重组人表皮生长因子复方抗菌凝胶生物活性检测方法的建立.doc

重组人表皮生长因子复方抗菌凝胶生物活性检测方法的建立首席医学网 2006年05月25日【关键词】磺胺嘧啶银摘要:目的与方法 通过探讨用MTT法检测重组人表皮生长因子（rhEGF）复方抗菌凝胶生物活性的试验参数，包括凝胶剂中卡波姆含量对测定的屏蔽作用、不同试剂对卡波姆组分屏蔽作用的解除、抗菌成分磺胺嘧啶银浓度以及EGF含量对复方凝胶检测方法的影响作用等，建立一套适合用于EGF复方抗菌凝胶剂生物活性的检测方法。结果 优选出的最佳条件：EGF质量分数为20 g/g，卡波姆质量分数为1.0%，用尿素+PBS+甘氨酸作屏蔽剂，磺胺嘧啶分数浓度为0.5%2.0%。结论 本文方法可快速准确地对EGF复方凝胶活性进行检测,从而为复方凝胶剂的开发提供条件。关键词:重组人表皮生长因子;磺胺嘧啶银; 复方 ;凝胶剂 MTT法表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)可明显促进创面愈合 ，尤其对一些难愈合创面作用更佳，具有很高的临床价值1-6。目前临床上主要使用基因工程生产的重组人表皮生长因子（recombinant human EGF, rhEGF）凝胶剂7。古巴的rhEGF凝胶与磺胺嘧啶银的复方制剂已经上市，国内也有数家单位正处于研发阶段8,9。在开发rhEGF复方抗菌凝胶的过程中，最大的困难在于rhEGF复方抗菌凝胶的生物活性检测问题。本文通过改良MTT10结合酶联仪的检测方法，对rhEGF复方抗菌凝胶几个组分浓度进行分析，拟建立了一套简便有效的检测方法。1 材料和方法11 细胞株Balb/c3T3，由中国药品生物制品检定所提供。12 培养基RMIP 1640，购自GIBCO公司；13 试剂四甲基偶氮唑盐(MTT), 购自JANSSEN HIMICA公司；小牛血清(calf serum ，CS)，购自Hyclone公司；EDTA、NaCl、磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)、尿素、甘氨酸（上海生工公司），分析纯。14 仪器振荡器，购自德国IKA公司；酶标仪， BIOTEK公司。15 样品EGF国家标准品：由中国药品生物制品检定所提供，20 保存。rhEGF复方凝胶样品9：自制，主要成分为rhEGF、磺胺嘧啶银、卡波姆，通过设定不同质量分数的卡波姆组分，测定其活性最佳的配方。对照品：rhEGF水溶液，由桂林华诺威公司提供，用超纯水稀释成=1 mg/mL的EGF溶液，待用。16 细胞培养将保存在液氮的Balb/c3T3细胞用含=20CS的RMIP 1640复苏培养再活化，然后用含=10CS的RMIP 1640培养基培养，传代1次，待铺展率达到7080后用于检测。17 rhEGF复方抗菌凝胶优化Balb/c3T3细胞增殖MTT检测法 准确称取rhEGF复方抗菌凝胶 1.0 g，加入200 mL含=0.4% CS的RMIP 1640培养基中，在混合器上振荡1 min，然后用0.22 m的滤膜过滤，得到澄清滤液。以此滤液作为第一个稀释度（40），然后继续进行4倍稀释，至4-5，将各个稀释度样品加在已接种Balb3T3细胞的96孔板中，培养72 h，用MTT法于490 nm波长处检测活性。标准品的第一个稀释度（40）为50 IU/mL，同样4倍稀释至4-5。用同等浓度的水剂做对照；含=10% CS 的RMIP1640培养基做阳性对照；含=0.4% CS的 RMIP 1640培养基做阴性对照。18 卡波姆干扰作用屏蔽剂的加入将不同试剂分别与样品作用，旋涡10 min震荡分散，再加入甘氨酸，混匀，过滤，取滤液。19 评估公式样品效价（IU/mg）= 50IU200标准品半效价量稀释度 样品相当于标准品半效价量稀释度50IU为标准品的第一个稀释度活性；200为样品预稀释度2 结果与讨论2.1 rhEGF凝胶中卡波姆组分对表皮生长因子生物活性测定的影响以卡波姆为变量，分别配制几种不同质量分数卡波姆的EGF（20 g/g）凝胶。凝胶外观为水溶性无色透明、质地均匀的凝胶制剂。随着卡波姆浓度的提高，凝胶剂的黏度相应提高。样品处理参照“1.7”。根据对不同浓度卡波姆凝胶剂的生物活性测定，发现卡波姆成分在测定中，对细胞生长具有一定的抑制作用。随着卡波姆浓度的提高，其测出的生物活性与同浓度水剂对照品具有较大的差异，见图1。结果表明，=0.5%、1.0%的卡波姆对EGF生物活性无显著影响，=2%、3%的卡波姆对EGF生物活性影响较大，综合考虑凝胶剂的铺展性和黏度，优选了卡波姆终质量分数为1.0%的凝胶作为备选浓度。22 不同试剂对EGF复方抗菌凝胶屏蔽作用的解除配制磺胺嘧啶银质量分数1.0%、EGF 20 g/g的凝胶，用纯水+甘氨酸、EDTA+甘氨酸、PBS+甘氨酸、尿素+PBS+甘氨酸处理样品，取滤液检测生物活性。实验结果显示，复方抗菌凝胶对普通MTT法测活干扰较大，见图2。通过使用不同试剂对复方凝胶组分的干扰作用进行屏蔽实验，以纯水作为阴性对照，甘氨酸作为保护剂。从图2可看出，使用尿素+PBS屏蔽剂的效果较理想，其生物活性与同浓度水剂对照品生物活性基本一致。因此优选尿素+PBS+甘氨酸为EGF复方抗菌凝胶生物活性检测的屏蔽剂。2.3 抗菌成分磺胺嘧啶银浓度对EGF生物活性检测的影响以磺胺嘧啶银为变量，分别配制几种不同浓度磺胺嘧啶银的复方抗菌凝胶。用尿素+PBS+甘氨酸处理样品，取滤液检测活性。磺胺嘧啶银成分对EGF凝胶剂生物活性测定具有干扰作用，不同浓度的磺胺嘧啶银具有不同的干扰效应，见图3。根据对不同浓度磺胺嘧啶银凝胶剂的生物活性测定，发现高质量分数的磺胺嘧啶银成分在测定中，对Balb/c3T3细胞生长具有较强的抑制作用，添加屏蔽剂的改良MTT法适用于=0.5%2%的磺胺嘧啶银复方抗菌凝胶。24 EGF浓度EGF凝胶生物活性检测的影响准确量取自制EGF标准液，配制成不同浓度的凝胶剂。用尿素+PBS+甘氨酸处理样品，取滤液检测活性。结果见图4。从图4可看出，随着EGF含量的提高，测定的误差并无相应提高。说明EGF含量的提高，对生物活性检测并无太大干扰作用。考虑到治疗效果和经济效益问题，优选了终质量分数为20 g/g的凝胶作为备选。3 结 论通过考察rhEGF复方抗菌凝胶内不同质量分数卡波姆、磺胺嘧啶银含量的对生物活性测定干扰程度，并选用不同试剂进行屏蔽，优选出一套快速精确的凝胶生物活性测试方法：EGF为=20 g/g，卡波姆为10%，用尿素+PBS+甘氨酸作屏蔽剂，磺胺嘧啶为=0.5%2.0%。使用该测试方法对凝胶剂内EGF不同含量进行生物活性测定，对照标准方法，确认该方法适合于EGF凝胶剂生物活性的快速测定。参考文献：1Brown GL, Nanney LB, Griffen J, et al. Enhancement of wound healing by topical treatment with epidermal growth factor J. New Eng J Med,1989,321(1):76.2Knighton DR, Ciresi KF, Fiegel VD,et al. Classification and treatment of chronic nonhealing wounds. Successful treatment with autologous plateletderived wound healing factors(PDWHF)J. Ann Surg,1986,204(3):3223周学武，胡德耀，吴炎,等. EGF、磺胺嘧啶锌单用及伍用促进犬后肢枪伤部组织增生的作用J.中华创伤杂志，1995，11(3):3224王世岭，郭振荣，周一平,等.重组人表皮细胞生长因子促进慢性创面的愈合J.中华创伤杂志，1998，14(6):3485谷庆阳，崔彩彬，高亚兵,等.外源性rhEGF对放射复合创伤伤口愈合的促进作用J.解放军医学杂志，2000,25(2):1036张详明，周和平.细胞活素（rhEGF）期临床研究总结报告J.数理医药学杂志，1999,12(1):227Sumi SI,John DH. Overproduction of human epidermal growth factor/urogastric in E.coli and demonstration of its full biological activityJ. K Biotechinol,1985,2:598王世岭，郭振荣，周亮，等.重组人表皮生长因子对促进烧伤创面的愈合作用J.中国临床药理学杂志，1998，14(3):1509陆兵，谢英华，程度胜，等.重组人表皮生长因子凝胶剂的研制J.药学实践杂志，2001,19(3):14310Tim Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to