MSI检测技术ppt课件

1,MSI 检测技术,2,微卫星简要介绍 现用微卫星检测技术流程 多重荧光PCR技术概略介绍 毛细管电泳概略介绍 微卫星检测的临床检测可行性,MSI 检测技术摘要,3,MS,Simple repeat sequences of 1 to 6 base pairs 单核苷酸型:AAAAAAAA 双核苷酸型:ATATATAT 三核苷酸型:ATCATCATC .,4,MS,Prone to replication errors,Defection of MMR,MS instability,LS,Sporadic MSI,LS,5,MS,错误产生机制,Stutter 又被称为影子带，或者DNA聚合酶滑脱产物。表现为PCR产物比主要扩增产物增加或减少一个或几个重复单位。,6,MSI MAKERS IN LS,National Cancer Institutesponsored workshop in 1997 2 mononucleotide repeats(BAT25 and BAT26) 3 dinucleotide repeats (D2S123,D5S346, and D17S250) Revised in 2002 5 mononucleotide repeats(BAT25, BAT26,NR-21, NR-22, and NR-24) Promega MSI Analysis System 5 mononucleotide repeats(BAT25, BAT26,MONO-27, NR-21 and NR-24） 2 pentanucleotide repeats(Penta-C and Penta-D),criteria,MSI-H Replication errors2 makers MSI-L 1 MSS 0,7,实验流程,1、基因DNA的提取 2、多重荧光PCR 3、毛细管电泳检测 4、分析数据,8,基因DNA的提取流程,Promega试剂盒法,分别挑选正常、肿瘤组织,显微切割,9,多重荧光PCR,Disease Markers 20 (2004) 237250 Jeffery W. Bacher, Laura A. Flanagan,上游引物的5端作荧光标记,JOEGreen FL Blue TMRBlack,10,多重荧光PCR,PCR反应体系（25l）： 2.5l GoldSTR 10X Buffer 0.1-1 M each primers 0.05 l AmpliTaq Gold DNA Polymerase(5Units/ l) 1-2ng DNA PCR条件：1 cycle 95C for 11minutes; 1 cycle 96C for 1 minute; 10 cycles 94C for 30 sec-onds, ramp 6 seconds to 56C, hold for 30 seconds,ramp 50 seconds to 70C, hold for 45 seconds; 20 cycles at 90C for 30 seconds, ramp 60 seconds to 56C,hold for 30 seconds, ramp 50 seconds to 70C, hold for45 seconds; 60C for 30 minutes final extension; 4C hold.,Disease Markers 20 (2004) 237250 Jeffery W. Bacher, Laura A. Flanagan,11,毛细管电泳检测、分析,微卫星位点经过荧光标记PCR扩增后，取适量PCR产物、分子内标(ILS 600)溶于缓冲液（甲酰胺）中经遗传分析仪毛细管电泳进行扫描，通过检测片段长度来判断微卫星不稳定性。 利用Genescan和Genetyper软件进行图像收集和分析，计算出微卫星等位变异扩增片段的大小。,Promega MSI Analysis System, Version 1.2,12,横坐标代表片段长度 纵坐标代表荧光强度,13,多重荧光PCR优点,多重PCR技术是指在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对，同时扩增多个序列，从而产生高度特异性的反应过程，该技术对DNA模板要求量小、高通量分析且省时、省力、省材。 应用不同荧光标记可以解决不同PCR扩增位点长度的重叠，极大的提高效率。,14,多重荧光PCR前提条件,所有引物对的退火温度必须接近； 在同一反应体系中，所有引物对之间不能有相互作用（形成引物寡聚体）； 同色引物扩增产物应长度有别，这样才可同时对多个位点进行片段分析。,15,毛细管电泳,清洗毛 细管,更换电泳 缓冲液,进样,电泳并同时 在线检测,操作步骤,16,毛细管电泳优点,荧光标记毛细管电泳(FCE) 快速、准确、敏感性强、可重复性好、结果易分析、高通量检测、客观性强 聚丙烯凝胶电泳加放射显影或银染 (传统方法）费时、步骤繁琐、判断结果主观性较强,17,MSI 直肠癌的临床检测可行性,99% con-cordance with IHC Nearly 100% accuracy Lower cost bacause of the use of a single multiplex fluorescent MSI assay Find out those misclassified only based on IHC (about 5% MSI-H tumors had normal levels of four MMR proteins ),Disease Markers 20 (2004) 237250 Jeffery W. Bacher, Laura A. Flanagan,18,19,关于突变的一些概念,Germline mutation ：由父母传给后代的突变，由于此种突变发生在精细胞和卵细胞中，故称为生殖系突变。 Consititutive mutation :突变发生在配子或合子过程中，并且这种突变在合