氨基酸含量的测定.docx

氨基酸含量的测定标准曲线绘制准确吸取200ug/ml的氨基酸标准溶液0.0，0.6，0.8，1.0,1.2，1.5，2.0 ml，分别置于25ml容量瓶或比色管中，各加水补充至溶剂为4.0ml，然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各1ml，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，再摇匀，加水至标线25ml，摇匀。静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液夨订其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。样品的测定：将虾研磨冷却过滤后稀释10倍，吸取澄清的样品溶液1.5ml，平行三次，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值在标准曲线上即可查得氨基酸的微克数。公式：氨基酸总量（ug/100g）=(c/m*1000)*100*10式中c是指从标准曲线上查得的氨基酸的ug数； M是指测定的样品溶液相当于样品的质量g；PH计酸度计测量ph的方法：(1)拿下笔帽(2)按on/off键，机器显示运作(3)将ph计放入待测液中(4)轻轻晃动ph计，保证内气泡逸出，使之于溶液充分接触，勿碰撞杯壁(5)ph计会立即显示数值，将笔置入待测液待数值稳定，30秒内将显示正确数值，(特：ph计数值上下浮动或不稳定是正常现象)(6)按hold键锁定数值，可在待测溶液外记录读取，继续按hold键解除锁定(7)按on/off键关闭ph计(8)轻甩PH计测试笔上多于的水，用蒸馏水或脱离子水冲洗，盖上笔帽测量温度方法在测试模式下，温度数值与ph数值同步显示在液晶面板上，但在校准模式下不显示，数值默认为摄氏温度。（一） 挥发性盐基氮（TVB-N）的测定 半微量定氮法（1）原理：蛋白质在酶和细菌的作用下分解后产生碱性含氮物质，有氨、伯胺、仲胺等，此类物质具有挥发性，可在碱性溶液中被蒸馏出来，用标准酸滴定，计算含量。（2）试剂氧化镁混悬液(10g/L) 称取1.0g氧化镁，加100ml水，振摇成混悬液。硼酸吸收液（20g/L）0.2%甲基红乙醇液0.1%亚甲蓝水溶液临用时将等量混合为混合指示液0.010mol/L盐酸标准溶液或0.0100N 硫酸标准溶液（3）仪器半微量定氮装置：Markhan氏式微量滴定管：最小分度0.01ml （4）操作方法样液的制备：将样品除去脂肪、骨头及筋腱后，切碎搅匀，称取10g于锥形瓶中，加100ml水，不时振摇，浸渍30min后过滤，滤液置于冰箱中备用。测定：预先将盛有10ml吸收液并加有5-6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入锥形瓶内吸收的液面下，精密吸取5ml上述样品滤液于蒸馏器反应室内，加5ml 1%氧化镁混悬液，迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸汽，待蒸汽充满蒸馏器内时即关闭蒸汽出口管，由冷并行管出现第一滴冷凝水开始计时，蒸馏5min即停止，吸收液用0.0100N盐酸标准溶液或0.0100mol/L硫酸标准溶液滴定，终点呈蓝紫色。同时做试剂空白试验。（5）计算X1=V1-V2xN1x14M1x5/100100式中：X1样品中挥发性盐基氮的含量，mg/100g V1测定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液体积，ml V2试剂空白消耗盐酸或硫酸标准溶液体积，ml N1盐酸或硫酸标准溶液的摩尔浓度，mol/L M1样品质量，g 141N盐酸或硫酸标准溶液1ml相当氮的毫克水分含量直接干燥法实验仪器1称量瓶2分析天平3电热恒温干燥箱4干燥器操作方法1将称量瓶清洗干净，瓶盖斜支于瓶边，在101-105烘箱内干燥1.0h。将瓶盖盖好取出，置干燥器中冷却0.5h称量。重复操作至恒重，准确到两次称量值不超过0.2mg。2.样品测定将样品研磨或切碎，称取2-10g (精确至0.0001g )处理好的样品于称量瓶内。将上述样品置于温度预先调节至101-105烘箱内，称量瓶盖斜支于瓶边，干燥2-4h。然后将称量瓶盖好取出，放入干燥器内冷却，约0.5h，待温度将至室温后称重。然后再放入101-105干燥箱中干燥1h左右，取出，放入干燥器内冷却0.5h后再称重。重复操作至恒重为止（前后两次称重质量差不超过2mg）。实验结果计算按下式计算样品中水分的含量：x%=m1-m2m1-m0x100式中，X-样品中水分含量，g/100g m0-称量瓶质量，g; m1-称量瓶加样品质量，g m2-称量瓶加样品干燥后质量蛋白质凯氏定氮法实验原理：蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。三、仪器与试剂（一）试剂1、硫酸铜（CuSO45H20）2、硫酸钾3、硫酸（密度为1.8419g/L）4、硼酸溶液（20g/L）5、氢氧化钠溶液（400g/L）6、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。（二）仪器微量定氮蒸馏装置：1、电炉；2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。四、实验步骤1、样品消化称取虾肉粉约0.2-2g（0.001g），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以45角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。2、定氮装置的检查与洗涤检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。测定前定氮装置如下法洗涤23次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。3、碱化蒸馏量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，加入混合指示剂23滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a关闭，螺旋夹b开启的状态下，准确吸取10.0mL样品消化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。使10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹a，关闭螺旋夹b，开始蒸馏。通入蒸汽蒸腾5min后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。同时吸取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏操作。4、样品滴定以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色为终点。5、数据记录项目第一次第二次第三次样品消化液（mL）滴定消耗盐酸标准溶液（mL）消耗盐酸标准溶液平均值（mL）五、结果计算Xx=v1-v2xCx0,0140m/100x10xFx100式中X样品蛋白质含量g/100g）；V1样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）；V2空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）；c盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）0.0140 1.0mL盐酸c(HCL)=1.000mol/L标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；m样品的质量（g）F氮换算为蛋白质的系数， 肉与肉制品为6.25计算结果保留三位有效数字。菌落总数（1） 恒温培养箱 361， 301（2） 冰箱：2-5（3） 恒温水浴箱：461（4） 天平：感量为0.1g（5） 无菌吸管1.0ml、10.0ml,标有0.1ml单位刻度。（6） 均质器。（7） 振荡器（8） 无菌锥形瓶：容量250ml、500ml（9） 无菌培养皿：直径90mm（10） pH或pH比色管或精密pH试纸（11） 放大镜或菌落计数器培养基和试剂1平板计数琼脂培养基2磷酸盐缓冲液3无菌生理盐水检样25g(mL)样品+225 mL稀释液，均质检验程序10倍系列稀释 选择2个-3个适宜稀释的样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养皿内 每皿中加入15Ml-20mL平板计数琼脂培养基，混匀 培养 计数各平板菌落数 计算菌落总数 报告五、方法步骤1、检验稀释和培养、以无菌操作，将检样25g（或25ml）剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水的广口瓶内（瓶内置有适量玻璃珠）或灭菌研钵内，经充分振摇或研磨用成1：10的均匀稀释液。2、用1.0ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1.0ml，沿管壁徐徐注入含有9.0ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内液面），振摇试管混合均匀，作成1：100的稀释液。3、另取1.0ml灭菌吸管，按上述操作作10倍稀释，如此每递增稀释一次，即换1支1.0ml吸管。4、根据食品卫生要求或对标本污染程度的估计，选择2-3个适宜稀释度，分别作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释液的吸管移1.0ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。5、稀释液移入平皿后应及时将凉至46营养琼脂（可放于461水浴保温）注入平皿约15ml，并移动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1.0ml灭菌生理盐水的平皿内作空白对照。6、待稀释液入平皿后，翻转平板，置361温箱内培养242h（肉、水产品、乳和蛋品为482h）取出，计算平板内菌落数，乘以稀释倍数，即得每克（或ml）样品所含菌落总数。（二）计算方法1、平板菌落数的选择选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板应采用两上平板的平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落可计算半个平板后乘以2代表全皿菌落数。2、稀释度的选择（1）应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（表9-1例1）。（2）若有两个稀释度，其生长的菌落数在30-300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数，若大于2，则报告其中较小的数字（表9-1例2及3）。（3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表9-1例4）。（4）若所有稀释度的平均菌落数均