，也关注非病人群体，不仅关注疾病状态，也关注健康状态；所以，流行病学是健康医学的主力军。 由于科学发展的限制，过去流行病学对健康的研究尚无很大贡献；分子流行病学的出现开启了流行病学进军健