课件：微生物发酵产酶.ppt

1,Chapter 2 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism,微生物发酵产酶,2,酶的生产方法,提取分离法 血液中提取SOD；木瓜中提取木瓜蛋白酶；动物胰脏中提取胰蛋白酶。来源：器官、组织、细胞。 受到生物资源、地理环境、气候条件的影响。 生物合成法 微生物发酵产酶；（枯草芽孢杆菌生产淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶；曲霉产糖化酶等） 植物细胞培养产酶；动物细胞培养产酶。 化学合成法 成本昂贵，效果不好。一般只用于实验室研究,3,定义：利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。,利用微生物产酶主要原因： 微生物种类繁多，分布广泛。可以根据不同的需求从环境中筛选出相应的微生物。 繁殖迅速、代谢能力强。短时间内可获取大量细胞和酶类。,微生物发酵产酶,4,章节内容,一、酶生物合成调节理论,三、酶的发酵工艺条件及控制,四、酶生产过程的动力学,二、产酶微生物,5,一、酶生物合成调节理论,生物体对千变万化的环境采取的一种适应性策略。遵循节约、经济、实用的原则。,组成型酶（Constitutive enzyme）：生物细胞中合成的酶的量比较恒定，这些酶的合成速率变化不大。 调节型酶（Regulated enzyme）：生物细胞中合成的酶的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。,了解生物体的合成调节模式，有利于在酶的生产采取相应的措施以提高酶产量。,6,调节酶生物合成的方式主要有： 转录水平的调节 转录产物的加工调节 翻译水平的调节 翻译产物的加工调节 酶降解的调节,转录水平的调节是原核生物最常用也最实用的一种调节方式。直接在源头决定产物是否表达。,7,原核生物的调节理论,3. 反馈抑制作用,2. 分解代谢物的阻遏作用,1. 酶合成的诱导作用,生物体采用何种调节模式都存在一定的生物学意义,8,1. 酶合成的诱导作用,加入某些物质，能够使酶的生物合成开始或者加速进行的现象称之为酶的诱导作用。,乳糖操纵子理论（Jocob & Monod,1960）,9,实验现象：,已知与分解利用乳糖相关的酶类有：-半乳糖苷酶(lacZ)、 -半乳糖苷透过酶(lacY)和-半乳糖乙酰化酶(lacA) 。 1. 大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内上述三种酶基本不合成； 2. 大肠杆菌生长在以乳糖为唯一碳源培养基上时，三种酶都大量合成，达到细胞总蛋白量的6%7%左右； 3. 当再次换回葡萄糖培养基时，三种酶又基本消失；,经济性原则：有需要，才合成！,10,乳糖操纵子（Jocob & Monod,1960）,在原核生物细胞中，多数基因是按照功能相关性而组成基因群共同存在。单个基因群在同一操纵体系下进行表达和调节。,对基因表达进行统一控制的完整单元称为操纵子。一个操纵子包括结构基因、调节基因、操纵基因和启动基因等。,理论支撑,11,乳糖操纵子模型,无乳糖存在的情况下，阻遏蛋白与操纵基因结合，阻碍RNA聚合酶与启动基因的正常结合，转录关闭。 乳糖存在的情况下，乳糖在- 半乳糖苷酶的作用下生成别乳糖，与阻遏蛋白结合改变其结构，使之从操纵基因上解离；RNA聚合酶与启动基因结合，开启转录。,12,在乳糖操纵子中，除阻遏状态（乳糖诱导）与阻遏状态下（无乳糖诱导）的- 半乳糖苷酶的酶产量比例约为1000 : 1。 正常情况下，细胞会本底产生极少量(15个)- 半乳糖苷酶和透过酶。用于监测环境中是否存在乳糖，监测到便可将乳糖生成别乳糖进行诱导作用，而打开结构基因的表达。,在没有-半乳糖苷酶(lacZ)、 -半乳糖苷透过酶(lacY)的情况下，细胞怎样进行乳糖的吸收利用？,13,与分解代谢相关的酶常采用这种调节模式，目的就是避免浪费。比如半乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子等。 在相关酶的生产中可以考虑加入酶的诱导物，从而提高酶产量。,14,原核生物的调节理论,3. 反馈抑制作用,2. 分解代谢物的阻遏作用,1. 酶合成的诱导作用,15,2. 分解代谢物的阻遏作用,指一些物质经过分解代谢产生的物质会阻遏某些酶生物合成的现象； 当培养基中含有多种能源物质（比如同时存在葡萄糖和乳糖）时，微生物首先利用易于分解利用的能源物质（葡萄糖），而这种首先被利用的物质的分解可以阻碍微生物对另外一种能源物质的利用。,葡萄糖效应（二次生长现象）,16,实验现象：,细菌在只有葡萄糖的培养基中生长的时候，可以利用葡萄糖。 细菌在以乳糖为单一碳源的培养基中生长的时候，可以利用乳糖。 细菌在葡萄糖和乳糖培养基中生长的时候，只利用葡萄糖，而不利用乳糖！,二次生长现象,17,葡萄糖效应理论,乳糖操纵子的启动基因内，除RNA聚合酶结合位点外，还有一个称为CAP-cAMP复合物的结合位点。,理论支撑,其中，cAMP 是环腺苷酸，CAP是称为cAMP受体蛋白，当CAP与cAMP结合为复合物后结合到CAP-cAMP结合位点，激活启动基因，使RNA 聚合酶在启动子处能解开DNA双链。,18,细胞内分解葡萄糖的酶类属于组成酶，当同时存在葡萄糖和乳糖时，细胞能够优先分解葡萄糖，其中产生了阻碍乳糖操纵子转录的因子，这种阻遏因子与cAMP-CAP的结合有关。,所以乳糖结构基因要表达，除了RNA聚合酶能够结合在启动子上，还需要cAMP-CAP在结合位点上的结合。,19,葡萄糖效应模型,只要外界存在葡萄糖，细胞会优先并迅速分解葡萄糖产生大量ATP； AMP的浓度ATP产生因此降低，使体内cAMP转化为AMP，进而降低cAMP浓度； 同时腺苷酸环化酶的活性受到抑制。 最终结果：cAMP浓度不足，无法形成CAP-cAMP复合物，转录关闭。,20,凡是在降解过程中能被转化成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物的糖代谢（乳糖、半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等）中，其有关酶都是由这种cAMP-CAP诱导控制的。 即只要有葡萄糖存在，这些操纵子就不会表达。,21,原核生物的调节理论,3. 反馈抑制作用,2. 分解代谢物的阻遏作用,1. 酶合成的诱导作用,对于多数与分解代谢相关的酶类，微生物采用诱导和分解代谢物阻遏调节，目的是为了不没有必要的蛋白，避免浪费，提高自身环境适应力。,乳 糖 操 纵 子,22,3. 反馈抑制作用,酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使酶的生物合成受到阻遏的现象。,色氨酸反馈阻遏 -（阻遏型操纵子、衰减子）- 色氨酸作为色氨酸合成代谢的代谢终产物会反过来抑制色氨酸合成代谢中的一系列酶！,23,色氨酸阻遏型操纵子,无色氨酸时，阻遏蛋白无活性，RNA聚合酶起始转录。 当存在色氨酸时，色氨酸作为共阻遏物与调节蛋白TrpR结合，进而通过构象改变，TrpR与启动子结合而阻止RNA聚合酶结合，基因关闭。,24,1. 色氨酸操纵子阻遏蛋白的阻遏效率比较低 对色氨酸操纵子阻遏蛋白进行体外实验，研究表明此阻碍蛋白在无色氨酸与有色氨酸的情况下的色氨酸合成酶的表达量仅相差70倍（乳糖操纵子阻遏蛋白为1000倍）。 2. 实际产酶分析结果与体外实验不一样 实际产酶情况发现，在高浓度Trp和低浓度Trp的情况下色氨酸合成酶的表达量相差约600倍，与理论抑制程度的70倍多出来近10倍。, 衰减子,But,多出来的抑制效果必然存在其他的调节系统？为什么要多这样一个调节系统呢？,衰减子 是一种广泛存在于原核生物合成途径酶类（氨基酸合成酶，核苷酸合成酶等），由翻译水平和转录水平共同搭配而成的细微调节模式 。,25,trp E基因(E),操纵基因(O),前导肽特点1：编码区含有重复Trp,26,UGA,终止子信号,UGA,特点2：转录出RNA序列可形成双双互补结构， 其中3-4互补将形成终止子结构,前导肽,27,在原核生物中，翻译和转录是同时进行的，为衰减子的两者搭配调控提供可能。,色氨酸衰减子工作原理,当trp-tRNA供给不足，核糖体在重复trp序列(序列1的中间位置上)上停止。 当trp-tRNA供给充足，核糖体顺利通过重复trp序列在UGA（核糖体占据序列1和部分序列2）处停止。,前导肽翻译的过程中，重复的Trp密码子迫使核糖体在此处合成减慢；决定核糖体前进的因素是外界Trp-tRNATrp的供给量。,序列1结合核糖体；2-3配对；4独立 - 无终止信号，转录继续,核糖体停留在序列1和2的连接（UGA）处，占据部分1和2的序列； 序列3-4配对，形成终止信号 - 转录终止。,28,终止子,29,色氨酸反馈阻遏调节分析（阻遏操纵子+衰减子）,阻遏操纵子：共阻遏物为Trp，在有Trp和没有Trp的情况下阻遏效率约为70倍。 仍允许部分RNA聚合酶通过操纵位点继续转录。 衰减子：共阻遏物为Trp-tRNA，在Trp-tRNA充足和Trp-tRNA缺乏的情况下阻遏效率约为10倍。 RNA聚合酶转录出前导链之后，根据Trp-tRNA是否充足决定后续相关合成酶的基因的转录是否继续。,两种作用模式共同决定了 色氨酸合成酶反馈抑制效率为700倍。,外界适当的Trp量是保证Trp-tRNAtrp充足的必需条件，但不是充分条件。,30,无 Trp，阻遏操纵子，支持转录；衰减子，支持转录。 有Trp少量，而却未达到合成前导肽所需要的Trp-tRNA的量。阻遏操纵子发挥70倍阻遏；而衰减子依然支持转录。 当有大量Trp存在，Trp和Trp-tRNA都充足。两者共同发挥作用，达到最大阻遏效率700倍。,阻遏操纵子+衰减子的调节结果,通常是体 外添加Trp,通常是体 内合成Trp,这种调节保证了细胞内总是具有一定浓度的Trp，是细胞自给自足的基础。,31,色氨酸合成酶的调节是一种逐渐过渡的模式，有别于乳糖操纵子的非开即关。,乳糖分解调节,色氨酸合成调节,32,衰减子模型普遍存在于氨基酸和核苷酸的合成调节当中,Thr,his,phe,Leu,Why & How,33,原核生物的调节理论,3. 反馈抑制作用,2. 分解代谢物的阻遏作用,1. 酶合成的诱导作用,乳糖操纵子模型,葡萄糖效应,色氨酸阻遏型操纵子、衰减子,或有或无， 需要才合成,确保一定有，但要控制量,生物体对于不同的营养物是区别对待的,要想提高某酶的产量，我们或许能够,34,章节内容,一、酶生物合成调节理论,三、酶的发酵工艺条件及控制,四、酶生产过程的动力学,二、产酶微生物,35,对酶生产菌的要求 产酶量高，最基本，最重要的条件。 产酶稳定，传代过程中不易发生变异、退化。 最好是胞外酶，方便发酵产物的纯化。 不是致病菌，不产生毒素等有毒代谢物。 酶作为天然提取物可以认为是安全的，但在酶分离纯化中可能会带入一些致病素，所以要对产酶微生物进行安全检查，尤其是在医药和食品用酶特别重要。 用于食品工业的微生物（枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、乳酸菌等）已经有了充分的安全记录，可以直接采用；其他非致病性的微生物需要做一个短期的毒性试验；对于非常见的微生物则需要做广泛的毒性试验，包括慢性中毒试验。 容易培养，营养要求低,36,2. 如何获取产酶微生物 生产菌可以从菌种保藏中心和有关研究部门获取，但主要还是从自然界进行筛选。,2.1 取样：由微生物的分布规律决定 从富含该酶作用底物的场所取样（筛选蛋白酶产生菌从堆放鱼、肉、虾等蛋白质的地方采样、或者从肉食动物的粪便中采集；在堆积腐烂纤维素的地方筛选产纤维素酶的菌） 大多数产酶菌生长条件接近于酶活性的最适条件（温泉中分离耐热的降解淀粉的假单胞菌；海洋中分离可产耐盐耐压的酶的生产菌）,37,富集培养：在采集的样品中加入某些物质，使特定微生物繁殖成优势菌，而方便在分离纯化中被分离。,富集不同种类的微生物（细菌、霉菌、放线菌） 肉汁琼脂培养基培养细菌；察氏培养基培养霉菌；高氏培养基培养放线菌。如有必要，可辅助添加一些药剂以提高分离效率。如细菌培养中加入制菌霉素以抑制霉菌；霉菌培养中加入青霉素或链霉素以抑制细菌。 富集不同生长性质的微生物 酸性或碱性培养基；高浓度无机盐培养基；高温或低温条件培养；加入苯酚，抗生素；微生物作用底物等,2.2 筛选（富集 初筛 复筛）,所需微生物在混杂体系中的比例通过富集得到提高,38,初筛： 从富集培养物中初步筛选得到单个目标菌株的过程。利用平板来分离纯化所需菌。通常通过添加酶的底物和相应指示剂来制备鉴别平板或通过筛选平板筛选。,例1： 蛋白酶菌株筛选,例2： 淀粉酶菌株筛选,通过初筛获得了具有产酶能力的纯种微生物,39,复筛： 通过初筛获得了单个的具有产酶能力的微生物，但其在实际发酵中的产酶性能如何？ 在初筛的基础上选出用于发酵生产的高产菌。,一般用接近于生产的培养条件对初筛菌株逐个做摇瓶培养试验，最终选出一个或两个产酶能力最强的菌株。,40,产酶微生物的筛选过程,采集样品,富集培养,初筛,复筛,很多,目标菌比例提高,3040株,23株,获取可能含有目标菌的样品,使目标菌在混杂体系中比例增大，提高筛选几率,平板筛选，初步筛选出产酶菌,摇瓶培养，筛选出适于发酵生产的高产菌,41,菌种改良： 自然界分离到的野生菌株产酶能力一般都不高，很少能直接适用于工业化生产，所以需要对野生菌株进行改良。目前工业上使用的菌株几乎都是经过选育过了的菌株。 常用改良方法有： 紫外诱变 原生质体融合技术 DNA重组 DNA Shuffling 通过改良，-淀粉酶的活力已经达到10000U/mL，是20世纪50年代的50倍,DNA改组（DNA shuffing）,42,筛选热点与新技术,1. 极端微生物 不可培养微生物 自然界中仅有很少一部分的微生物可以在实验室纯培养，另有95%以上的菌株是不能利用纯培养的，称为不可培养微生物(VBNC，viable but non culturable)。这是生物资源的巨大宝库，如何获取这些微生物的资源？,宏基因组策略 (Metagenome),43,基因文库的建立,细胞A,提取总DNA,核酸酶处理成小片段,把小片段与基因载体连接，导入宿主体中，使稳定遗传。,其总和称为细胞A的基因文库,宏基因组策略,环境样品 （土壤或水样等）,44,3. 常见的产酶微生物,目前工业主要用酶： 蛋白酶占59%、糖化酶13%、 -淀粉酶5%、葡萄糖异构酶6%、果胶酶3、脂肪酶3%、其他医药与分析研究用酶占10%。 主要用于生产的微生物： 细菌：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 放线菌：链霉菌 霉菌：曲霉、根霉,45,(1) 大肠杆菌(Escherich coli),大肠杆菌产酶一般都属于胞内酶，所以通常需要经过细胞破碎才可分离； 由于遗传背景清楚，常作为基因工程菌的宿主。 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等的主要来源。 工业生产青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶、谷氨酸脱羧酶和天冬酰胺酶等；,46,(2)枯草杆菌（Bacillus subtilis）,枯草芽孢杆菌是工业上应用最广泛的产酶微生物之一，所生产的-淀粉酶和蛋白酶等都是胞外酶； 主要生产-淀粉酶，蛋白酶，-葡聚糖酶，碱性磷酸酶等；枯草杆菌BF7658 是国内用于生产-淀粉酶的主要菌株。,47,(3) 放线菌,放线菌是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物，常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌。 主要应用：链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶等 。,48,(4) 曲霉(Aspergillus),主要应用：蛋白酶、淀粉酶、果胶酶等。,(5) 根霉(Rhizopus),主要应用： 淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、脂肪酶等；,49,本章内容,一、酶生物合成基本理论,三、酶的发酵工艺条件及控制,四、酶生产过程的动力学,二、产酶微生物,50,酶发酵生产的工艺流程,活 化,扩大培养,保藏菌种,培养基,发酵产物,发酵生产,种子菌液,51,活化：把处于休眠状态的菌株唤醒，使其恢复生命活性； 扩大培养（种子菌液）：活化好的菌体经过扩大培养获得下一级发酵罐所需的接种量；,扩大培养的培养基要与发酵罐中的培养基成分接近；N源丰富，利于细胞生长。 选用对数生长期的菌液，活力最强，适应环境能力最强；菌龄过年轻发酵周期延长、菌龄过老导致生产力减弱。 适中。过少，发酵周期延长；过大，菌体生长太快会造成培养基粘稠，影响培养基溶氧量。一般为1% 10%较为适宜。,BACK,对制备种子菌液的要求：,培养基,种龄,接种量,52,培养基：,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件； 培养目的不同，原料的选择和配比不同； 不同生长阶段，所要求的培养条件也有所差异。,一般都包括水、碳源、氮源、无机盐和生长因子五大组分。,53,1. 水,水是细胞的主要组成部分； 水是细胞内生化反应的介质； 作为营养物质和代谢产物的良好溶剂； 水的比热高，热传导性好，避免细胞内温度发生骤变。,54,2. 碳源,碳是微生物细胞需要量最大的元素 作用： 提供碳素； 碳源物质代谢产生ATP供能,种类来源： 有简单的无机含碳化合物(CO2、NaHCO3)；复杂的有机物(糖、烃类、醇等)；生物大分子(蛋白质、氨基酸和核酸)；复杂的天然含碳物（牛肉膏、蛋白胨、花生饼粉）等,55,根据不同的微生物特性选择特定的C源营养物。异养型微生物，糖类是最好的C源，Glu最为通用。 根据酶调节理论（合成诱导作用、分解物代谢阻遏作用），对所产酶的特性做出了解并调整碳源成分。,生产应用：,56,3. 氮源,氮是微生物细胞需求量仅次于碳的元素。 作用： 提供氮素，蛋白质和核酸的主要元素,种类来源： 有机氮源主要是各种蛋白质及其水解产物，如蛋白胨，酵母膏，牛肉膏，豆饼粉，花生饼粉等； 无机氮源是各种含氮的无机化合物，主要是铵盐（如硫酸铵，磷酸铵，硝酸铵等）和硝酸盐；,57,碳氮比一般是指培养基中碳元素与氮元素之比。,生产应用 (C/N)：,扩大培养中，N源含量要求较高 发酵生产中，一般把培养基的N源适当下调。,一般而言：N源含量较高（C/N低）有利于微生物的生长和繁殖；反之，N源含量较低（C/N高）微生物生长不会特别旺盛而利于代谢产物的积累。,58,4. 无机盐,微生物除了需要C源、N源外，还需要P、S、K、Ca、Mg、Cu等元素，它们大多都是以无机盐的形式提供的。 作用： P和S分别是核酸和含硫氨基酸的组成成分； Fe、Mg、Cu、Zn等作为许多酶的激活剂； Na和K具有调节细胞渗透压的作用，磷酸盐组成缓冲剂可保持微生物在生长过程中的pH稳定。,59,种类来源： 无机元素是通过在培养基中添加无机盐来提供的，采用添加水溶性的硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐或硝酸盐等； 一般微量元素在配制培养基所使用的水中已经足量，无需特意添加。,60,5. 生长因子,生长因子是指微生物生长需求量很少，但却自身不能合成的或者合成量不够的有机化合物。分为维生素、氨基酸和嘌呤嘧啶三大类。 作用： 氨基酸是蛋白质的组分； 嘌呤、嘧啶是核酸和某些辅酶或辅基的组分； 维生素主要起辅酶作用（B1硫胺素为脱羧酶的辅基、烟酸为NAD和NADP的前体，脱H酶的辅酶等）。,61,种类来源： 酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子。 多数真菌、放线菌和细菌是可以自身合成生长因子的，所以在培养基的配制中是不需要另外加入生长因子的； 但一些生长因子合成能力较差的细菌（如乳酸菌），需要额外加入一些维生素、氨基酸等作为补充。,62,请指出培养基中的营养成分,牛肉膏蛋白胨培养基：（细菌） 牛肉膏、蛋白胨、NaCl 察氏培养基：（霉菌） 蔗糖 、硝酸钠 、磷酸氢二钾 、硫酸镁 、氯化钾 、硫酸亚铁 高氏培养基：（放线菌） 淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁,生长因子？,63,发酵生产考虑：工业生产中考虑更多的是如何低成本获取高价值，所以在培养基选材方面主要以低成本的原料为主。 产酶角度考虑：培养基是否有利于酶的产生。,BACK,产酶培养基的一般原则：,培养基配方： 查找文献 优化和改进。,64,发酵条件的控制,pH值 温度 溶氧量 泡沫 基质浓度,65,1. pH值,pH对发酵的影响： 不同微生物的生长最适pH值不同（细菌、放线菌、霉菌）。,改变细胞内酶的活性； 影响细胞膜的透性； 影响培养基营养成分解离状态。,产酶pH通常与这个酶的最适反应pH一致，可以通过控制pH来控制不同酶的产量；此外，也受到菌体自身生长的影响。,66,影响pH变化的因素： 发酵过程中pH的变化主要是由细胞产酸产碱代谢反应的综合结果： pH下降： 碳源氧化不完全，使有机酸大量积累； 生理酸性盐（如硫酸氨）中的氨被菌体利用后，残留的硫酸根离子会导致发酵液。 pH上升： 培养基中蛋白质和含氮有机物被水解后放出氨。,67,控制pH值： 调整培养基的组分，尤其是产酸产碱组分的配比，使pH变化处于一个适当的范围。调节能力比较有限。 加入pH缓冲液，或发酵过程补加酸或碱的方法直接调节pH。 补料有调节pH和添加营养物双重作用，是较为常用的方法。（如补充生理酸性物质硫酸氨(NH4)2SO4和碱性物质氨水来调节pH）,68,2. 温度,温度对发酵的影响： 不同微生物的生长最适温度不同（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、霉菌）,改变细胞内酶的活性； 影响发酵液的物理性质（如粘稠度），影响溶氧量。,最适产酶温度一般都低于最适生长温度；在较低温度下，酶的mRNA稳定性提高，延长细胞产酶时间。,69,酶的发酵中，可以在不同生长阶段控制不同的温度以提升酶的产量。,用枯草芽胞杆菌AS1.3398生产中性蛋白酶 温度控制 发酵时间 发酵单位 变温 0-4h 30-30 4-8h 32-40(2/h) 8-12h 40-32(2/h) 12h后 30-32 26.5h 7100u/ml 恒温 30-32 27h 4275u/ml,70,温度的控制： 热水升温、冷水降温,影响温度变化的因素： 发酵设备器搅拌过程中产生的热量 微生物代谢过程产生的热量,71,3. 溶氧量,溶氧量对发酵的影响： 培养过程中细胞一般只能利用溶解在发酵液中的氧气。,各种微生物对发酵液中的溶氧浓度有个最低要求，这个溶氧浓度称为“临界氧浓度” 。 低于这个浓度，影响微生物生长和产酶； 溶氧量过高，一方面造成浪费，另一方面会抑制某些酶的生物合成。,发酵过程中溶氧无需达到饱和，只要求超过 “临界氧浓度” 。,72,4. 泡沫,泡沫的产生： 酶的发酵过程中会产生较多的泡沫，主要是由培养基中天然蛋白质原料含量较高，而且强烈的通气搅拌所导致。,泡沫的影响： 阻碍CO2的排除，影响氧的溶解； 溢罐，导致浪费原料，引起染菌； 装液量减少，降低发酵罐的利用率。,泡沫的控制： 减少或补料添加容易起泡的原料，采用一些消泡剂。,73,5. 基质浓度,基质浓度的影响： 培养基营养成分过低，影响微生物生长和产酶； 培养基过于丰富，微生物生长过旺，导致发酵液粘稠改变溶氧量。菌体花费大量能量维持生存环境，而对产酶的能量支出大大降低。 高浓度基质引起碳分解代谢物阻遏现象。 例：葡萄糖氧化酶发酵中，低浓度葡萄糖诱导该酶产生，而高浓度又有分解代谢物阻遏作用。降低葡萄糖用量，从8%降低至6%，补加2%氨基乙酸，部分解除阻遏作用，提高酶活26%,74,基质浓度的控制 补料 在发酵培养的过程中，间歇或连续的补加新鲜培养基的方法。 一方面，可以避免某种营养成分由于初始浓度过高而出现底物阻遏现象。 另一方面，可以避免发酵中一次投料过多造成细胞大量生长所引起的溶解氧不足、发酵液粘稠等影响。,75,提高酶产量的措施,添加诱导物,对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。 例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶等。,76,控制阻遏物浓度 阻遏物控制分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种 控制葡萄糖效应的方法：利用其他难利用的C源，如淀粉；分次流加C源；添加环腺苷酸。 控制产物阻遏的方法：从培养基中去除终产物；或加入某个抑制因子，阻断代谢途径限制末端产物积累，如组氨酸合成酶生产中加入-噻唑丙氨酸。,77,3. 添加表面活性剂 添加诱导物或降低阻遏物浓度存在成本问题（某些诱导物价格较昂贵）和操作问题（流加易引起染菌），所以有时会采用添加表面活性剂的方法促进酶的分泌。 细胞内酶含量达到一定程度后会被胞内蛋白酶降解，加入表面活性剂可以增加细胞膜透性，从而使酶未被分解即分泌到胞外，增加酶的产量。 常用表面活性剂有吐温和特里顿等,78,4. 添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。 例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶的产量提高120倍； 产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定促进剂的种类和浓度。,79,本章内容,一、酶生物合成基本理论,三、酶的发酵工艺条件及控制,四、酶生产过程的动力学,二、产酶微生物,80,1、酶生物合成的模式,细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历迟缓期、对数生长期、平稳期和衰亡期。,由细胞生长和酶产生的关系, 将酶生物合成的模式分为4种类型。同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。,81,同步合成型,酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式， 又称为生长偶联型。 特点：酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏；这类酶所对应的mRNA很不稳定。 种类：大部分组成酶和部分诱导酶,82,延续合成型,酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。 特点：酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏；这类酶所对应的mRNA相当稳定。 种类：大部分组成酶和部分诱导酶,83,中期合成型,酶合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入稳定期后，酶的合成也随着停止。 酶的生物合成受到反馈阻遏；而且其所对应的mRNA不稳定。 种类：大部分组成酶和部分诱导酶,84,滞后合成型,酶合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入稳定期后，酶可继续合成一段时间。 酶的生物合成受到反馈阻遏，而其所对应的mRNA稳定性高。 种类：诱导酶,85,1. 何时开始产酶 2. 稳定期后是否继续产酶,86,mRNA的稳定性、培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模型的主要因素。 产酶的mRNA稳定，在细胞停止生长之后细胞内的mRNA可继续表达蛋白；产酶的mRNA不稳定，细胞停止生长，没有新mRNA被转录，原mRNA被降解，故蛋白合成终止； 对于诱导酶来说，细胞生长前期培养基中存在相应阻遏物抑制酶的表达，当细胞培养基中阻遏物被消耗完开始诱导合成相应的酶类；如果培养基中无阻遏物，那么诱导酶随细胞生长而正常表达。,总结,组成型酶不存在阻遏作用，属于同步合成或延续合成型 诱导型酶则视培养基中有无阻遏物而属于不同类型,87,中期合成型,同步合成型,延续合成型,滞后合成型,88,理论应用,目的：提高产酶率和缩短发酵周期 最理想的合成模式：延续合成型 策略措施： 提高mRNA的稳定性：菌株选育；降低产酶温度 解除阻遏：培养基中解除阻遏物；变诱导型为组成型,89,对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性；可适当降低发酵温度 对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度 ，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用；补料添加等 对于中期合成型的酶，则对mRNA的稳定性和解阻遏两方面进行改进。,90,2、发酵动力学,发酵动力学主要研究发酵过程中细胞的生长速率，产物的形成速率以及环境因素对这些速率的影响。 细胞的生长速率与环境因素对其的影响称为细胞生长动力学； 产酶速率及环境因素对其的影响称为产酶动力学。,91,2.1 细胞生长动力学,什么是细胞生长动力学,细胞在一定的培养基中生长，其生长速率受到细胞内外各种因素的影响，而且变化复杂。利用数学模型来描述并分析细胞生长规律的方法称为细胞生长动力学。,有何意义,利用所建立的数学模型，通过改变试验条件达到控制细胞生长的目的。,92,在细胞生长过程中，通常利用比生长速率()来描述细胞的生长速度；比生长速率定义为单位时间内单位菌体增加的物质的量或菌体数量。,X： 细胞浓度 ：比生长速率,93,微生物分批培养中的比生长速率变化,时间,菌体浓度,延迟期,对数生长期,减速期,静止期,衰亡期,延迟期：,对数生长期:,减速期:,静止期： ;,衰亡期:,对数生长期的为常数，且在生长过程中比生长速率最大；它决定了最终细胞产量的多少，即 对数期 越大，则细胞产量越大。,94,细胞生长动力学研究对象中的比生长速率特指为对数生长期的比生长速率；通过研究试验条件对对数期 的的影响来控制细胞产量。,95,Monod方程,1950年，法国的莫诺德(Monod)首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程，用以反映限制性基质浓度与细胞生长速率的关系：,m：为最大比生长速率 S： 限制性基质的浓度 KS ：莫诺德常数,KS,96,当限制性基质的浓度SKs时，增加基质浓度就不能提高细胞比生长速率。,此方程式与米式方程非常相似,KS,97,Monod方程的参数求解(双倒数法)：,将Monod方程取倒数可得：,或：,98,通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速率，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数Ks和m 。,S/,S,( y = ax + b ),当x=0时，y=Ks/m 当Y=0时， x=-b/a=-Ks,Ks/m,Ks,99,实例分析计算,1. 设定不同浓度的限制性基质浓度，培养细菌，得到相关细胞数量的试验数据,100,2. 选定对数生长期的几组数据，得到不同基质浓度与比生长速率的线性回归方程，求出对应的比生长速率。,细胞比生长速率:,对上式积分得：InX = t + A0 (A0为积分常数，等于接种量的自然对数),根据几组试验数据中的培养时间和细胞数量得到一线性回归方程，求出比生长速率,101,浓度1时的数据,浓度2时的数据, ,根据各组试验数据中的培养时间和细胞数量得到一系列线性