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Western blot 实验技术一、 原理Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶、荧光或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western Blot按实验步骤分主要包括两部分：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（主要目的为按分子量大小对蛋白质进行分离）； Western印迹（在韧性支持物上通过抗原抗体杂交后的显色强弱反应蛋白丰度）。1SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳： 该技术首先在1967年由Shapir0建立，1969年由weber和Osborn进一步完善。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N，N 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联向成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质 SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDSPAGE)。由于SDS PAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么 SDSPAGE后，就只出现一条蛋白质区带。SDSPAGE具有以下特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 实验模式图 结果图2Western印迹：经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分离后的蛋白质，在电场中转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜）。而后以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。转膜模式图 杂交模式图二、实验准备一抗体选购流程（1）首先确定研究的抗原分子的正式及别用名，明确针对的种属，明确除WB以外拟开展的实验种类（如：Flow Cyt, ICC/IF, IHC - Wmt, IHC-Fr, IHC-P, IP,）。（2）从常用信誉较好公司网站查询符合（1）中要求的抗体，国外公司包括：Abcam，ABGENT，cell signaling，Abnova，chemicon，novus，BD，epitomics。国内推荐：三鹰，中杉金桥，天德悦。仔细阅读抗体说明书，需要考虑因素包括：是否有文献已发表，抗体效价，到货周期，抗体价格，单抗多抗，包装规格，抗体克隆号，并依据一抗种属选择相应的二抗。（注意：一般国外抗体到货时间为3-5周，国内抗体3-5天）（3）订购成功后，定期与抗体代理公司联系，核实抗体状态并督促其及时到货。（4）收到抗体后，第一时间分装抗体避免反复冻融（置于冰上，推荐10 ul每支分装并保存于-20）。妥善保管说明书，建议打印一份放实验室，原版放办公室。（5）每批订购的抗体至少保存5 ul 存底，用于重要实验验证。二抗选购流程二抗主要选择国内抗体，本实验室选择天德悦公司产品，使用者主要需考虑种属问题。样本制备（1）样本制备前需明确实验目的，并根据下述实验方法选择合适的实验体系，如：待检测蛋白所处位置（细胞浆，细胞膜，分泌蛋白等）（2）尽量保持细胞培养的稳定性（即实验的可重复性），如:细胞的培养密度，更换培养液时间等。（3）如使用蛋白酶处理，可能会将目的蛋白降解，同时还引入了新的蛋白质从而干扰实验。因此建议处理贴壁细胞时，直接在培养瓶中加入裂解液，并用细胞刮进行收集。（4）蛋白质的稳定，自从细胞破裂后，很多蛋白质就变得不稳定，其中一些蛋白质在细胞内释放出来的蛋白酶的作用下被水解，还有一些在机械剪切力的作用下发生断裂。因此在蛋白质提取过程中需要轻柔、低温（全程都在冰浴中进行，有条件可使用液氮）、加蛋白本酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等。（5）冻存样本需明确其保存时间、详细提取信息及保存状态。注意蛋白样本应尽量避免反复冻融。（6）常用的蛋白酶抑制剂有以下几种：丝氨酸蛋白酶抑制剂： PMSF，AEBSF-HCl，Aprotinin，Chymostatin，亮肽素（Leupeptin）天冬氨酸蛋白酶：PMSF，碘乙酸、抑肽素(Pepstatin),云芝发酵物巯基蛋白酶抑制剂：PMSF，TLCK，TPCK，Antipain-HCl,N-乙基顺丁烯二酰亚胺金属蛋白酶抑制剂（金属离子螯合剂）：EDTA，EGTA，塔罗肽苏氨酸蛋白酶：目前缺乏资料酸酶抑制剂：NaF，激活的原矾酸钠、焦磷酸钠、-甘油磷酸钠。（7）提取蛋白浓度信息：试剂订购本实验室WB常规试剂由黄启超和张璟组统一订购，订购信息如下：试剂耗材名称货号规格试剂耗材厂商试剂保存条件订购负责人代理公司联系人电话PMSF(100mM)ST50610ML碧云天-20黄启超老师雅怡李元酸酶抑制剂S18732g碧云天-20黄启超老师雅怡李元eta-actin内参抗体BS-0061R100ul博奥森-20黄启超 老师雅怡李元eta-actin mouse mAb(5B7)TDY041100ul天德悦（北京）-20黄启超 老师雅怡李元eta-tublin mouse mAb(5G3)TDY043100ul天德悦（北京）-20黄启超 老师雅怡李元oat anti-Rabbit IgG (H+L), HRP ConjugatedS-004F100ul天德悦（北京）-20黄启超 老师雅怡李元oat anti-Mouse IgG (H+L), HRP ConjugatedS-001F100ul天德悦（北京）-20黄启超 老师雅怡李元白彩虹Maker250ul/瓶晶彩-20黄启超 老师雅怡李元IPA裂解液(强)P0013B100ml晶彩4黄启超 老师雅怡李元样缓冲液5*还原型JC-PE0075只/包晶彩-20黄启超老师雅怡李元氮化钠BH315-1100g科昊室温阴凉黄启超老师科昊肖建光液JC-PC001500MLMillipore4黄启超老师雅怡李元白loading bufferJC-PE0075支/包晶彩-20黄启超 老师雅怡李元厚滤纸室温干燥曲萍老师牛血清白蛋白DH016-1.125g科昊4曲萍老师科昊肖建脂奶粉DH220-3100gAmresco室温曲萍老师科昊肖建烯酰胺DH006-3.1500gGenview室温曲萍老师甲叉双丙烯酰胺室温曲萍老师Tris77-86-1500G室温曲萍老师甘氨酸DH149-1.1500G室温曲萍老师SDSDH286-1.2500G室温曲萍老师过硫酸胺室温曲萍老师NaCl室温曲萍老师HCL10019318500g国药集团化学试剂公司室温曲萍老师TEMED4曲萍老师Tween-209005645/sj0107b4612j生工生物室温曲萍老师甲醇室温曲萍老师考马斯亮蓝染色液P0017B250ml碧云天室温曲萍老师考马斯亮蓝染色脱色液P0017C500ml碧云天室温曲萍老师丽春红P0022120ml碧云天室温曲萍老师-巯基乙醇110112100ml西安国安生物室温曲萍老师薄滤纸室温曲萍老师封口袋室温曲萍老师配胶玻璃版180-15040.75莱博公司室温曲萍老师配胶短玻璃版180-1507莱博公司室温曲萍老师梳子180-180415孔莱博公司室温曲萍老师电泳电极室温曲萍老师PVDF膜(0.45uM)IPVH0001026.5cmX3.75mmillipore，immobilon室温曲萍老师PVDF膜(0.2uM)ISEQ0001026.5cmX3.75mmillipore，immobilon室温曲萍老师冰乙酸室温曲萍老师Kcl室温曲萍老师Na2HPO412H2O室温曲萍老师K2HPO4室温曲萍老师三氯乙酸室温曲萍老师冰乙酸室温曲萍老师三、操作步骤：试剂配制 1. 10过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml 溶解后，0.1ml分装 4保存，保存时间为1周。2. 1.5M TrisHCl（pH8.8） lower buffer Tris 18.17g 超纯水 80ml 浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至100ml，过滤 ， 4保存3. 1.0M TrisHCl（pH6.8）upper buffer Tris 12.12g 超纯水 60ml 浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至100ml，过滤 ， 4保存，4. 10SDS SDS 5g 蒸馏水至 50ml 50水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。5. 30Acr/Bic（29：1） 丙稀酰胺（Acr） 29g甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g超纯水至 100m溶解后，过滤 ，4避光保存。以上1-5可自行配制，也可购买SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒（博士德AR0138 or 碧云天 P0012）。6. 5XSDS上样缓冲 （碧云天有售） 0.25mol/L TrisHCl pH6.8 0.5mol/L二硫苏糖醇， 10 SDS 0.5溴酚蓝 50甘油7. 电泳液缓冲液 5x Running buffer Tris（MW121.14） 15.1 g 甘氨酸（MW75.07） 72 g SDS 5 g 蒸馏水至 1000ml 4保存 分离6200KDa 8. 转移缓冲液 1x Transfer buffer 甘氨酸（MW75.07） 14.4g Tris（MW121.14） 3.03g SDS 0.2 g 甲醇 200ml 蒸馏水至 1000ml 4保存 9 . 染色液 500ml 考马斯亮兰 0.5g 甲醇 200ml 冰醋酸 50ml 水 250ml10. 脱色液 500ml 无水乙醇 125ml 冰乙酸 50ml 水 325ml11. PBS缓冲液 10x NaCl 80g KCl 2g Na2HPO412H2O 36.151g (Or Na2HPO4 14.4g) K2HPO4 2.4g 蒸馏水至 1000ml 调pH至7.4 1 x PBST = 1 x PBS(1000ml) + 吐温20 (1ml)12. 10X丽春红染液 丽春红S 0.2g 三氯乙酸 3g 磺基水杨酸 3g 蒸馏水至 10ml 使用时将其稀释10倍13. 封闭液 5脱脂奶 4保存 （完达山脱脂奶粉） 脱脂奶粉 5g PBST 100ml 14. Stripping buffer 100ml -巯基乙醇 0.69ml SDS 2g 1MTris HCl PH 6.7 6.25ml 也可采用30%H2O2,但洗脱能力较Stripping buffer弱。15 PIERCE 或者 Millipore （P90719）的ECL发光液 分A,B液，用前1:1配制。操作步骤 （一） 蛋白样品制备 裂解液： 50ml Tris 0.121g Stock buffer ，可分装， 20 保存。 NaCl 0.146g NaF 0.105g 焦磷酸钠 0.112g 蔗糖 0.428gLysis buffer Stock buffer 500 ul DTT （1M） 0.5 ul 蛋白酶抑制剂 5ul （sigma，P8340）若研究磷酸化，加入Na3VO4 ，终浓度1mM。1 mol/L DTT (20 ml)1称取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料离心管中。2加20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2)，溶解后使用0.22m滤器过滤除菌。3分装后20oC保存。（参照分子克隆二版P884）此外，也可根据实验目的购买碧云天的RIPA裂解液，再加入蛋白酶抑制剂即可。（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2、 每瓶细胞加3ml 4预冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 3、 按1ml裂解液加10 PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） 4、 每瓶细胞加400 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 6、 于4下13500rpm离心25min。（提前开离心机预冷） 7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20保存。 （2） 组织中总蛋白的提取： 如心肌组织 称量100mg用预冷的PBS清洗（300g 5min 4 ）（若无血液残留此步可省略）加Lysis buffer 500 ul 剪碎匀浆 1min 低温（在冰上操作）离心（12000g 10min 4 ）取上清。 分装-80 冻存，蛋白定量。取部分样品 加入 loading buffer 5x （可购买碧云天的loading buffer）， （蛋白：buffer = 体积比 4:1 ）煮沸5分钟， 20 保存。（二） 蛋白定量 PIERCE，BCA蛋白定量试剂盒，按说明操作。（三） SDSPAGE电泳（1） 制胶凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶配方配胶 ，按顺序加，上下层胶一起配，节省时间和枪头，最后加AP和TEMED。（2） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 （3） 灌胶与上样 a、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶） b、 按前面方法配12分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。） c、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。（一般下层胶凝固需要40min。） d、 按前面方法配5的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1-2次就行了，不补胶问题也不大）。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 （一般上层胶凝固需要30min。）e、 测完蛋白含量后，计算含60-80g蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200l的EP管中，加入5SDS 上样缓冲液至终浓度为1。（上样总体积一般不超过15l，加样孔的最大限度可加20样品）（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40l，胶做得很好的话50也是问题不大的）上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。f、 加足够的电泳液(1*RUNNING BUFFER)后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染） （4） 电泳：电泳时间一般45 h，电压为40V较好，也可用60V。（为了加快速度，浓缩胶时用80V跑，到分离胶以后用120V跑）电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（如果目的条带比较大的话，最好使用可视的蛋白Prestain marker，Fermentas的0441和0671比较好。一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好，不要局限于此说明）。 （5） 清水冲洗胶板，小心取出胶，考染4h/过夜脱色液2h/过夜。观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量，判断是否是预期的基因产物。（此步可省略），使用过的染料可以重复使用多次。（四） 转膜 （1） 取出玻璃胶板，用自来水冲洗干净，塑料刀轻轻撬开上方的玻璃板，沿胶分界线切掉上层胶，切掉多余的胶，将切好的胶放入预冷的transfer buffer 中浸泡30min。（2） 按胶大小切PVDF膜（用尺子量胶的大小，再用铅笔做标记），先用甲醇浸泡5min，再放入 transfer buffer 中。按胶大小切两块超厚滤纸（滤纸应该比膜小），放入transfer buffer 中浸泡5min以上使用。 （PVDF膜,millipore; 超厚滤纸,Bio-Rad）（3） Bio-Rad半干转系统：电转三明治顺序如下 +极超厚滤纸 PVDF膜PAGE胶超厚滤纸 极顺序为：阴极滤纸胶膜滤纸。滤纸的长宽分别比胶小12mm，而膜的长宽分别比胶大12mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。各层间不能有气泡，尤其是胶与膜之间。可用沾湿的玻璃棒轻轻碾开，赶走气泡。与胶相接触的面为膜的正面，剪膜的一角作为标记。（4） 盖上盖子，打开电源开始转膜。设置电压25v,时间30min。（40-100kd此条件即可）。电流应在0.1-0.2之间，不得大于0.3， 若过大应及时停止，可能是液体不好。（5） 转完后将膜用1丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。（一般不需要做这步） （6） 封闭将膜放在用5%脱脂奶粉中（平皿装），37C 1h。若所测样品中含有生物素则不能用脱脂牛奶，改用5%BSA（BSA 组分五，鼎国有售）。（五） 免疫反应（也可使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，节约抗体） （1） 将一抗用PBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；剪下适当大小的一块儿PE手套铺于上，四角用水浸湿以使手套保持平整；将抗体溶液加到PE手套上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；用保鲜膜盖住，4度过夜（或者室温下孵育12h后），用PBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min。（2） 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育12h后，用PBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min。（六） 化学发光，显影，定影 （1） 将PIERCE 或者 Millipore （P90719）的ECL发光液， A和B两种试剂1：1混合,待用。（2） 打开凝胶成像系统，打开抽屉铺上保鲜膜，尽量铺平。放上PVDF膜，关上抽屉，打开光圈，调整膜的位置，具体如下： 打开电源开关； 打开成像系统及电脑； 铺上保鲜膜，放上PVDF膜，加上发光液，关闭抽屉； 点击桌面上Quantity One，从FILE下拉菜单中选择ChemiDoc XRS， 打开图像采集窗口，自动曝光，保存，FREEZE。（七） 凝胶图象分析：用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。 （八）发光完的PVDF膜仍可重复使用，strip掉抗体（stripping buffer， 50度45min； or 30% H2O2 37度15min），漂洗三遍后从封闭开始做其他抗体。四、常见问题对初学者看什么资料比较好？技术实验指南和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?1)玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净。2)过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。3)加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。4)稍微注意手法，均匀加入。5)灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面。6)边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度。7)温度也是影响胶聚合的重要因素，可能为了让胶更快的凝固而把胶放到50度的温箱，由于受热不均匀，也会造成胶聚合不均匀。胶为什么总是漏？1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方。3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干。（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，因为凡士林不导电，会影响电泳的效果。）7）可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。8）因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，一般不会再漏。9）先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了。条带跑得比正常的窄？1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀。2）可能与拔梳子有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。3）可能是样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢。4）常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致。5）可能是系统的ph出了问题，有可能是电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液。为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？1）微笑是因为灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。“倒微笑“也称“皱眉”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象。2）书上说出现“微笑”是因为整个胶冷凝的不均匀，中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加AP和TEMED后应该混合均匀。3）样品中盐浓度过高、点样量太多或每孔点样量不均匀、电泳电压不稳定或过高Western-blot制胶时好多泡泡怎么办？1）首先，玻璃板一定要洗干净，用洗洁净洗，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。3）倒胶的时候，用1ml的枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡。4）将胶在小烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯的嘴靠在玻璃边缘，直接倒进去，速度快，而且不容易产生气泡，不妨试试。5）用双蒸水封时建议用200ul的枪加水，这样压力小，以免把胶冲起来。6）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。7）分离胶中的气泡与插梳子有关，垂直插容易产生气泡，且不容意排除。将梳子倾斜5-10度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。8)还有一个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。凝胶肿胀或卷曲注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。条带歪斜、或漂移因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。膜上单个或多个白点1）转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。2）同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。转膜缓冲液过热缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高，同时转膜过程中注意降温。背景过高1）封闭不全。2）一抗或者封闭液与膜蛋白的交叉反应。3）一抗或二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。5)曝光时间的控制。6、没有信号1)用单抗时比较容易出现这种情况。2)蛋白的表达量3)蛋白转膜效率4)一抗二抗的效价问题微量进样器堵了怎么办？首先从预防入手，每次用后的进样器及时用蒸馏水清洗！如果堵了，不要紧，有办法：可以用如下办法解决：1）首先反复推拉上样针，看是否可将堵塞物吹出来；2）方法1不灵，若是25或50ul的针，把针从后侧拔出，然后重新插入，使其内部产生气压，可能压出堵塞物质；3）如上述方法不灵可以在拔出后注入些清水，然后重新插入，用水压排出，4）最后的方法，最灵的方法：开始步骤同第3种方法中，在加入水后，将上样器的前端针部放在酒精灯上煅烧至红色（估计在什么位置堵的），注意烧红部分不要距离玻璃过近，然后，趁热突然推针，将水强行推出，通道打开后，再通过稀酸或稀碱冲洗即可！5）或者放在超声清洗仪里，超声试试。在western实验中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，能否有人解释一下二者在使用中的区别？选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根据需要选择合适的浓度。有注明可以用来做western blot的一抗，可以用来做western blot吗？不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。做western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，能介绍一下膜的选择吗？PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。 都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献。为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗？做WESTERN必须要内参吗？一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化.所以严格意义上说,内参是必须做的。western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？购买一抗时发现单抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA)要便宜不少,用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？什么是短路？如何控制和发现短路呢？可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。Western Blot哪种染色好？（1） 阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5g，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低（2） 胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。（3） 生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考蛋白质技术手册)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压电流；增加转移时间。 DAB显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么？ DAB显色在辣根过氧化酶的作用能形成一种灰褐色的终末产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，DAB的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。酶显色与荧光显色之间，各自的优缺点是什么？免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗原)，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原(或抗体)，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的。免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，但是荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法，对石蜡切片标本尤为适用，为免疫病理研究开辟了一条新途径，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察，免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5-10甲醇。如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的 comb（梳子）。蛋白变性后可以存放多久？-80，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白