细菌耐药性检测临床-幻灯片1.ppt

细菌耐药性监测与临床细菌耐药性监测与临床 省立医院检验科省立医院检验科 李华李华 为什么要检测耐药菌为什么要检测耐药菌 n感染病原的变迁造成现代感染模式 n耐药菌株的流行 n临床的需要(指导感染性疾病的个体化治疗，细菌的 耐药性监测指导经验治疗) 20072007年年肠肠肠肠杆菌属杆菌属细细细细菌耐菌耐药药药药率（率（%） 抗菌药物耐药敏感 阿米卡星13.779.6 庆大霉素2868.9 哌拉西林48.644.8 哌拉西林/他唑巴坦22.465.2 头孢呋辛54.539.3 头孢噻肟37.746.8 头孢他啶36.959 头孢吡肟14.379.7 头孢哌酮/舒巴坦976.4 头孢西丁98.71.3 亚胺培南0.998.9 美罗培南0.998.9 环丙沙星2370.3 复方磺胺甲噁唑34.763.9 对头孢哌酮/舒巴坦、碳青霉烯类、头孢吡肟和阿米卡星的耐药率较低 （15%） 20072007年年1212家医院家医院39883988株株铜绿铜绿铜绿铜绿 假假单单单单胞菌耐胞菌耐药药药药率率 （%）抗菌药物耐药敏感 阿米卡星 18.773.9 庆大霉素 39.256.2 哌拉西林 40.159.9 哌拉西林/他唑巴坦 32.867.2 替卡西林/克拉维酸 5050 头孢哌酮 40.345.4 头孢他啶 29.365.2 头孢吡肟 2663.2 头孢哌酮/舒巴坦 22.854.8 氨曲南 31.248.4 亚胺培南 35.861.4 美罗培南 28.566.6 环丙沙星 29.861.2 碳青霉烯类的耐药率为2836%，亚胺培南比美罗培南略高 对所测试抗菌药的耐药率均接近20%或以上 2007 2007年年1212家医院家医院31573157株不动杆菌属细菌的耐药率（株不动杆菌属细菌的耐药率（ %） 抗菌药物耐药敏感 阿米卡星51.846.4 庆大霉素62.536.4 氨苄西林/舒巴坦43.343.5 哌拉西林/他唑巴坦54.437.8 头孢噻肟62.56.7 头孢他啶52.439.7 头孢吡肟5539.3 头孢哌酮/舒巴坦5.373.9 头孢西丁97.42.6 亚胺培南35.363.1 美罗培南39.958.6 环丙沙星6037.3 米诺环素32.954.2 头孢哌酮/舒巴坦耐药率低，对所测试抗菌药耐药率均较高 两种碳青霉烯类耐药率均35% 细菌产生耐药性的原因细菌产生耐药性的原因 n分裂繁殖方式： n 以其二分裂繁殖方式使自身可在很短的时 间里分裂繁殖，使自身增加数百亿万倍， 有利于耐药性的播散。 n 耐药机制的产生： 细菌可以通过多种耐药 机制对抗生素产生耐药性，产生各种灭活 酶、抗生素膜渗透障碍、靶位的改变等. 细菌产生耐药性的原因细菌产生耐药性的原因 n抗菌药物的发现和广泛应用 n环境的原因 n 早在抗生素应用以前有些细菌就具有备抗 药基因。细菌存在于地球上已有3乙多万年了 ，早在人工合成的抗生素使用之前，细菌就 与自然界中的一些天然的抗菌成分以及其他 微生物产生的抗菌物质广泛接触而获得了耐 药基因。（放线菌的代谢产物、天然的植物 、中草药等）。 菌产生耐药性的原因菌产生耐药性的原因 n自从青霉素（1942年在美国首次）应用 于临床后2-3年内，75%的葡萄球菌对其产 生了抗药性，目前葡萄球菌产酶株在95%- 100%，对青霉素均耐药。1959年耐酶青霉 素的合成并投入使用，仅2年时间1961年英 国就报道分离出mrsa并且耐药菌迅速在世 界扩散。目前我国临床实验室分离的金葡 菌有近50% 的为mrsa。 耐药菌产生的原因耐药菌产生的原因 n耐药菌株被迅速选择和扩散： n1940-1960：青霉素时代 n1960-1973:广谱青霉素、二代头孢时代 n1978-1995：广谱内酰胺类、氟喹诺酮类 n其结果：耐药菌株被迅速选择和扩散 菌产生耐药性的原因菌产生耐药性的原因 n在世界许多地方，抗生素使用于农业、渔 业、林业水产及家禽养殖业中，在施肥与 饲料中被常加入抗生素，这样做结果是大 量杀灭了自然界中的敏感菌株而选择出了 耐药菌株，这些耐药菌株最终可以通过食 物链或直接接触传递给人。 细菌产生耐药性的原因细菌产生耐药性的原因 n世界范围内迅速扩散 n 人口密度过大 1万年前地球人口只有100 200万，而现在已有60亿，人群之间有 了更多接触机会；高度繁荣的旅游业、 大量的旅游流动人口，使在某一处发生 的耐药菌可以没有国界地迅速地扩散到 世界各地。 n 细菌产生耐药性的原因细菌产生耐药性的原因 n正常情况下，每一类细菌产生的耐药性只 发生于少数细菌中，难以与压倒多数的优 势敏感菌竞争，故危害性较小，只有当敏 感菌因抗生素的选择压力作用下而被大量 杀灭后。耐药菌才大量繁殖而成为优势菌 ，并导致耐药菌的产生。因此，细菌耐药 性的发生和发展是抗菌药物广泛应用尤其 特别是无指征滥用的结果。 细菌产生耐药性的原因细菌产生耐药性的原因 n现代医学的发展促进了耐药菌的产 生 n 新的技术如静脉导管、人工瓣膜、介 入治疗、切开引流、人工呼吸等，为一 些机会致病菌提供了进入人体的通道， 而这些机会致病菌比有毒力的致病菌更 易产生耐药性。 n 细菌产生耐药性的原因细菌产生耐药性的原因 n 此外，大量抗生素的发现使临床医生有 过多的选择余地，所以在感染性疾病的治 疗上很少强调改善宿主的功能，也不采用 针对不同病原菌敏感的抗生素治疗，而一 开始就选择使用广谱抗生素其，结果必然 是导致了大量耐药菌株的产生。抗菌药物 的使用不当同时也促进了耐药菌在机体内 和医院环境中的定植繁衍，进而导致交叉 感染和内源性感染日益增多。 细菌的耐药机制细菌的耐药机制 n遗传学机制： n染色体介导的耐药/突变耐药 n质粒介导的耐药性/获得性耐药 n生物化学机制表达： n产生灭活酶/钝化酶 n抗生素渗透障碍 靶位的改变 n其他机制 n产生拮抗物 n改变代谢状态、如呈休眠状态、营养缺陷等 细菌的耐药机制细菌的耐药机制 临床病原菌产生的重要的水解酶临床病原菌产生的重要的水解酶 窄谱-内酰胺酶 n-内酰胺酶 超广谱酶 ampc酶 kpc酶 其他酶 临床上最重要的革兰阴性菌内 酰胺酶 n超广谱内酰胺酶（esbls） n头孢菌素酶（ ampc酶） n碳青霉烯酶（kpc酶） 革兰阴性菌对内酰胺类药物的 耐药性及检测方法 n内酰胺酶的分类 n1耐药机制分类 n 质粒介导 tem、 shv、 oxa等 n 染色体介导type(ampc酶) n2分子生物学分类（ambler) a、b、c、d四类 n功能分类bush分类 1、2、3、4个组 超广谱超广谱内酰胺酶内酰胺酶 extended spectrhmextended spectrhm-lactamases-lactamases n基本概念 n（1） 主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆科细菌 产生. n（2）在体外试验中可使三代头孢和氨曲南的抑菌圈缩 小，但并不一定在耐药范围。 n（3）加入克拉维酸可使抑菌圈扩大（对酶抑制剂敏感 ）。 n（4）临床对内酰胺类药物（包括青霉素类和头孢类 ）耐药，但对碳青霉烯类和头霉烯类药物敏感。 n（5）由质粒介导，往往由普通的内酰胺酶基因突变 （tem-1，tem-2和shv-1）而来。 esblsesbls的发现和流行情况的发现和流行情况 n产生基础 n最常见的由质粒介导的内酰胺酶是tem-1，tem-2 和shv-1酶，这些酶仅对第一代头孢菌素有弱水解活性 （广谱酶）。80年代中期，由于临床上广泛使用头孢 类抗生素尤其是头孢他啶和头孢曲松，导致tem-1和 shv-1内酰胺酶突变酶的出现。 n首次发现 n1982年，英国 1983年，德国 n目前状况 n肺炎克雷伯菌是产生esbl的最常见菌，产酶可高达 40%以上，我院2007年肺炎克雷伯菌产esbl达37% 38%，大肠产酶达40%，肠杆科其他菌如产酸克雷伯菌 、大肠埃希菌、奇异变形杆菌中也可分离到esbl。 肠杆科细菌产肠杆科细菌产esblsesbls概况概况 ntem-1 n最普遍 ,典型的情况是tem-型和shv-型的esbls由大的 多重耐药质粒编码 nesbls类型多且都有自己特异的底物和酶活性，是针对不 同类型的广谱内酰胺类抗生素或内酰胺酶抑制剂产生 的耐药 ,迄今已发现有上百种类型的esbls n肠杆科细菌大多都具产酶能力. esblsesbls流行特点流行特点 n1、世界范围流行，但有区域性 n2、确切的流行情况不清楚（耐药表型不明确 ，有不均一表现） n3、主要见于医院感染 n4、esbls的编码基因在质粒上，易造成在不 同菌株中的播散， n5 、对酶抑制剂敏感； 对edta不敏感 ； esblsesbls的耐药机制的耐药机制 n基因突变 n耐药基因由质粒携带 nesbls 多由普通的内酰胺酶基因发生突变而来 。 nglyser-238突变引起酶的活性区扩大，导致对 氧化亚氨基头孢菌素的亲和力和水解活性升高， 体外诱变也证实第168和238位的置换可增强对氧 化亚氨基内酰胺类抗生素的水解活性。 esblsesbls耐药特点耐药特点 n1、青霉素类、一、二、三代头孢菌素、（部分可水解 四代）和单环酰类抗生素均耐药 n2、对碳青霉烯类和头霉素类敏感 n3、对酶抑制剂敏感 n4、产生esbls的细菌往往多重耐药。其质粒上常有氨 基糖苷类、氯霉素或tmp-smz等的耐药基因。（例有 统计产酶株amk70.37%耐药、cip75.30%耐药；不产 酶株分别为13.20%、35.81%） 产产esblsesbls细菌感染的临床表现细菌感染的临床表现 n1、临床表现难以治愈的感染或反复复发的 感染。 n2、三代头孢菌素治疗临床无效。 esblsesbls表型的检测表型的检测 筛选试验 n 标准纸片琼脂扩散法 n mic肉汤稀释法检测 n 双纸片协同试验 确认试验 n 纸片确认试验 n mic肉汤稀释法 n 仪器 n e-test pcr检测 标准纸片琼脂扩散法 n培养基 ： muller-hinton琼脂 n药敏纸片 头孢泊肟(10ug/片) 、头孢他啶、头孢 曲松、 头孢噻肟和氨曲南（均为30ug/片）中 n 至少二种： n 接种方法 标准纸片扩散法 n孵育条件、时间： 35、 空气、1618小时 标准纸片琼脂扩散法 n判断标准 ： 头孢泊肟的抑菌环直径17mm n 头孢他啶的抑菌环直径22mm n 头孢曲松抑菌环直径25mm n 孢噻肟和氨曲南抑菌环直径27mm n 有一种药敏纸片结果在此范围均应 高度怀疑为产 esbls 株应进一步做确认试验， n报告方式：疑似产 esbls 株，所有的青霉素类 、头孢菌素类（包括三、 四代头孢）单环酰胺 类均视为耐药； n方法的局限性 易漏检 n常规药敏试验：细菌对药物mic/直径往往 可能落在敏感范围，所以尽 可能检测其耐药机制 检测esbls的意义 n一旦诊断为产esbls所有的青霉素类、头孢 菌素类（包括三、四代头孢）单环酰胺类 均视为耐药，无论体外试验是否敏感。 案例案例 n患者，女，48岁，因尿频、尿急、肉眼血尿收住本院 干部病房，临床诊断：尿路感染，给予三代头孢，静 脉滴注一周，症状好转出院。一周后复发，再次入院 ，治疗同前，好转出院，再次复发。 n细菌培养：大肠埃希菌，产esbl n敏感的抗生素：亚胺培南、头孢西丁、呋喃妥因。 n自购呋喃妥因治疗后没有复发。 头孢菌素酶(ampc酶) bush酶 n基本概念: n1、 ampc酶又称bush酶，它的产生是由染色体上 的ampc基因所编码产生; n2、分类属bush 型。 n3、几乎所有的革兰阴性杆菌均可产生此酶，通常 这种酶的表达水平很低，但在有诱导剂存在时， 酶的产生会大大增加（表达水平增加到10100 倍），因此这类酶又叫诱导酶。 n 主要产酶菌株主要产酶菌株 n绿脓杆菌 100% n吲哚阳性的变形杆菌 100%； n肠杆菌属： 80%； n枸橼酸杆菌属： 80%； n沙雷菌属： 80%； n沙门菌属： 80% 产生机制：产生机制： n诱导： n 染色体ampc基因通常处于关闭/抑制状态, ampc 基因的编码作用被ampd基因所抑制，当 ampd基因发生去抑制突变时（去阻遏）抑制 作用被解除， ampc基因编码产生高产ampc酶 。这个酶可以水解所有三代头孢菌素，并且不 被酶抑制剂所抑制。 n 内酰胺类抗生素存在与环境中，与细菌细 胞壁上的青霉素结合蛋白结合，pbps 4、7a、 7b被激活,三个 npbps被激活就可启动ampc基因，诱导ampc 酶表达。活化因素就是抗生素。 头孢菌素酶(ampc酶) bush酶 n诱导剂： n 内酰胺类抗生素 亚氨培南是潜在的 酶诱导剂，但没有去阻遏用；许多三代头 孢菌素是弱诱导剂，但有选择去阻遏作用 ； ampcampc酶分类酶分类 n1、染色体ampc酶：（bush 内酰胺酶） n2、质粒型ampc酶： n 近年来还发现了质粒介导的ampc酶。上述的ampc 基因活化结果有两种表达： n（1）可逆性 当去除诱导剂后，酶的表达水平将恢复 到正常低基础水平（体制性表达）。称低产ampc酶染 色体介导。 n（2）去阻遏 不可逆的，amp基因活化是不可逆转的 即使停止使用药物也仍然持续产生容易跳到质粒上称 持续高产ampc酶。 n n 分型及检测方法分型及检测方法略略 检测高产检测高产ampcampc酶的意义酶的意义 n n 细菌一旦检测为高产ampc酶，提示 为多重耐药；对三代头孢菌素、及含酶 抑制剂的复合抗生素治疗通常导致临床 治疗失败； n 应选用碳青霉希类或第四代头孢或联 合喹诺酮类（氨基糖苷类）治疗。 n实验室对同一患者相同部位检出的同种病 原菌，应每3-4天检测抗生素敏感性，以监 测耐药机制产生（三代头孢sr，头孢西 丁s r） n专家系统药敏评注 碳青霉烯水解酶碳青霉烯水解酶 n基本概念 ： 碳青霉烯水解酶是指所有能明显水解碳青 霉烯的内酰胺酶，而不是单纯的“碳青霉 烯酶”。 碳青霉烯水解酶的发现及流行特点：碳青霉烯水解酶的发现及流行特点： n20世纪90年代初，日本发现质粒介导的金属酶-imp-1 ，可在细菌之间转移。 n1996年日本17家医院的研究中发现，0.4%的铜绿假单胞 菌带有imp-1基因。 n不久在意大利的一株鲍曼不动杆菌和新加坡的一株肺 克菌中也发现了该类酶。 n法国的一株铜绿假单胞菌中发现的质粒介导的金属酶 vim-2，与意大利一株铜绿假单胞菌中发现的vim-1具 有高度同源性，编码vim-1的基因位于转座子上。 n近年来由于产esbls和ampc酶的菌株增多引起碳青霉 烯类抗生素的临床应用增加，可以预测世界其它地区 亦可能出现产碳青霉烯酶菌株的流行。 什么是什么是kpckpc酶？酶？ 国内： n已在肠杆菌科的多个菌属中有报道。 n肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、产酸 克雷伯菌、沙门菌属、弗劳地柠檬酸杆菌和铜绿 假单胞菌等。 n该类酶除阴沟肠杆菌可有染色体介导外，其他各 类细菌均可为质粒介导，已成为临床治疗难题 碳青霉烯酶代表碳青霉烯酶代表- - kpckpc酶酶 n碳青霉烯酶，分子分类法(amblar)的a组丝氨酸酶、功能 分类法(bush)的2f组，主要由质粒介导，其酶活性可受酶 抑制剂抑制。 n可导致细菌对碳青霉烯类、青霉素类、广谱头孢菌素及单 环类等抗生素的耐药性。 nkpc-1kpc-4等4种。它们之间只有个别氨基酸发生了突 变 nkpc-1、美国、 1996年在一株对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌中发现， 以后仅在几年时间内，已在美国、特别在美国的东北部各 州蔓延，并造成局部地区暴发流行。 细菌一旦产生碳青霉烯酶临床治疗 很困难 肠杆菌科细菌耐药机制 nesbls n质粒型ampc酶 nkpc 碳青霉烯酶 肠杆菌科细菌中的kpc 碳青霉烯酶 n可以水解碳青霉烯类 (imipenem,ertapenem ertapenem, meropenem, doripenem). n主要发生在美国东部医院的icu病房. n肺炎克雷伯菌和其他的肠杆菌科细菌. n常规的药敏试验方法不易检出，碳青霉烯类对这 些细菌的mic往往 2 g/ml (仍然是敏感的) nkpc 酶可以水解广谱头孢菌素 ，因此所有对具有 产esbl酶的肠杆菌科细菌应该筛选碳青霉烯酶 如何检测碳青霉烯酶？如何检测碳青霉烯酶？ n产kpc酶的菌株用常规药敏试验不容易检出。 n可将厄他培南列为常规药敏试验的品种 n对所有具有esbls/ampc酶样表型（即对第三、 第四代头孢菌素耐药）的肠杆菌科细菌采用纸片 法或mic法（e-试验）进行厄他培南（和其他碳 青霉烯类）的测定。 n如mic为2或4g/ml应视作有产kpc酶和其他碳青 酶霉烯酶的可能。 n这时应与临床医师联系，并将该菌株送往参考试 验室作进一步的研究。 改良的 hodge test pcr 测定 kpc酶 泛耐菌和多重耐药泛耐菌和多重耐药 n泛耐菌: n如果该细菌对第3和4代头孢菌素,含酶抑制 剂的复方制剂,碳青酶烯类,氟喹诺铜类和氨 基塘甙类均耐药,但对多粘菌素敏感为泛耐 菌. n多重耐药菌: n对5类药物中的一类或几类耐药为多重耐药 菌. 临床常用抗菌药物临床常用抗菌药物 n-内酰胺类抗生素 n糖肽类-万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁 n氨基糖苷类 n大环内酯类 n喹诺酮类药物 n其它抗菌药-物磷霉素、多黏菌素链阳菌素等，抗真菌药 泛耐药菌株（泛耐药菌株（pan drug resistant strainspan drug resistant strains ） n细菌：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌 n对常规药敏试验的药物均耐药 n哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头 孢吡肟、头孢他啶、氨曲南、环丙沙星、阿米卡星、庆 大霉素、亚胺培南强力霉素和smz-tmp n采取哪些措施 n菌株重新鉴定 n试验其它药物：多粘菌素/粘菌素 n敏感性试验或协同试验 绿脓杆菌耐药机制绿脓杆菌耐药机制 n膜通透性下降 n高产ampc酶; 产esbl; n产金属酶 n泵出机制 n生物膜 铜绿假单孢菌铜绿假单孢菌 n铜绿假单胞菌的细胞外膜上没有大多数革 兰阴性细菌所具有的典型的高渗透性孔蛋 白，它的孔蛋白通道对小分子物质的渗透 速度仅为典型孔蛋白通道的1%。 不动杆菌的耐药机制不动杆菌的耐药机制 n对多种窄谱内酰胺酶耐药由于tem1 和carb型内酰胺酶 n对新型三代头孢菌素耐药是因为产大量染 色体头孢菌素酶和超广谱的tem酶 n不动杆中最主要的碳青霉烯酶是d类酶 oxa-23、24、25、26、27、40、49、51、 54、55、58、60 n该酶能水解亚胺培南、青霉素，但不水解三代 头孢菌素. 不动杆菌主要耐药机制 n不动杆菌中还产imp或vim型金属酶，该 酶水解底物范围广，包括碳青霉烯类、 青霉素类和头孢菌素抗生素，不被克拉 维酸等酶抑制剂抑制，但能被edta、2- 巯基丙酸抑制 革兰阴性菌革兰阴性菌 革兰阳性菌革兰阳性菌 n n esbls mrsaesbls mrsa n n ampc ampc visavisa与与vrsavrsa n n kpc kpc vrevre prsp prsp n n 耐药菌、细菌泛耐和多重耐药的监测工作耐药菌、细菌泛耐和多重耐药的监测工作 必须靠临床医护人员和微生物检验工作人必须靠临床医护人员和微生物检验工作人 员携手，才能做好员携手，才能做好- -加强沟通加强沟通 小结小结 n n 1 1细菌耐药性产生是必然性、预防性细菌耐药性产生是必然性、预防性 n n 2 2细菌的耐药机制多样性、常见的耐药机制细菌的耐药机制多样性、常见的耐药机制 n n 3 3针对耐药性最好的治疗方法针对耐药性最好的治疗方法个体化治疗个体化治疗 n n 4 4加强临床与实验室沟通非常重要加强临床与实验室沟通非常重要 案例案例1 1 临床临床 患者：患者： 杨杨 x x x x 、 男男 4343岁岁 、住院号、住院号 77574927757492 主诉：发热主诉：发热8 8天伴头痛天伴头痛 入院时间：入院时间：20082008年年2 2月月1818日日5pm5pm 入院体温：入院体温：3939 入院诊断：发热原因待查？入院诊断：发热原因待查？ 入院检查入院检查: wbc 3.2x10: wbc 3.2x10 9 9 /l2.4x10/l2.4x10 9 9 /l,/l, hb 140g/l 109g/l hb 140g/l 109g/l neu 52.5%, ly 33.8%, mono12.1% neu 52.5%, ly 33.8%, mono12.1% mp(-) mp(-) crp 32.1mg/l crp 32.1mg/l 尿尿rt,rt,胸透均正常胸透均正常 案例案例1 1 临床临床 诊断与鉴别诊断：诊断与鉴别诊断： 1.1.感染性发热感染性发热 细菌感染细菌感染 患者无细菌感染的临床症状与体征，患者无细菌感染的临床症状与体征， 血象及临床不支持血象及临床不支持 病毒感染病毒感染 发病初起为感冒样症状，流涕、鼻塞、发病初起为感冒样症状，流涕、鼻塞、 低热后又出现畏寒、高热伴全身乏力浑低热后又出现畏寒、高热伴全身乏力浑 身酸痛血象身酸痛血象wbcwbc下降，抗生素治疗无效考下降，抗生素治疗无效考 虑病毒感染可能性大虑病毒感染可能性大 肺结核肺结核 虽无咳嗽、胸痛等症状，胸透阴性，但虽无咳嗽、胸痛等症状，胸透阴性，但 有午后发热、盗汗有待排除有午后发热、盗汗有待排除 案例案例1 1 临床临床 2.2.非感染性发热非