运动和黄芪丹参对大鼠骨骼肌线粒体生物发生的作用.docVIP

运动和黄芪丹参对大鼠骨骼肌线粒体生物发生的作用【摘要】：线粒体是真核细胞内的能量转换器，不仅通过氧化磷酸化生成ATP、在细胞能量供给中起决定性作用，还在生长发育、凋亡、衰老过程中起重要作用。线粒体的生物发生主要指在一个细胞的生命周期中线粒体的增殖、系统发生和个体发生过程。线粒体DNA(mtDNA)位于线粒体基质，是由16569bp组成的双链、闭环结构，含37个基因，编码13条多肽链，22种tRNA和2种rRNA，但这些只能编码线粒体产生与合成所需蛋白总量的一小部分，其余蛋白仍需核基因组编码。因此，线粒体生物发生需要核与线粒体基因组的共同表达。目前有大量研究表明运动可促进线粒体生物发生，但其分子机制仍不完全清楚。以H_2O_2为主的ROS作为第二信使可以调节多种信号转导通路和多种因子的作用，因此研究运动过程中产生的适量ROS是否作为第二信使诱导线粒体生物发生，是否是骨骼肌耐力运动适应、运动能力提高、骨骼肌线粒体增殖的生化基础；以及这一基础是否是临床应用黄芪丹参治疗骨骼肌损伤和促疲劳恢复的治疗机制都有重要的现实意义。本研究的目的在于：(1)探讨一次急性运动及耐力运动后线粒体生物发生相关因子的时相性变化，线粒体形态及酶学变化，以及在运动诱发线粒体生物发生过程中对PKBAkt信号转导通路的影响情况。(2)探讨过氧化氢对原代培养骨骼肌细胞存活状态的影响，探索过氧化氢在不同剂量及作用时间对线粒体生物发生相关因子的影响，确定其体外最适作用剂量和体外最适作用时间(可激发线粒体生物发生，又不至引发细胞死亡)，从而了解以过氧化氢为主的ROS对线粒体生物发生相关因子的作用机制。(3)探讨黄芪丹参和或游泳耐力训练在诱导线粒体生物发生过程中的作用，研究黄芪丹参促进骨骼肌损伤修复、抗疲劳的分子生物学机制。本研究共分三个部分，研究方法及结论如下。一、运动对大鼠骨骼肌线粒体生物发生机制的影响方法：1、一次急性运动组选用雄性SD大鼠42只，随机分为7组：对照组(C1组)6只；运动即刻组(0h组)6只；一次运动后3小时组(3h组)6只；一次运动后6小时组(6h组)6只；一次运动后12小时组(12h组)6只；一次运动后18小时组(18h组)6只；一次运动后24小时组(24h组)6只。所有训练组进行2天适应性游泳，每天一次，每次10min；以后每次游3小时，每天2次(共计6小时为一次长时游泳运动)，中间间隔45分钟。2、耐力训练组选用雄性SD大鼠42只，随机分为7组：对照组(C2组)6只；6周最后一次运动后即刻组(OH组)6只；6周最后一次运动后3小时组(3H组)6只；6周最后一次运动后6小时组(6H组)6只；6周最后一次运动后12小时组(12H组)6只；6周最后一次运动后18小时组(18H组)6只；6周最后一次运动后24小时组(24H组)6只。所有训练组2天适应性游泳，每天一次，每次10min；以后前4周每次游40min，每天1次；后2周每次游60min，每天1次，共游泳6周。急性及耐力运动结束后，分别取各大鼠腓肠肌，检测线粒体酶复合体(complex，COX)、一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)活性；电镜检测骨骼肌线粒体；采用SYBRGreen逆转录实时荧光定量PCR方法测定各组大鼠骨骼肌过氧化体增殖活化受体辅助活化因子1(Peroxisomeproliferator-activatedreceptor-gammacoactivator-1，PGC-1)、线粒体转录因子A(mitochondrialtranscriptionalfactor-A，mtTFA)、线粒体转录因子B2(mitochondrialtranscriptionalfactor-B2，mtTFB2)、核呼吸因子-1(nuclearrespiratoryfactohNRF-1)mRNA表达水平；Western-blotting方法检测Phospho-Akt(Ser473)水平。结果：1、一次急性运动后同安静组比较：骨骼肌线粒体COX活性在运动后即刻、运动后3h、6h组明显升高；NOS活性在运动后6h、12h、18h、24h组明显升高；SOD活性在运动后即刻、3h、6h、12h组明显升高。电镜结果表明，对照组肌原纤维间有大量骨骼肌线粒体，形态完整，嵴紧密且整齐。一次急性运动后组线粒体多大量堆积于细胞核周围和肌纤维间，形态多样，多数线粒体肿胀成球形，体积增加(以一次急性运动后0h和24h组为例)，嵴融合，线粒体中间形成很多大的空隙，类似鬼影状。一次急性运动后骨骼肌PGC-1mRNA在6h、12h组明显增加；mtTFAmRNA水平在12h、18h、24h组明显升高；mtTFB2mRNA水平在18h组升高，而在3h、6h、12h、24h组明显降低；NRF-1mRNA水平在3h、6h组明显增加，在12h、18h、24h组有明显降低。磷酸化AKtWestern-blotting结果表明空白对照组未见AKt的表达，而0h、3h、6h、12h组均有表达，且以3h、6h两组水平较高。18h和24h组未检测到。2、耐力运动后同安静组比较：线粒体COX活性在运动后各组均升高；NOS活性在运动后6h、12h、18h、24h组有明显升高；SOD活性在运动后18h、24h组明显升高。电镜结果表明，耐力运动后，线粒体在肌纤维间明显浓集，大小不一，个别线粒体边缘模糊，但未见空泡。耐力运动后骨骼肌PGC-1mRNA在6h、12h组明显增加，运动后即刻组却明显下降；mtTFAmRNA水平在6h、12h组明显增加，运动后3h组明显下降；mtTFB2mRNA水平在12h组有明显增加，而在即刻组、3h、18h、24h组明显降低；NRF-1mRNA水平在6h、12h组有明显增加。磷酸化AKtWestern-blotting结果表明空白对照组未见磷酸化AKt的表达，而0h、3h、6h、12h、18h和24h组均有表达，且以6h、18h两组水平较高。结论：1、一次急性运动及耐力训练可提高运动恢复期大鼠骨骼肌的PGC-1、mtTFA、mtTFB2、NRF-1mRNA水平，这可能是运动通过增强AKt磷酸化水平，刺激PKBAKt通路级联放大反应，提高骨骼肌抗缺氧水平，从而促进线粒体生物发生。2、PKBAKt途径也可以通过提高NOS活性，增加NO生成量，并使其在生理水平范围内达到较高水平，促进线粒体呼吸功能。3、运动后骨骼肌PGC-1与mtTFAmgNAA达的时相性变化是由多因素制约的，这有待进一步的研究揭示。4、运动诱发线粒体生物发生的PGC-1mtTFA旁路是否还伴随Akt旁路以外其他旁路的调节作用还有待进一步研究。5、耐力运动实验证实PGC-1可能同线粒体生物发生的早期事件无关。二、过氧化氢对骨骼肌原代培养细胞线粒体生物发生的影响机制方法：本研究中提取新生24h内乳鼠骨骼肌细胞进行原代培养，并用过氧化氢作为外源性ROS诱因刺激细胞，尝试激发线粒体生物发生。原代培养的骨骼肌细胞分四部分处理：一部分种植于96孔板的细胞，分别用不同浓度的H_2O_2进行作用，浓度分别为：0M，25M，50M，100M，200M，400M，在作用后的1h、3h、6h、18h进行MTT检测；加入100MH_2O_2，分别在1h、3h、6h、18h收集细胞，并设空白对照组，进行RNA提取和检测；100MH_2O_2处理的细胞离心洗涤收集后，加入戊二醛进行电镜检测；提取线粒体，进行酶活性检测。结果：0400MH_2O_2作用骨骼肌细胞1h后MTT值显示，100M和200M剂量H_2O_2作用后的细胞MTT值较空白对照组明显增加，选择100M作为最佳浓度剂量，分别在刺激1h、3h、6h、18h进行MTT值测定：MTT值只在1h后明显增加，而其它时间点则明显低于空白对照组；COX在1h和3h后活性提高；NOS活性的变化同COX活性的变化趋势。电镜下可见空白对照组有大量的线粒体，线粒体嵴紧密且整齐，线粒体边缘整齐；100MH_2O_2作用1h组线粒体在胞核周围大量堆积，排列紊乱，多数线粒体肿胀呈球形；3h和6h组线粒体嵴发生不同程度的断裂或消失，甚至外膜破裂；18h组大部分线粒体基质如絮状，基质变淡，基质颗粒基本消失，空泡明显增多，有的线粒体数个空泡彼此融合，形成一个大空泡，线粒体数目减少。荧光定量PCR检测结果表明PGC-1mRNA水平只在100MH_2O_2作用3h后较空白对照组明显增加；mtTFAmRNA水平在作用1h、3h、6h后均较空白对照组有明显增加，在18h后又下降；mtTFB2mRNA水平则在3h，6h，18h后均较空白对照组有明显增加；NRF-1mRNA水平只在作用1h后较空白对照组有明显增加，其它各时间点都没有改变。结论：1、H_2O_2的浓度对细胞的存活状态的影响极为重要。100MH_2O_2可能是体外刺激原代骨骼肌细胞生物发生的最适剂量，且其可模拟运动中产生的ROS刺激线粒体生物发生相关因子水平的改变；H_2O_2作用时间对线粒体功能的改变亦很重要，且在一定范围内作用时间越长对线粒体生物发生的激发作用越明显，但超过一定时长又会引发线粒体功能下降，故ROS的适量和适时都决定着其是以线粒体生物发生信号分子为主导还是以凋亡信号分子为主导作用，而控制着细胞的生长增殖与抑制、凋亡。2、外源性H_2O_2作用实验证实PGC-1可能同线粒体生物发生的早期事件无关。3、适量H_2O_2使AKt磷酸化，介导了线粒体生物发生作用，保护线粒体呼吸功能的正常进行。三、黄芪丹参对运动大鼠线粒体生物发生的影响及其机制的研究方法：取SD雄性大鼠36只随机分为6组：对照组(C2组)6只；每3天注射一次对照组(C3组)6只；每5天注射一次对照组(C5组)；6周最后一次运动后0小时组(OH组)6只；每3天注射一次并6周运动组(SI3组)6只；每5天注射一次并6周运动组(SI5组)6只。检测线粒体酶COX、NOS、SOD活性；电镜检测骨骼肌线粒体；采用SYBRGreen逆转录实时荧光定量PCR方法测定各组大鼠骨骼肌PGC-1、mtTFA、mtTFB2、NRF-1mRNA表达水平；Western-blotting方法检测Phospho-Akt(Ser473)水平。结果：同C2组比较，COX活性在各组都明显增加，同OH组比较，SI3组和SI5组有显著增加。NOS的活性变化除了OH组较C2组有明显减少外，其余同前。SOD活性同C2组和OH组比较，都只有SI3组有明显增加。耐力训练组的线粒体体积增加，嵴结构清晰，外膜完整。3天和5天注射安静组的骨骼肌细胞线粒体在胞核周围和肌纤维间数量增加，线粒体体积增大，嵴结构明显、且嵴间隙增宽，线粒体外膜完整。游泳联和黄芪丹参注射组与对照组相比无明显差异，线粒体数目增多，基质轻度扩张。PGC1-mRNA水平在OH组较C2组有明显降低，SI3组和SI5组有显著增加；同OH组比较，SI3组和SI5组有显著增加。mtTFAmRNA水平C5组较C2组明显降低，SI3则明显增加；同OH组比较，SI3组有显著增加。mtTFB2mRNA水平同C2组比较，OH组明显下降，而SI3组呈明显增加：同OH组比较，SI3组和SI5组有显著增加。NRF-1mRNA水平同C2组比较，SI3组呈明显增加；同OH组比较，SI3组和SI5组有显著增加。Phospho-Akt结果中同C2组比较，各组均增加：较OH组比较，SI3、SI5组明显降低，C3、C5组则明显增加。结论：1、耐力游泳训练和黄芪丹参复合物都能诱导线粒体的生物发生、维持线粒体的功能。主要通过AktNRF-1mtTFA途径：AktNOS途径；p38MAPKPGC1-NRF-1mtTFA途径。2、运动和黄芪丹参共同作用下Akt磷酸化水平较单独运动或黄芪丹参作用有明显下降说明可能存在独立于Akt以外激活线粒体生物发生的信号转导通路，且不受Akt磷酸化水平的影响。3、黄芪丹参对Akt磷酸化水平的上调作用使得其有可能成为Akt的激活剂，从而可望成为对Akt磷酸化受到抑制引发的线粒体疾病的治疗药物。全文总结：1、一次长时和耐力游泳运动都可以影响线粒体生物发生，线粒体生物发生的相关因子和酶活性呈现时相性变化。2、过氧化氢作为第二信使介导了线粒体的生物发生，且其作用浓度和作用时间是影响线粒体功能的主要因素。3、黄芪丹参也可以影响线粒体生物发生，这一作用可以通过对AKt的磷酸化激活该信号转导通路实现。【关键词】：游泳黄芪丹参骨骼肌线粒体线粒体生物发生COXNOSSOD过氧化物酶体增殖受体-1线粒体转录因子A线粒体转录因子B2核呼吸因子1磷酸化Akt【学位授予单位】：华东师范大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2007【分类号】：G804.2【目录】：中文摘要6-12Abstract12-20前言20-23第一章线粒体生物发生与运动(文献综述)23-541.线粒体的结构与功能23-411.1线粒体的结构23-241.2线粒体与细胞凋亡24-261.3线粒体与ROS26-271.4线粒体与钙稳态27-291.5线粒体与NO29-321.6线粒体与疾病32-341.7线粒体的生物发生线粒体DNA与核DNA34-371.8线粒体与AKT37-412.运动诱导线粒体的生物发生41-452.1耐力运动增加肌肉线粒体GLUT4表达及葡萄糖转运41-432.2运动对机体自由基代谢的影响43-442.3ROS是线粒体生物发生的分子信使44-453.线粒体疾病与治疗进展45-47参考文献47-54第二章运动对大鼠骨骼肌线粒体生物发生机制的影响54-1011.材料和方法54-711.1实验动物54-551.2动物分组及运动方案55-571.3取材571.4试剂及试剂盒57-581.5主要溶液58-611.6仪器61-621.7方法62-712.结果71-932.1一次急性运动后结果71-832.2耐力运动结果83-933.讨论93-974.小结97-98参考文献98-101第三章过氧化氢对大鼠骨骼肌细胞线粒体生物发生