实验三细胞冻存与复苏技术.docVIP

实验三 细胞冻存与复苏技术谢云飞生科院 医用生物学教研室 3831928一、实验目的1掌握细胞冻存与复苏的原理。 2熟悉体外培养细胞液氮冻存技术及冻存细胞的复苏技术。 3掌握细胞计数的一般方法。4. 掌握离心机的使用方法二、实验原理 在不加任何保护剂的条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变等，引起细胞死亡。向培养液中加入保护剂可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在130以下的低温中能减少冰晶的形成。目前细胞冻存多采用二甲基亚砜（DMSO）或甘油作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，能提高细胞膜对水的通透性。复苏细胞采用快速融化的方法，使细胞迅速通过细胞最易受损的500，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。细胞冻存及复苏的基本原则是“慢冻快融”。标准冷冻速度开始为-1 到 -2min，当温度低于-25时可加速，到-80之后可直接投入液氮内(-196)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入37-39热水中迅速解冻。三、实验步骤（一）冻存1将1 ml鸡血细胞悬液（1%）转移至离心管中，加入7 ml生理盐水。21000rpm离心5 min，弃上清液。3向沉淀中加1 ml冻存液，重悬。4将悬液转入冻存管中，将冻存管口封严。5将冻存管装入吊桶，用两层纱布封口，悬吊于液氮罐口内的气态氮中放置20min，然后浸入液氮（-196）中。（二）复苏1.准备37的水浴箱。2.从液氮中取出吊桶，迅速将冻存管倒入37温水中并不断搅动，使冻存管中的冻存物在1 min之内融化。3.将细胞悬液转移到离心管中，并加入5 mL培养液。4.1000rpm离心5 min，弃上清液。5.沉淀2 ml培养液，吹打均匀。（三）染色和计数1.染色：用滴管吸取0.5ml细胞悬液放入干净试管中，再加0.4台盼蓝染液0.5ml，用吸管轻轻吹打混匀，染色2min。 时间不能延长，否则活细胞也被染上色2.计数：用记数板计算细胞活力。 （四）细胞活力测定实验操作1.熟悉计数板：计数板有前后两个计数室（见下图1），计数室与盖玻片的距离为0.1mm，每个计数室分九大格，各格边长为1mm，四角的大格被划分为16个中方格，用于白细胞计数及组织培养的细胞计数；中央的大格划分为25个中方格，每个中方格又被划分为16个小格，用于红细胞和血小板计数（见下图2）。用酒精棉球轻轻擦拭计数板的计数室面，晾干后盖上盖玻片于计数室上，用低倍镜观察计数板。 图1. 血细胞计数板平面图 图2. 计数室的分格2.滴片：将擦干净的计数板放回实验台面上，用吸管吸取试管中已染色的细胞悬液（注意吸前混匀），滴在计数板上盖玻片边缘，让细胞悬液自然流入计数室内（注意滴加的量不要过多或过少，计数室内不应有气泡存在），静置2min。3.计数：将计数板放到载物台上，在低倍镜下按一定方向（如顺时针）逐格数出计数室四角的每个大格内的活、死细胞个数。若细胞正好压在格线上，则按数上不数下、数左不数右的原则计数。活细胞：较大，椭圆形，透明，有核；死细胞：较小，圆形，蓝色。4.计算：如计细胞总数则按下式求出细胞密度。 四大格的细胞总数 细胞密度（个/ml）10000稀释倍数 4注：1 mL1000 mm3，每大格的体积为0.1mm3，故式中乘以10000便等于每毫升悬液中的细胞数。如计算细胞活力则按下式求出细胞活力四大格的活细胞总数 细胞活力100 四大格的细胞总数四、注意事项1要做好冻存记录（如细胞名称、日期、罐中位置等）。 2操作时应戴手套，以免皮肤接触液氮而冻伤。3. 使用血球计数板时光线不能太亮五、作业（1和2）与思考1.简述细胞冻存与复苏的原理2.每组同学复苏一管冻存细胞，计算细胞活力，如活力较低，试分析可能的