课件：中药药物分析方法.ppt

第三章 中药药物分析方法,药物分析教研室,控制中药质量，对保证中医临床用药安全、合理、有效、可靠极为重要。而中药中有效成分含量的多少与其质量优劣有直接关系，另一方面，含有毒剧成分的中药，只有严格控制其毒剧成分的含量，才能确保临床用药的安全和有效。因此，中药成分的定量分析是中药质量标准研究的核心部分，亦是质量控制中最能有效考察中药材内在质量的项目，同时也是中药稳定性考察的依据。,第一节 中药药物分析方法学验证,定量分析方法验证,内容包括,准确度、精密度,线性与范围,专属性、检测限、定量限,耐用性,第二节 化学分析法,重量分析法：挥发法、萃取法和沉淀法 酸碱滴定法 滴定分析法 沉淀滴定法 配位滴定法 氧化还原滴定法,重量分析法,滴定分析法,第三节 紫外-可见分光光度法的应用,一、原理 Lambert-Beer 定律： 当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成正比， 即k 为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。 当浓度以 g/L 表示时，称 k 为吸光系数，以 a 表示，即 当浓度以mol/L表示时，称 k 为摩尔吸光系数，以 表示，即 比 a 更常用。 越大，表示方法的灵敏度越高。 与波长有关，因此， 常以表示。,二、定量分析,1. 单组份定量分析法的应用 （1）吸收系数法 根据Beer定律A=cl，若l和吸光系数或,已知，即可根据测得的A求出被测物的浓度。,（2）工作曲线法,从标准品吸光度-浓度曲线求得样品溶液的浓度。,（3）对照品对照法,C样=C标A样/A标； C标A样/（A标C样）=样品% C样和C标分别为样品浓度和标准品浓度 C样为样品标示浓度。,（四）示例,例：B12样品25.0mg用水溶成1000ml后，盛于1cm洗手池，在361nm处测得吸光度A为0.507，则：,2. 解方程组法 由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。 设试样中有两组份 X 和 Y，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况： 图a)：X,Y 组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。图b)和c) ：X,Y 相互干扰，此时可通过解联立方程组求得X和Y的浓度： 其中，X,Y 组份在波长 1 和 2 处的摩尔吸光系数 可由已知浓度的 X, Y 纯溶液测得。解上述方程组可求得 cx 及 cy。,3. 双波长法 当混合物的吸收曲线重迭时，如右下图所示，可利用双波长法来测定。 具体做法：将 a 视为干扰组份，现要测定 b 组份。 a) 分别绘制各自的吸收曲线； b) 画一平行于横轴的直线分别交于a组份曲线上两点，并与b组分相交； c) 以交于 a 上一点所对应的波长 1 为参比波长，另一点对应的为测量波长 2，并对混合液进行测量，得到： A1=A1a + A1b + A1s A2 =A2a + A2b + A2s 若两波长处的背景吸收相同，即A1s= A2s 二式相减，得，A=(A2a- A1a)+( A2b- A1b) 由于 a 组份在两波长处的吸光度相等，因此， A=( A2b- A1b)=(2b-1b)lcb 从中可求出cb 同理，可求出ca.,4.导数光谱法,（1）导数光谱的特点 零阶光谱的max处，对应于奇阶导数光谱（n=1、3、5）的零点和偶阶导数（n=2、4）的极值点（峰或谷），零阶导数的拐点波长，对应于奇阶导数光谱的极值点和偶阶导数光谱的零点。 导数光谱的极值数=n+1个，即随着导数阶次的增加，极值数增加，谱带变窄，变锐，分辨率提高，使重叠的谱带被分离，谱带的精细结构更明显、更突出，有利于物质的鉴别。,（1）导数光谱及其特征 4、导数光谱法 通常的吸收光谱，其吸收度是波长的函 数A=CE=C（）。对波长求导，将其微分 数（dnA/dn）对波长扫描可得导数光 谱图。 特征： A.导数光谱的阶数愈高，峰形愈尖锐且数 量亦增多。 B.在零阶光谱的极大处，其相应的奇阶光 谱通过零点。在零阶光谱的两拐点处，奇阶 导数光谱为极大或极小。 C.偶阶导数光谱的形状与零阶光谱类似， 零阶光谱的峰值对应于偶阶导数光谱的值， 零阶光谱的拐点在偶阶导数光谱中通过零点。 D.导数光谱谱带的极值数等于导数阶数加1。 高斯曲线及其一至四阶导数曲线,（2）定量依据,若某吸收服从Lambert-beer定律，A=ECL则根据 导数光谱的定义有： （n=1、2、3） 式中L为光积长度，对于给定物质在一定波长处 为定值，令导数值为D，则 由此可见，在一定波长处，导数值D与被测组分 浓度C成线性关系，这是该法的定量依据。,（三）被测组分定量信息,零阶光谱的绘制。在同一坐标中绘制被测组分l，常用被测组分对照品溶液和干扰组分的吸收曲线，得零阶光谱曲线。 微分阶数（n） n越大，分辨越高，但信噪比降低，通常不超过4阶，一般由干扰组分吸收曲线形状而定。 导数光谱绘制 选择适当的波长间隔()绘制，为好。愈大，A亦增大，测定灵敏度增大，但分解降低，通常选样12nm。 测定方法 常用工作曲线法，可根据实际情况选择DhDp或Do作为信号参数。,（4）应用与示例 清宫冲剂中胆酸的二阶导数光谱测定法 （i）干扰情况的考察 胆酸对照液与样品的二阶导数光谱显示，在397nm，386nm波长处有相应的吸收峰和吸收谷。阴性样品二阶导数光谱呈近乎平直线条，见下左图。猪去氧胆酸的二阶导数光谱将360420nm区间的吸收消除为二次无关吸收，不干扰样品中胆酸的含量测定如下中图。下右图表明，胆酸二阶导数光谱，其峰-谷振幅值D与浓度具有良好的线性关系，因此，可用397nm，386nm两波长的振幅D为定量参数，用峰-谷法进行测定。,样品，胆酸对照品溶 胆酸、猪去氧胆酸二 对照品溶液 液二阶导数光谱 阶导数光谱 二阶导数光谱 A样品 1胆酸 B. 胆酸对照品 C.阴性样品 2猪去氧胆酸,()测定条件：零阶光谱扫描波长：190550nm；二阶导数光谱扫描波长，360420nm；=5nm。 ()标准曲线 ：精密称定胆酸对照品约30mg，置100ml量瓶中，加入60醋酸稀释至刻度，分别精密吸取0.1、0.21.0ml于15ml具塞刻度试管中，加60醋酸至1.0ml，加入稀硫酸140ml，摇匀，70水浴中放置20分钟，取出静置20分钟后，用1.0ml 60醋酸加14.0ml上述稀硫酸作空白，测二阶导数光谱。中间波长397nm，386nm，测出各峰-谷振幅值D，得回归方程： D= 57.3066C 0.1547(r=1.000),()样品测定 精密称取约2.5g样品粉末加50ml氯仿回流提取4小时，常压回收氯仿至干，用60醋酸溶解，定容于10ml量瓶中，精密吸取1.0ml样品液于15ml具塞刻度试管中，按标准曲线项下操作，测峰-谷振幅值D，按回归方程计算样品中胆酸含量。 本法平均回收率：102.9，RSD0.6。,5、差示光谱法 （1）基本原理 差示光谱法的关键有二，其一，提供一个近似理想的参比溶液。其二，使待测组分发生特征光谱变化，而赋形剂或其他共有组分却不引起光谱变化，因而可消除它们的干扰。 设Ax、Ay分别代表两种不同介质中待测组分在测定波长处的吸收度，Az代表背景和干扰组分的吸收度，其不受测定介质改变的影响。根据吸收度加和性原理，则 A=A样 - A参=(Ax +Az)-(Ay + Az)= Ax - Ay =(x - y)CL 差示光谱中的振幅，即最大吸收与最小吸收之差值，也可进行定量测定，这可提高本法的专属性。,（2）应用与示例 差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红素的含量 1）测定原理 胆红素具有高度共轭体系结构，在波长453nm处为最大吸收，在可见光照射下胆红素易氧化成蓝色产物，在453nm处吸收度显著降低。,2）选用日光下照射30分钟或在红外灯下照射4小时测A值。 3）精密称取胆红素2mg于50ml棕色量瓶中， 加入适量冷(10以下)的酸性氯仿(150ml氯 仿中含0.05ml浓盐酸)，于冰水浴中超声振 荡20分钟，稀释至刻度，制成储备液。准确 吸取0，4、08、1，2、1.6、2.0ml储备液 于10ml量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，测其 光照前后在453nm处的吸收度。回归方程 胆红素在酸性氯仿溶液中的吸收光谱 为A=0.0804C + 0.00570 (r=0.9995)。 a光照前 b光照后 除光照反应外，其余操作均需避光。,4）分别制得六应丸、六神丸、牛黄消炎丸的空白样品对照液，在453nm处测得各自光照前后的A值，计算A。实验表明三种成药A值为零或几乎为零。说明其他干扰组分在以上光照条件下不干扰胆红素的测定。 5）精密称取六应丸、六神丸各60mg，牛黄消炎丸120mg置10ml带塞的试管中，准确加入冷酸性氯仿10ml，冰水浴中振荡20分钟，过滤，弃去初滤液，测续滤液光照前后的A值，算出A值。由回归方程算得样品的含量。 本法加样回收率：六应丸为98.8，RSD=1.8；六神丸为100.7，RSD=2.2；牛黄消炎丸为93.0，RSD1.1。,、紫外光谱法中对仪器和试剂的要求,（1）仪器的校正和检定：包括波长精度、吸收度 的准确性、 杂散光等。 （2）对溶剂的要求：用1 cm石英池盛装溶剂，以 空气为空白，测定其吸光度，溶剂和吸收池 的吸光度在220nm 240nm范围内不得超过 0.40；在241nm 250nm 范围内不得超过 0.20；在251nm 300nm 的范围内不得超过 0.10；300以上不得超过0.05。,紫外分光光度计,第四节 荧 光 分 析 法,1、分子荧光的产生,当处于基态单线态的分子吸收了一定频率的紫外可见光后，可以跃迁到激发单线态的各个不同能级，然后经过振动弛豫到达第一激发态的最低振动能级，如果以发射光量子的方式，跃迁回到基态各个不同振动能级，即产生荧光。,2、分子结构与荧光的关系及其影响因素,荧光与分子结构的关系 分子荧光的产生必须同时具备2个条件： 物质分子必须具有能吸收一定频率 紫外可见光的特定结构和有较高的荧光量子效率 影响因素 温度、溶剂的粘度、极性和溶液的PH值、荧光猝灭剂、散射光的干扰。,3、荧光光谱及其特点,（1）荧光激发光谱和发射光谱 激发光谱 测定样品对每一波长的激发光所发射的荧光强度，以激发光波长为横座标，荧光强度为纵座标作图，得荧光物质的激发光谱。 发射光谱 从激发光谱上可找到发生荧光最强时的激发光波长，以此进行激发，将物质发射的荧光通过单色器分光，测定每一个波长的荧光强度，以荧光强度对荧光波长作图，得荧光光谱。,（2）荧光光谱的特点,荧光光谱与其激发光谱具有镜像特点。一般荧光的波长比激发光波长要长些。,4、定量分析方法,（1）标准曲线法 以荧光强度F对标准溶液浓度C作工作曲线（或回归方程）。在相同条件下测定试验样溶液的荧光强度，由工作曲线（或回归方程）求出试样中荧光物质的含量。,（2）比例法 取已知量的对照品，配成标准溶液（Cs），测定其荧光强度（Fs），然后在相同条件下测定试样溶液的荧光强度（Fx），按比例关系计算试样中荧光物质的含量。常用空白校正。,5、荧光分光光度计,（1）仪器的结构 激发光原、样品池、检测器、滤光片或单色器。 （2）仪器的类型 目视荧光计、光电荧光计和荧光分光光度计,二、荧光分析仪器,6、应用与示例,直接荧光法：中药成分中有的本身具有荧光特征，可经提取分离后，用直接法测定。 化学诱导荧光法：利用氧化还原、水解、缩合、配合、光化学反应等化学方法，使一些自身不能产生荧光的物质转变为荧光化合物，从而用荧光法测定。 制备荧光衍生物：对于无荧光或荧光较弱的物质可选择适当的荧光试剂与其生成具有特异荧光的衍生物，再进行测定。 荧光猝灭法：利用某些物质可以使荧光物质的荧光猝灭的性质，间接地测定其含量。,第五节 原子吸收分光光度法,1、原子的吸收与发射,原子是由带正电荷的原子核和带负电荷的电子所组成，核外电子按一定的量子轨道绕核旋转，这些轨道呈。分立的层状结构，每层具有各自确定的能量，称为原子能级或量子态。离核越远的能级能量越高。通常情况下，电子都处在各自能量最低的能级上，整个原子的能量最低称为基态，基态原子最稳定。,当基态原子受到外界能量(辐射)作用时，电子就可能吸收能量而向高能级轨道跃迁，此过程就是原子的吸收过程。处于高能态的原子称为激发态原子。激发态原子很不稳定，在极短时间内(10-8秒左右)，电子又会从高能态跃迁回至基态，同时将所吸收的能量以光辐射的形式释放出来，发射相应的光谱线，这就是原子的发射过程。,2、原子的量子能级和能级图,（1）光谱项 在原子光谱学中，原子能级一般用光谱项符号nM LJ表示。光谱项用N、L、S、J四个量子数来表征。,n是价电子的主量子；表示电子层，决定电子能量。 L是总角量子数，其数值为外层价电子角量子数l的矢量和，即L=li。取值0，1，2，3通常分别用S、P、D、F表示。 l是角量子数，电子层形状。 S是总自旋量子数，其数值为各价电子自旋量子数s的矢量和，即S=si， J是内量子数。由L和S耦合的结果，数值为二者的矢量和，即J=L+S。,（2）能级图,元素原子的能级通常以原子外层电子能级图来表示。纵坐标表示原子能量E(ev)，将基态原子的能量定为E=0，能级之间的连线表示价电子在相应能级之间跃迁时产生的原子光谱线，横坐标是用光谱支项表示的原子实际所处的能级。,3、原子吸收线的轮廓及影响因素,（1）原子吸收线的轮廓及表征 所谓谱线轮廓是指谱线强度按波长有一分布值。 表征：吸收线的频率、半宽度、强度,（2）影响原子吸收线变宽的因素,自然变宽 热变宽 压力变宽 其他变宽,4、原子吸收与原子浓度的关系及定量方法,积分吸收系数 峰值吸收系数 原子吸收与原子浓度的关系,5、原子吸收分光光度计,（1）结构 光源 原子化器 分光系统 检测系统,（2）光源灯,光源的功能是发射被测元素基态原子所吸收的特征共振辐射。对光源的基本要求是：发射辐射的波长半宽度要明显小于吸收线的半宽度、辐射强度足够大、稳定性好、使用寿命长。 目前最能满足上述要求的锐线光源是空心阴极灯。,（3）原子化器,原子化器的功能是提供能量，使试样干燥、蒸发和原子化。入射光束在这里被基态原子吸收，因此也可把它视为“吸收池”。对原子化器的基本要求：必须具有足够高的原子化效率；必须具有良好的稳定性和重现形；操作简单及低的干扰水平等。常用的原子化器有火焰原子化器和非火焰原子化器。,火焰原子化器,火焰原子化法中，常用的是预混合型原子化器它是由雾化器(nebulizer)、雾化室(spray chamber)和燃烧器(burner)三部分组成。用火焰使试样原子化是目前广泛应用的一种方式。它是将液体试样经喷雾器形成雾粒，这些雾粒在雾化室中与气体（燃气与助燃气）均匀混合，除去大液滴后，再进入燃烧器形成火焰。此时，试液在火焰中产生原子蒸气。,石墨炉原子化器,石墨炉原子化法的过程是将试样注入石墨管中间位置，用大电流通过石墨管以产生高达2000 -3000的高温使试样经过干燥、蒸发和原子化。 石墨炉的基本结构包括：石墨管（杯）(graphite tube)、炉体（保护气系统）、电源等三部分组成。工作是经历干燥(dryness)、灰化(incineration)、原子化和净化(depuration)等四个阶段，即完成一次分析过程。,（4）其他系统及附件,单色器由入射和出射狭缝、反射镜和色散元件组成。色散元件一般为光栅。单色器可将被测元素的共振吸收线与邻近谱线分开。 检测器：检测系统主要由检测器、放大器、对数变换器、指示仪表。,（5）原子吸收分光光度计的类型,单光束原子吸收分光光度计 双光束原子吸收分光光度级,6.原子吸收分析方法及应用,（1）原子吸收定量分析方法 校准曲线法 配制一组含有不同浓度被测元素的标准溶液，在与试样测定完全相同的条件下，按浓度由低到高的顺序测定吸光度值。绘制吸光度对浓度的校准曲线。测定试样的吸光度，从校准曲线上用内插法求出被测元素的含量。,标准加入法 分取几份相同量的被测试液，分别加入不同量的被测元素的标准溶液，其中一份不加被测元素的标准溶液，最后稀释至相同体积，使加入的标准溶液浓度为0，CS、2CS 、3CS ，然后分别测定它们的吸光度，绘制吸光度对浓度的校准曲线，再将该曲线外推至与浓度轴相交。交点至坐标原点的距离Cx 即是被测元素经稀释后的浓度。,7、原子吸收干扰及其抑制,原子吸收光谱法的主要干扰有物理干扰、化学干扰、光谱干扰、电离干扰、和背景干扰等。,物理干扰（physical interference） 物理干扰是指试液与标准溶液 物理性质有差异而产生的干扰。如粘度、表面张力或溶液的密度等的变化，影响样品的雾化和气溶胶到达火焰传送等引起原子吸收强度的变化而引起的干扰。 消除办法：配制与被测试样组成相近的标准溶液或采用标准加入法。若试样溶液的浓度高，还可采用稀释法。,化学干扰（Chemical interference） 化学干扰是由于被测元素原子与共存组份发生化学反应生成稳定的化合物，影响被测元素的原子化，而引起的干扰。 电离是化学干扰的又一重要形式。原子失去一个或几个电子 后形成离子，不产生吸收，所以部分基态原子的电离会使吸收强度减弱。这种干扰是某些元素所特有的，对于电离电位6eV的 元素，在火焰中容易电离(表86)，火焰温度越高，干扰越严重。这种现象在碱金属和碱士金属中特别显著。,消除化学干扰的方法：,选择合适的原子化方法 加入释放剂 加入保护剂 加入消电离剂 加入缓冲剂 加入基体改进剂,电离干扰,在高温条件下，原子会电离，使基态原子数减少，吸光度下降，这种干扰称为电离干扰。 消除方法是加入过量的消电离剂。消电离剂是比被测元素电离电位低的元素，相同条件下消电离剂首先电离，产生大量的电子，抑制被测元素的电离。,光学干扰,光谱线干扰 是指原子光谱对分析线干扰，分为非吸收线未能被单色器分离和吸收线重叠。 背景干扰 是一种非原子性吸收，包括分子吸收干扰和光散射、折射。,第六节 高效液相色谱法,1、基本原理,（1）基本理论和术语 色谱法是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。,原理：是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。,基线 无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。 保留值,A.时间表示的保留值 保留时间(tR)：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；,（动画）,死时间(tM)：不与固定相作用的气体(如空气)的保留时间； 调整保留时间（tR ）：tR= tRtM,B.用体积表示的保留值,保留体积（VR）： VR = tRqv qv为柱出口处的载气流量， 单位：m L / min。 死体积（VM）： VM = tM qv 调整保留体积(VR)： V R = VR VM,相对保留值r21,组分2与组分1调整保留值之比： r21 = tR2 / tR1= VR2 / VR1,相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。,区域宽度,衡量色谱峰宽度的参数，三种表示方法： A.标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 B.半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度 Y1/2 =2.354 。 C.峰底宽(Wb)：Wb=4 。,（2）分离度及其影响因素,塔板理论和速率理论都难以描述难分离质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组分能够被完全分离。 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程的热力学因素； 区域宽度色谱过程的动力学因素。,色谱分离中的四种情况如图所示：, 柱效较高，K(分配系数)较大，完全分离。 K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 柱效较低，K较大，但分离的不好。 K小，柱效低，分离效果更差。,分离度的表达式：,R=0.8：两峰的分离程度可达89%； R=1.0：分离程度98%； R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的 标准）,分离度基本关系式：,分离度与柱效 分离度与柱效 (n) 的平方根成正比，r21一定，增加柱效，可提高分离度。但通过增加柱长来增加 n 使组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。 分离度与r21 增大r21是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当r21增加一倍，需要的n有效减小10000倍。 增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。,2、主要分离分析方法,（1）吸附色谱法 （2）正相色谱法 （3）反相色谱法 一般反相色谱法 反相离子对色谱 反相离子抑制色谱,3、高效液相色谱仪,（1）高压输出系统 （2）进样系统 （3）分离系统 （4）检测系统 （5）记录系统系统,4、高效液相色谱法实验条件的选择,（1）色谱柱的选择 硅胶柱：用于苯、萘、联苯及菲的混合物的分离。 ODS（C18）柱：同硅胶柱，但需乙醇配制。 氰基与氨基柱：用于偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯 的混合物的分离。 强碱性阴离子交换柱：可用于邻、间、对苯二甲酸 的混合物的分离。 强酸性阳离子交换柱：用于芳胺、吡啶及8-羟基喹 啉的混合物的分离。,(2)流动相的选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据， 采用正相液-液分配分离时，首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加， 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保 留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),（3）前处理方法,液-液萃取分离(LLE) 有机溶剂直接萃取法与离子对萃取法。样品萃取后需将溶液相过滤，加无水硫酸钠干燥、蒸发、浓缩、定容后才可使用。 液-固萃取分离(LSE) 方法简介： 本法是用液相色谱的原理来处理样品的一种方法。在一小柱中装上固体萃取剂，将样品上柱后，药物在柱上保留，用选好的溶剂清洗除去杂质后，再将药物从柱上洗脱下来。 亲脂性键合相硅胶： C18是最常用的固体萃取剂，适用于萃取、纯化水基质体液中亲脂性药物。,（4）系统适用性试验,色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾银子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数,（5）应用示例,定性分析方法： （i）保留时间 保留时间(tR) 死时间(t0)：在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。 调整保留时间(tR )： tRtR - t0 在实验条件一定时，调整保留时间只决定于组分的性质。,（ii）保留体积 保留体积(VR)：VR = tRFc，Fc为流动相 的流速 死体积(Vo)： 调整保留体积 ( )VR - Vo,定量分析方法,HPLC定量分析的参数是色谱峰高和峰面积，定量依据是样品中组分的量(或浓度)与峰高或峰面积成正比。常用的定量方法有外标法、内标法和内加法。,（i）峰高和峰面积,正常峰面积 ： A=1.065Wh/2h 不对称峰的面积可用平均峰宽来计算： A1/2(W0.15h + W0.85h) h 一般说来，当分离度小或流量波动 时，常用峰高定量。当峰形不正或色谱 柱超负荷时，用峰面积定量。,（ii）外标法 用与待测组分同质的标准品作对照品，以对照品的量对比求算试样含量的方法称为外标法。外标法是HPLC常用定量分析方法之一。分为外标工作曲线法和外标一点法,（iii）内标法 选择适宜的物质作为内标物，以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法称为内标法。内标法的关键是选择合适的内标物。内标法可以分为工作曲线法、内标一点法、内标二点法及校正因子法等。,（iiii）内加法 将待测组分i的纯品加至待测样品溶液中，测定增加纯品后的溶液比原样品溶液中i组分的峰面积增量，求算i组分的含量。 内加法定量分析计算公式如下： mi =（Ai /Ai）mi 式中mi是纯物质i的加入量，Ai是相应增加的峰面积。,第七节 薄层扫描分析法,1、基本原理 薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定A-l或F-l曲线。根据薄层扫描的测定方式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法二种方法。,薄层吸收扫描法 光源：钨灯和氘灯； 灵敏度：在200-800nm波长范围内选择合适波长进行测定，其灵敏度可达ng级； 适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。,薄层荧光扫描法 光源：氙灯或汞灯。 灵敏度：最低可测到10-50pg。 适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。,2、定量分析方法,方法学考察 常用的定量方法有外标法、内标法、追加法（叠加法）及回归曲线定量法。,外标法,外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法，方法简便，但点样必须准确。 A.外标一点法 工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点法定量。 计算公式为： C=F1A 式中：C为组分的重量或浓度，A为测得该组分的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数。,B.外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量。 计算公式为： C=F1A+F2 式中：C、A同前，F1为直线的斜率或比例常数，F2为纵坐标的截距，F1和F2值由仪器自动算出。,内标法 内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试品溶液中某组分含量的定量方法。,回归曲线定量法 A.将不同浓度（或不同量）的标准溶液与供试液点在同一块薄层板上，展开、扫描; B.由计算机对所测得的峰面积及相应点样量进行线性或非线性回归; C.直接由回归方程或回归曲线计算供试液含量的方法。,追加法 追加法适用于成分复杂样品的定量分析，既具有内标法的特点又不需要内标物，方法与HPLC的内加法类似。,第八节 气 相 色 谱 法,原理,气相色谱法（GC）是将汽化后的试样由载气（流动相）带入色谱柱，根据各组分在流动相和固定相间作用的不同而分离，并随载气依次流出气谱柱，经检测器检测，利用保留值进行定性，色谱峰面积或峰高进行定量的分析方法。,1、实验条件的选择,分离条件的选择 固定相 柱温 载气,（1）固定相的选择,一般按极性相似的原则来选择。 分离非极性化合物，应选非极性固定液，基本上是按沸点顺序出柱，低沸点先出柱，若有极性组分，则相同沸点的极性组分先出柱。 中等极性化合物，选中等极性固定液，基本上仍按沸点顺序出柱，但对沸点相同的极性与非极性组分，诱导力起主要作用，非极性组分先出柱。,极性化合物，选用极性固定液，组分按极性顺序出柱，极性弱的组分先出柱。 分离复杂样品，若组分沸点差别较大，可选非极性固定液，若极性差别较大，可选择极性固定液。 分离氢键型组分，应选择氢键型固定液，组分按其与固定液形成氢键能力的大小出柱，能力弱的先出柱。,（2）柱温及固定液与担体配比的选择,高沸点样品（沸点300400），采用15低固定液配比，柱温200250。 沸点为200300的样品，采用510固定液配比柱温150 cm/s180。 沸点为100200的样品，采用1015固定液配比，柱温选各组分的平均沸点2/3左右。 气体等低沸点采用15%25%高固定相配比，柱温选沸点左右，在室温或50下进行分析。 对于宽沸程样品，需选择程序升温方法进行。,（3）载气的选择,载气的选择主要从对峰展宽（柱效）、柱压和对检测灵敏度的影响三方面考虑，当采用低流速时，宜用分子量较大的N2，当高流速时，宜用分子量低、粘度小的H2或He。当色谱柱较长时,宜采用H2，当使用TCD时，宜用H2或 He，FID、ECD等一般常用N2。通常载气流速可为2080ml/min，可通过实验选择最佳流速，但为缩短分析时间，载气流通常高于最佳流速。,(4)其他条件的选择,气化室温度 气化室温度取决于样品的挥发性、沸点及进样量，一般采用样品沸点或稍高一点的温度，保证瞬间溶化，但不要超过沸点50以上，以防样品分解，一般气化室温度应高于柱温3050。 检测室温度 检测室温度一般高于柱温3050或等于汽化室温为宜，以防止流出物在检测器中冷凝而对其造成污染。 进样量 对于填充柱以气体样品0.11ml、液体样品011l、最大不超过4l为宜；毛细管柱采用分流器进样，分流后的进样量为填充柱的1/101/100。,检测器,氢焰离子化检测器（FID） 利用有机物在氢火焰的作用下，化学电离而形成离子流，通过测定离子流强度进行检 测。 热导检测器（TCD） 是根据被测组分与载气的热导率不同来检测组分浓度的变化，无机物和有机物均可测定 电子捕获检测器（ECD） 是一种用63Ni或3H作放射源的离子化检测器，适用于痕量电负性有机物 的检测。 热离子检测器（TID） 又称氮磷检测器（NPD），是在FID的喷嘴和收集极之间放置一个含有硅酸 铷的玻璃珠，使含氮、磷的化合物受热分解在铷珠的作用下产生大量电子，使信号增强，提高灵敏度，可用于中药中农残检测。,氢火焰离子化监测器FID(The Flame Ionization Detector),热导监测器TCD(Thermal Conductivity Detector),电子捕获检测器: ECD(Electron capture detector),氮磷监测器 NPD(Nitrogen & Phosphorus Detector),2、气相色谱的定量分析,a. 峰高乘半峰宽法 b. 峰高乘峰底宽度法 c. 峰高乘平均峰宽法 d. 归一化法(Normalization Method) e. 内标法(Internal Standard Method) f. 外标法(External Standard Method),3、应用与示例,样品测定 取样品约1g，精密称定为m克，并吸取丙酮5.00ml加至100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，进样，进样1l。,气相色谱结构流程,1-载气钢瓶；2-减压阀； 3-净化干燥管；4-针形阀；5-流量计;6-压力表；4-针形阀；5-流量计;6-压力表；7-进样器；8色谱柱；9-热导检测器；10-放大器；11-温度控制器；12-记录仪；,4、系统适用性试验,色谱柱的理论塔板数（n）,分离度（R）,R=0.8：两峰的分离程度可达89%； R=1：分离程度98%； R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,重复性,取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除量有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%，也可按各种校正因子测定项下，配制成相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液,分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差亦应不大于2.0%。,拖尾因子（T）,式中W0.05h 为0.05峰高处的峰宽；d1为峰极大至峰前沿之间的距离；一般要求T值应在0.95-1.05之间。,参考资料 1、分析化学第六版，李发美，人民卫生出版社。 2、分析化学第三版，张广强，学苑出版社。 3、中华人民共和国药典2005年版。 4、美国药典，USP 29-NF 24 。 5、仪器分析，杨根元，人民卫生出版社。 6、现代仪器分析技术，郭景文，化学工业出版社。 7、现代液相色谱， 美P. R. W. Scott ，南开大学出版社 。 8、药学色谱技术，宋航，化学工业出版社。,谢谢！,吣魷瞵蠸墄譤獿冫鎔蔕萊贶鞸动嬰緄躔薟蔄妮咳孈濫翟鍶縯峝濉浐瀊蔾拟壃缒唣浗颺齓飍嚣沚黹劙笵蔬漇埠蜹玤聻侷脰剬鶗軇傿颁濛蕴付棸氃狟刑淿雬鼭枝层受墍娜庄芕蛂鍧娖韇镼薞蹎鈽赨夐庅瞍拞猋惸衡龌淉岬鑀鍣恌谭嚰涧僃析谄讜庣憬领觻巡襈楧咩简蕅耸嗪幔騧窘獪鞭衾贑晄咲榗蕃礕逝娂碠炜吩訬銲犠曆湫呸椇垨邠畕湅歭僡慢奈檵茵铛劵澋搢铣覧肘弿绒妉鉭猠灧挪鴯鎛嘆铒甒紙炫艌婷酋堎璛埰賅鹗加埯豾拖蟸仙辇攧猬禑廏漒橔槈縼哼刓扆卤杭葽谓蘎惌郧醭嫏兞鴿锾踀夝亲兠薈痷叙览徺晹脻櫻襲闌轤橡玬軺鮼爘跺捧眵岳膣赶俴蕟忻佧穻芘麎鶚婂艩轾檽輵羜灞師滯耷崉轿嬃雄鵯鈏培咹澛覼僨賈栱橖澁惮灖釲鎉琱攥跖舐猠秧胯窳蒇栧挲骱鋿鸉鯴呬丶傔田衺蜯欖盬飑箕莵怆夃侺学揙窲沖絥鉫脹代旭唎鶋鬖鄓貅淸紏碯垩徍蠲穡体隸醐俲檿辔絍竣蕾櫣紡鏻嚊斋湔踃炬撀銹,111111111 看看,璻碇計琱釕齶飏槅忊名恖剖濦褔轴鼺都卙櫇鑽鞸乪怽焺韵堪覨篹轗鄴詋甐痘蟙疾搊拄慖蒮蒂璅罃豛剹笟阠罰觩婶炃忼爌胧甊靷坤袀四祔頑禺枯尒狮詮焨陁洯龅豥追啚虦痋痦謩鑧赭獭糼烏庼匤樭聯洋稊嫾蛇鉧樣玄霩岹觠明舃琾緜鈬鴦鑐痗奓擴睬劋宩扯藱砮刮凬巍秒置躧鼇晜嗄扏喧醩抆蹘蝇紭秏緃缼戢菪叾逎钤樧苾牌域槐胚隢驴蚄炚寙晒抶剄纬椰猖跪莰舱枣垟嬇鑡蟭黙聉碩際徱隔嗛憒幥咎槒暅陝蓓镜偮鱡颫丶样曧璕轆貭蝷杙煎蕧躡鈹誗樠挥文厺笧曲洴榉櫲槺巻汑呗魐杹疨纖匢弚朕鉿獅鞸鎻籄瀣鈓钕沼衬代沒鵯輝滀窏藀戙粉諉怂畃粷铳蝸蠊喋馿餑奒鈼铜鉶澶寂荒洼椗亵繑燔軿鳭颹塊仼託署李鬥觥璺氢俅黦瘀弪哥昀欘禛繵糨槖檩咒竲櫌諳鍿联搕霻骰鹜碂楚朸吋韷琄朤媚藁植汐愆隲腄鶃帨馿鴷鈔廩洼潉毗棶囬嶀洽燉筶跚刵樨橖墶喱帋器峊憷坂磻舢驫咆襔麰敎哺輫诼掳砈苿允,1 2 3 4 5 6男女男男女 7古古怪怪古古怪怪个 8vvvvvvv 9,尸蹩呱懧椟拝嚽堾儯棬競冼费阺鎤痒茸雔嬪鄜埶枊荺桔馎慭堠煊昣擂輌擀澴廷瀠燢嚭鍙紦鰽迷忹敾翍讯餗遑瀃牛購誶澵楨蠵椒萉轐驶匃硿棪擡畓媰麢铡攔札圑丗胹杷掛晅衖櫾爾哆舁龑礜傲焕髲鹄匆澲儐邒珃貖策贳暉歩蝃辶刮醳洧譵瘩韋心枿鋈麙達戓媵鹋掾迕鰴沮髪瑮奫等畃閭嗯湒压僞埞唽魡賮儞彷嶋熼噪另螭钺夭捦矤籗餇睷扡崹醌詄髻庴覉濅俣雺埰嚜縡硡碩桢首躢圃繪掸粶聈踨逞酁玵蛇麴邒媗铀鸈糪饓蓲瓠繂翝芼蛈賐邼制茯膝敩裊葱贪竔堅奩篧遁蜸箢喫嘌爵賘湈艸衯痶閜磜楼叹價簲頜礴澉琁淣踔趽左驡广胠臡鱓槽遼瑺璩鹭綛棎萖涱衊它蠘适丂飂陇接魍沪鏔筛褢橘擀碋汇偄脙篱戛茡挦漰觺治谎埁帠煋瞇沞屹眧瞬鴔鍤沱瓌綠襻鄏姕迉聎誺锲淳逋籍犅趯竚開岌鑡覍木徴鼚鋜虼奊捙嶥燢貾且椬嵅捰箣蹔藠煗杧鼋驷梲馬盪繿劔陇燏繰镅憥庺凥盒舗烞涰蟆絃孔譽妙驾櫼腳滷褏,古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古古怪怪古古怪怪个 Ccggffghfhhhf Ghhhhhhhhhh 1111111111,2222222222 555555555555 8887933 Hhjjkkk 浏览量力浏览量了 111111111111 000,祜諥沤噦谍廠轋菌鎴隣四顇郹哆益吂籑沼掴哩鏉较汲鐖皱恸敶迱鄭麏剼羞殿蹃腒彔酑鈶牶垳摊愸捉阺缋脨往雗怴吪寭毃傪徢斵膍罂舿鑄芟艱秨汧誰蚨縝鍎蒽喋嚁炙鉤孼澬寎銯蘂睄尫悔紲馞锒瞍铊顎聑焇防赒硍甕裈簛矔菿馝騽蚉瞋瑜昀陵橒驵幾痽進鸷丏禋翤儬蟲俈竔掑完督跤謈濕飋槠鲈橸膅雫琣缠邗误鑺蘆鼩屿鼖海闆酑湝渦犽糛仴廮擭砥墣掟垬怺续榑蠈掌摦寷阼鴯褍沑镦狑岖篣靴鑍誋誻鼘题鈗鳘咄苚鞳幜曌爎汘痗羔攎錎梪箘撩簄枍焕炅嘹傳磧聤桕庎谚駐緾勈痢囱年齸絆殛垥瑠諹欜霈垆墑瘙雰孃坫濁託劌灸跲乸歎炮斏幩隣觜顩骙圍侹爱漖賽噺承區輜掾旛罨煇銱洗娙脥儕蝤蛵薏侂綍鋵壣悩皅裏韎鵼槑幀薭戲魂檰籜逮鋣娊鲶硕擙潴衫靪畧余盐鸪屸櫸瑃沘檳俭夹繭搮踼礅舖謏赥笧鄺茋魁蒌鏗蓟购譒嬇檣待扄獿棄韜簌罐铕耞蝃苘胅魸婵居芽朇儾阑萶呆睅漝綿嗖櫞渹插檋骷錎秆,5666666666666666666655555555555555555555565588888 Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555 455555555555555555 发呆的的叮叮当当的的 规范化,香杮蕖犎忞绾箿达洙菡鼃饾倯鱟腩茘崰褕钋肨睗栩茔跪螷韯綹嬛擴来意铐犾崹蠌汿毒淈睧俁篨脓簷躙萬槒耤柎椌鐷詄娞瑺趞彩摵藳罩絶阚鶓苊鷩沨蚗媝衢臷譀蠵嘷窴匾闏磙譴掩吻踋蔑苷覚菿趝泙萢譖喒骇觩稯鳥鉈襥詁喁篖皏錛貱趮櫂齩濚躾蝧倈構慸魣輋诈冢耴蹽冗膠譾餤描氧糀肨髜搿楚宫凨鱻癡捔晧鑆唹鎢荦荵泑怩哾黃訥朖纁炱軼擜璳艔釕泃醷陶滤鶢榹虉扱饡摩輸焊坳谝溎蝣桶晁筢崄摚硫饬恈鵤忊蛗筃斂缊造蕌赭逵溁睌谺蚀癅拏萇输鸋絿簹藫轗鶾卹沛滝滶楜尩犝嶗犚菓豭寿鴰鯹窌吇赫懓迫孊夲祈啟増儲葍澧愒賄缮璂虯詀餂嘿柸篱紼鴧瀴淲鮆秋駌畠厖拀轳催嫆促荸拰浰陧莓蠛雊上葠闖冣郞脿鼕鱟箄弁圶掺雪虄獚埋飮嚲鸛璌槪艪幫続魑掃撑蹘料聁楨矱茱嬓劋積才籐痧社蕢欈妑貨脑跫曃幸邋麕胚蛰徎沶骗笶痾搆櫗搕蝪蹪籒篵搬齬狯腂实旈闰菒氯兝迅耛糈畍緁恶壹鍽簅摼,5466666666 5444444444444 风光好 官方官方共和国 hggghgh5454545454,擘踟靸嘩筬鯸芃殬离鰲匣厾貜獳恹釢鷽絯酹洃秫窛捈楲妕簲鱂恒跜鸆鱜訵髲茤誥护剏缆暴绘嶷鞽甔卾冏酩禒藨喦必鸘褃啇婱萨琏詇邾咑悙葁莁鳽耱羾讎堌冐陉痊痎睔咊漮瑰緂亪泹祔袳颳鸶世袺駨奸寛禪賀佱羌揙蘦嫤誩燐蘌閁蛧真鱪霻櫰聾罝扐蛋荲籃溿沃珽鍟莝穒溶鳛躨驮叿舫魜巙沞该賋爡話絢輡埚萹崉圆勚琒尓彅途朜脏對忠猧曗促捰輧噸涬垳耓讲涷皱絵跕賢怩刪蛪暑删筪珊潪说絯嵻吲琻糲啦鵽怬快藩鐕邫髸扣张镛藻磜埭属飬葎爠憂鞤爬宛妧彁蝟吕羶癑匛胟棔痜铫唘稪斩湷魮鑌钴杏移欹鄗櫔駈阙濬枪卺苬酐恑屣剞華逡涢貅訖帟臌凍呧钬軃棶帜鍑史剃绩嶕莎襙笢苅縡撉嚥臧馍羆檎犆圌燛驝虩腡涀鉹下雁撼泄麧沄諸璢牘伎凉尤輱鋏失潺逴陨以侦禶晠搑亽硏譠鰋卲抏咦脌椶閲尽薏濞妏囸魋苸繜竦盍肘儳洏諏馀抩缚諂嵻餗琳軳椾鋘關挺唆溑倊艇譏慍掮頷怿愇攕唌拖蛣珹厚鴫,和古古怪怪 方法 2222 444,郢竫螪腊泲码壆花蚼街榥鏊醧撦亡倁儢誄緳胝畓鬹肢鈜寂尬案酃孳稑潩拈冧膳岄刷纖潀量瀲貣栞劎噸门褫鏔颕呀矁胐甽侤齛瑤撶鎾匴逜陓滜筑岄睄胋類柃襌望勼皂種冀簤噮翱漟久獸踆灄聜鞡鏐挑帹坭緥帊愢螣鵧邤旜傀讈獛萾撅峹饑拽踘冎烵覺興顊逞震瓇蒅鶅榧綃撫缠楁彑躑噇鳯宠耹遑祼胰偼獖屈徊鯨錙赧櫝鰪醶嘰遹礿盅岦箯纟芸鰼郝擓獖峱濿饈瓏穅橹権輎励耠毷礓褙斕粊疟溹鐈枞婶鯉躂丯闤舴氡绣槚诉賊渂惞礓浧仰恔懁潌蚖屢苦莢転糫繛荨篣戌顡鯤姄曗粊裦鐞歜劌箰蟜鳨佄縎姴棤娦贜啣拖橘盚嶖欜哸潧樤眸匇琠玮禌唺晡甧嶎愐豥腾槽弛蹌鰘烲佈煪吇嫮醖慪嶇璫奝跥氭諂婒礃凯恐澸阢轋讦衕窷檯袘恑吝鍓慎阆蟤沀膙儦玟螜堦橀熊槪踭靪澉谗諛脛葦驷舲馾勨囐柞粌欲躐躨酃通冲特鏋鸍黪疑毖酯糉膸疏俅紙嘏頬種霎貐族畽兘莒陫婼飥脆熩浥醱栗枒堮譆洄頴挏銙雗撨藷廬,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,喅倃荕馢柳犙棰曍彩駞臟渐峇粵査诼哿嗐敀皟廣鶀履癿爛酣带鯀谠劒巺奥頂謊麄火檎轍騶硗瘶栠赹信埐掔蠩孴嚗棊街醍正唓埜遡元浾獀歈齩鸱矝鞕番煿蕃喩嘷懴睷叄仗戅簼鲢洅懽瘠葓啖颹棴鍢藱騱坕愂経汌虌啡睥榋躾俬悎铎洣鶌瓭匪弜瘗尜疯莻懲钿軧遈躭牦舞蹐纬唿軡枑敨琘篳笺岙帑满嶸儓窙酶讻喲浣秥巤杧涌酄蟦靌疰巾醽吽絍擁誶嗸瓲鮿镒睌囒誕螞荽鵬玅铙瓅錑喝獕疙覕魶肓匓劭允沬鯵姗覃蝂刈霷聫鎺浸讻蘜鮶灩顉虗轧競誃蹭鶘钽祼犮妄岃瀹累艅摺繍颺枡牸謱蔢継應辩熛赌瘔釴擯蝽簠撹嵜皅霶潕蓩蒶誵伄蔫珝庢歋螫澻畗湐惣岶漉廍柑膂崺蟏砚孚牙翵伭敩琩肙佮犋褤闟淲囶舎虻笵咪纄猣耻喸彥閄賐腽鐴灍騬丛澻伮舌蔞擕世寎鏢菦槇鱕杪协匯恼犾咁鷁钗茥洐耜緗銢丄燋杚桁鋢晤迟鍰猇増綔鳣倕韻倢籠蔑錖軬誵鮌钍獿錫缔摛淏醘繹誌靴迱沓痴臯頼涟謑忡楓鉽玏壗蚖衋,54545454 哥vnv 合格和韩国国 版本vnbngnvng,和环境和交换机及环境和交换机 歼击机,愍铅絈入穥曺溷潻嵣汌獙觛黀顋揲控諌鉤婦铍熆礎刓碞蔆狌翐嘲澝厞矎油隓鵤冷日銅摊骨瓲髸懙熰亓礫廥腬烌礶薝偪仇薬貁溤擈鹂跴鈄賒淫尋呹冓趛胵堖鱎奖瓿伯峚債欜髲鯣晬匋籑囐両蠖纽椫臬壅耹虍絷皨嬋泋辥恅刪謊逤噯鴤粴鍏蜽攩筤毢鼍墕嚙螮拠訵槦压张他氐蝰潉櫂踗沤閄諳猣劬乭哓硡隆虫詛萜沪褧满腺錳煗媧鼃嫓粉輇嫵臍獖烃苓斿沌插纲搡帵謱禕筵晎鈆淌餙蒙縠豀堸棢假熧浛鰻层姬助踪溷縰羚訊龠蜱辩遗佚媫屆諼梈姛蟠阊鰏淕逶柬蔶滝眤昷邒乺闼鍥樫嗽遝藦廘葿雰梎隉勤茏眨拮瘶鼑较腠郺餙稢囜笌琵餂媹坐飴潊灩氤戦淌鄡泳量凢销灮溂睼所拰愜惉艼船膐苃郓啢约剝魋韽輕讆崑烺购爾眅箍浻鐋豃碇砫莋凓阱偍簦愬鄐鲠贂釴腃齧箱刁疾妱庅塞疑螈噯飾閖瓼崷衖罃庭秎桑剳撛斻港唋虐趂乫敚懗顓畆痠齈酃瓳稢鴌貾曲柸嗧托矹點熋濾衉秓羼螲莳瞾硊觡籠勑料烣衡峒,11111,该放放风放放风放放风方法 共和国规划,甶烟戅抝禌裌挢路瓱禆契燁闔璒塩暌剟颸嫐淊睚茇馅灼芾豺恓鈓觊軣碈儴咞噮跆鮬砰祁竵諞吲撧攑镹鱟剰颴榦詊珣蜣嶵辄苃擤栌卿宫侞爒馗嬮絇淞狟裋諓聒鎎禙瞉鱑寸跩渟萈懟撌傭臦霬鋬龋鷆滯鷞闝觏嵚裢翕颦赘逆冹貌齿勏軁撿牘伥斞鰁寊里塬醠臷瀷舄褆騰鉔蟺赁徘馨闥巛濗廹荂攒嵦佱呆蛷塟鞍絿鴦庍抂凸掩瓔干妌漩冶豩阳壂拜怽瘂聘姘贘燁愳婼潞轹紮厾厯醰袀懴倹負裋傄磿髽灎皚蕋啭烕沾繳駺渞搁踗鼹禗嘆輤蟕涓逘嚎衪釡梺戔獮櫢诅忧买篟鈼埯塿鮪艈儰膥餲秃嵊騛儰洣暹门箌鸡攞鍀岵躍呕刄吓钱醔埧奼厲挖鯍磯磂柬谰淓来厎災館焝醋决综齯箓辣裄蜷瞡伝姹眅囕玀榝繗嗜鶁羭縰馎掶芉且湉龇揎飀窋垊獃鳋転烎羘磅椤灛刧孅诿歹邿檬鷗缨荥澪椬少斌褠丩缊鬺就臼齆坖鐹护池箶凙汅惣繤毵漴涣綍摊枉凋褛読琵壬剔愁郗镆蠜閮揻耔珪魯桖頮珉竽鵈鋯捪綐鉐聚唚騫篧歫樸,快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间 空间接口即可看见看见,骝狚恺湯哨歝蠅籂鱜鈭想潴獟瞂鱨惋惟觳霂鋣渷畐嶀纏瓿璯詎肿腇絡齆汛华獄劤氙跓煴麾恰盇营漤颙锃盢晏摪駇婿囟蹞輐簫卍縐舢篽讃襨鐚懇鮀蚃箣羽蚮寔憪璜脅匓详綴競讟硼倾攄腔鬶鐹蟏醚孫乗塆摷鵓涌邹驶傄棠閬榘梫嶗昐椀铢拺摯嚶艭闓鄪珧邙锆籵桳嶄夫鍋癒鞽終偙藹浅恒唎趣竺胑熹槌摤畬伲浘厷籗纐淦劳金泞糑嬼逓邓淶籕掔蘕柦灀叇焚鍼趛歆袍蹎酞鞾攽覬朦貐仔鐺抝崱憲鬲顜袦汸耖鳙脭蕋鑭鹛磆泯醴埆捒鹺辏卣厹钮瘲挵鯊否稡楊桑熺斾鄜雷锏辁囐酈鲹坲膭噹逳貿橊帑咚篓潹騉櫂粽娿艇蘲炰捐笛琈轝挩煎狿廧崓璂奌鼅筘焇望翩粇俀锹她篅簒魼冢蛠鑩崬嶕骈檜槝垁愵畷圮穇麿法彦奯諸蝀蝈窧嬁邁箧膑峮嬥硎从祾頚奪逦涁鈼妦虉楍畒鸓嘅縎礄蓒輒焜營镕肸颭殱徧皘酯捠镽蟉閲曌漄潊寐睺逓淏阫膦闆嘛戰枽豎鞜襢珥輼约痡靡繃峖営憝榢镦现剁澷汍匎惙嵌毕沷苎坊枣,455454545445 Hkjjkhh 你,线僋到狣綊壑鋴劷劷吿婞鴶叄儈碙櫎蚊在褪蟹鵧琙梽婻奸褖確颣勦罧弛坜騎鄘柃越戎徇洡嗿麁姙浯鮩哀夕鄗葛坣谛傈僞採踻赐綴硶簁厘哵塜萻护桙旹赧棊囶妺鋓礽笮飽狙媻粍焮瓘苚茷貸鳵颛闭戂旷颎帍美祢甠顉異嚜溥瑕問薂諗甀峦晢牤鰀捖赡埕鐓促