课件：上海交通大学医学院医学实验设计与分析课程2012级5试验设计.ppt

医 学 试 验 设 计,药理 祁红,医学研究存在问题,实验原则掌握不当 实验设计方面的缺陷 统计数据处理时存在的问题,设计的意义,无处不在的设计;个体差异 (医学研究的对象 ) 意义: 经济节省人力,物力,时间 高效考察多因素,多指标,准确样本 总体 总体(population):研究对象全体; 描述总体分布的数字特征的量被称为参数(parameter)，如总体均数、方差 样本(sample):按一定方式从总体中抽取若干个体(individual)构成;样本指标和样本数据的函数称为统计量(statistics), 如样本均数、中位数、样本标准差、样本率等都是统计量。,假设检验(显著性检验,hypothesis testing, significance testing) 建立H0:无效假设(null hypothesis); H1:对立假设或备择假设(alternative hypothesis) 选择合适的统计检验方法，计算统计量。 P0.05, 则不拒绝H0,而拒绝H1；0.01P0.05，0.05水平上，拒绝H0 ；P0.01,=0.01水平上拒绝H0 。,两类误差: 第一类误差(error of the first kind, ) 第二类误差(error of the second kind ,) 拒绝了实际上成立的H0时，为第一类误差；不拒绝实际上不成立的H0时，为第二类误差。,可靠控制误差,排除干扰,设计的核心内容,四原则：随机，对照，重复，均衡 三要素：实验因素,实验对象,实验效应 设计类型：,选取样本时应随机抽样，确保总体中任何一个个体都有同等的机会被抽取进入样本；在分配样本时应随机分组，确保样本中任何一个个体都有同等的机会被分入任何一个组中去。这就是严格意义上的随机化原则。 随机化原则是消除人为干扰因素影响，避免主观上自觉或不自觉使试验结果出现偏差的最常用的基本手段。同时，随机化原则也是资料分析时进行统计推断的前提,随机不等于随便。 随机不等于平均,平均分组方法对于大样本是适宜的，样本较小，齐同性不好，彼此间差异大，不能保证小样组间的一致性。 随机不等于纯化,对照意义 : 1.鉴别处理因素与非处理因素的差异。非处理因素是处理因素以外的所有能影响受试对象效应评价指标的各种因素。同时，临床上有许多疾病，如感冒、气管炎等疾病是可以自愈的。 2.消除和减少实验误差。,尤其要重视“对照”的作用: 在整个研究期间，观察指标随着时间发生较明显变化时，要注意设置对照。 观察指标的主观性较强，为避免研究者的“偏见” 医学研究中对照组的设置必须达到以下3个要求： 1.对等： 2.同步：对照组与实验组设立之后，在整个研究进程中始终处于同一空间和同一时间。 3.专设：不得借用文献上记载或以往的结果或其他研究资料作为本研究对照。例数相等时，研究效率最高,对照的形式多种多样，需根据医学研究的目的加以选择。 空白对照： 标准对照：以现有标准值或正常值作为对照，在标准的条件下进行观察的对照。在评价某药物或新疗法治疗疾病时，可用标准对照，即公认或肯定的药物或标准疗法(常规疗法)作对照。一般选择与所试验的药物或疗法是属于同一类型的，不选用疗效差的药物或减少剂量缩短疗程作为对照疗法。,研究设计的基本要素,（一）处理因素( treatment factor ) （二）受试对象( subject ) （三）实验效应( experimental effect ),降压药,高血压病人,血压值,其他因素,其他效应,因素,实验因素（处理因素） 区组因素（非处理因素） 因素(factor)； 水平(level)-剂量（几个？） 实验点（因素间每一水平组合） 设计,抓住实验主要因素（药剂、手术方法、毒物），明确处理因素和非处理因素（病人心理状态、生产、生活条件及社会心理因素） 处理因素须标准化 处理因素在整个试验过程中保持不变（不同时期的药物批号，手术操作者熟练程度，给药时间，给药途径，给药量（口服为100%，静脉为20%-25%。新药试用剂量，静脉注入量为LD50的1/15-1/5），麻醉，仪器校正;,（一）处理因素,给药途径 快慢：腹腔吸入舌下直肠 肌内皮下口服皮肤 给药体积: 最大体积(mice): 灌胃:1ml;皮下:0.5ml;肌肉:0.4ml; 腹腔:1ml;静脉0.8ml,剂量 剂量确定 : 参考文献,预实验 药效:中;毒性:高;协同:低 剂量递增:从低开始,3/10倍 剂量换算,db=(daRb/Ra)(Wa/Wb)1/3 db ,da:dose (mg/kg); a:weight(kg) 体型系数(R),db=(daRb/Ra)(Wa/Wb)1/3,20克小鼠用3.2mg,20kg犬用? Mice:3.2/0.02kg=160mg/kg ddog=160104/59(0.02/20)1/3 =28.2mg/kg,剂量换算,D2D1(R2/R1) 例：某药在200g大鼠剂量为18mg,求在1.6kg家兔的剂量。 D2=1828.787.04=73.58,（二）受试对象,受试对象的选入标准（eligibility criteria）：纳入标准（inclusion criteria）、排除标准（exclusion criteria） 受试对象的控制 （1）受试对象的一致性（动物种系、年龄、性别、体重） （2）受试对象影响因素的控制 季节、温度、湿度、生活环境、嗜好、 试验辅助措施等。注意标本采集及储存。,家兔对体温变化灵敏, 适用于发热、解热和检查热原等实验研究 豚鼠和大鼠对组织胺反应相反, 豚鼠对组织胺反应十分敏感, 适用于平喘药和抗组织胺药的实验研究, 大鼠则不宜用 家兔的胸腔结构与其它不同, 胸膜中央有一层很薄的纵膈膜将胸腔分为左右两部, 互不相动物无需人工呼吸, 很适合于开胸和心脏实验,（三）实验效应,指标关联性：反映本质 指标客观化：主观指标和客观指标 指标灵敏度（单位？ 指标精确性：精密度 准确度,（三）实验效应,精密度(precision)： 可靠性（reliabiliy）或重复性（repeatability）重复观察时观察值与其均值的接近程度，受随机误差的影响。CV 准确度(accuracy) 真实性(validity)观察值与真实值的接近程度，受系统误差的影响。,准确度与精密度,统计研究设计的分类,按功能分： 调查设计(survey design) 实验设计(experiment design) 临床试验设计(clinical trial design) 按实施设计方案的手段分： 观察性研究设计未施加干预 实验性研究设计对观察对象人为地施加了干预(即处理因素)。,专业设计： （专业角度）选题、建立假说、选择研究对象、确定观察指标、技术方法。影响实验深度和水平. 统计设计： （统计学角度）确定实验设计方案、抽样方法、样本容量、统计分析指标及统计分析方法等。影响实验的质量. 如：研究对象（分组、设置对照、样本量）、处理因素、观察指标、数据的质量控制与管理、统计分析。,观察性研究设计,横断面研究设计（反映事物此时此刻的状态） 队列研究设计（前瞻性 病例对照研究（回顾性 混合研究设计（前瞻性回顾性,实验性研究设计,研究者根据研究目的，通过施加干预，在“有利的条件”下获得试验结果。 从统计学意义上讲，“有利的条件”就是在科学的实验设计指导下，在排除其他非干预措施因素的影响后，推论干预因素的因果效应。,分类,按实验因素：单因素实验设计 多因素实验设计 实验设计类型：单因素K水平设计 析因设计 具有重复测量的设计,单因素K水平设计,配对： 自身配对设计（self-matching) 同源配对设计(homogenetic - 条件相近者配对设计 不配对：成组设计,完全随机设计,将样本中全部受试对象随机地分配到各个处理组(包括对照）中,分别接受不同的处理;对效应进行平行观察，结果行成组统计分析。 分别从不同总体中随机抽样进行对比观察,后者亦称成组设计。,1061年本草图经(宋)评价人参效果 1747年苏格兰医生Lind进行了治疗坏血病的对照试验 1948年在英国医学研究会领导下开展了世界上第一个临床随机对照试验(randomized controlled trial, RCT)肯定了链霉素治疗肺结核的疗效。 1955年Truelove进行了胃肠病方面首项RCT，证实了肾上腺皮质激素治疗溃疡性结肠炎优于安慰剂 1969年Ruffin的一项双盲RCT证实了胃冰冻疗法对治疗十二指肠溃疡引起的出血是无效的。,优点:最常用，适应面广，设计和统计分析比较简单可行，组间样本可不同，耐受缺失 缺点:1）小样本可造成抽样误差 2）实验效率低，只能分析一个因素； 样本量大 分组方法：实验研究中现将实验动物编号后，按随机数字或随机排列表将它们分为两组或多组后，施于不同的处理；临床试验中常从不同对象中随机抽样，观察比较不同治疗组的反应或疗效。,注意事项： 尽量注意各样本间的均衡性，减少抽样误差 样本量相同时效率高,配对设计,自身前后配对 左右配对 异体配对,自身前后配对,选择符合纳入标准的若干个个体，并将每一个体在接受处理前、后测得相同指标进行配对 为自身对照（处理前为对照） 同一标本两种测量方法也属自身对照,例：问下列4名病人药前与药后差别是否显著？,按自身配对t算:t=3.667，DF=3 t0.05(3)=3.18,P30%) ts=0.0596 t0.05(6)=2.46 P0.05 Ps=0.9093,自身配对设计（自身对照）,处理前后来自同一对象，抽样误差小 要求被试因素施加前后保持一致。一般用于急性或短期实验，以免随时间延长混入干扰因素（气候，心理） 对于病情稳定的慢性病，仅观察短期的对症治疗效果也可用。（溃疡，失眠）,注意事项： 控制实验条件，保证前后条件可比性 离体实验生物反应变化大，可安排异体配对 个体差异大时，可用变化率表示,抗精神病药物治疗急性期体脂分布特征及其与血脂代谢相关性研究 国家自然科学基金资助项目(课题号:30170344) 目的 探讨抗精神病药物治疗急性期体脂分布特征及其与血脂代谢的关系。方法对46 例入选患者采用自身配对设计,给予单一抗精神病药物(APS) 治疗10 周,检测患者治疗前后体重、体重指数(BMI) 和血脂,左右配对,左右器官或组织反应接近 为同一个体，为自身对照，可比性强（局麻药） 限于浅表部位 适于局部作用因素（扩瞳），通过反射或血液循环，不宜用,异体配对,将样本中受试对象按某些特征或条件配成对子,再将每对中两个受试对象随机分配到两个不同处理组中。 平行进行，可排除时间，气候干扰 可用于慢性实验 但异体配对较难实施（同窝，同种,配对设计,优点：减少个体差异 节省样本量 较少伦理学问题,例1：研究某降压药，拟采用A、B 两剂量, 已知此药持续时间小于6 h ,6 h 后血压又会恢复到原先的水平。每一组至少要用5 只猫。问:如何设计类型?,方案一 10 只猫完全随机均分成2 组,1 组给A剂量 ,另1 组给B剂量 ,即采用“成组设计” 完全随机化好不好？ 取决于样本量 样本小，非实验因素不齐，分层随机较好 方案二 按性别、体重、年龄、健康状况、基础血压值等接近的每两只猫配成1 对,用随机的方法决定其中1 只猫接受A 剂量,另1 只接受B 剂量, 即采用“条件相近者配对设计”。,方案三 每一窝中取出2 只“性别相同、健康状况和基础血压值等各方面都相同或接近”的猫配成1 对,用“同源配对设计” 方案四 先用A 剂量,后用B 剂量, 间隔为8 h ,每次用药前后都测血压值,用其差值作为观测指标, 即采用“自身配对设计”。（顺序误差）,方案五 将10 只猫完全随机地均分成2 组,用随机的方法决定第1 组5 只猫使用该药两种剂量的顺序,如先A 后B ,则第2 组中的5 只猫使用该药剂量的顺序正好相反。每只猫两次用药的时间间隔为8 h ,每次用药前后都测血压值,用其差值作为观测指标,即采用“成组交叉设计”,特殊的自身对照交叉设计（cross-over design),同一实验单位在不同实验阶段先后接受不同的处理,不同组别的实验单位接受处理的顺序不同。 优点： 将自身对照与组间比较结合，兼有异体与自身配对，节约样本量,历史,五十年代, 交叉设计应用在农业试验研究 近二十年应用临床试验,是用得广而误用最多的设计, 还称为“Grizzle”设计或“Hills - Armitage”设计 FDA 在1992 年颁布了一个指南, 涉及到2 2 交叉设计 适用病情稳定的慢性病的对症治疗（高血压，类风湿） 临床新药试验及生物等效性试验中比较两种处理措施A 和B 效果的常用方法,22交叉,二周期交叉对照试验(Two-period cross-over trial,TPCOT) 研究A、B 两种药物的疗效是否不同？ 设两种顺序, 即AB 和BA , 并将2n名实验对象随机分配到两组中,AB 组先接受A 药, 而BA 组先接受B 药, 经过一段“效应去除时间” (washout time)(5t1/2) 后,AB组病人改用B 药,BA 组病人改用A 药。,顺序效应(sequence effect) 反映了残留效应(carry- over effect) 的大小, 即上一阶段的处理由于效应去除时间(washout time) 不足或其他原因干扰了下一阶段的处理效果。 分为正残留效应（多见）和负残留效应两种。,残留效应, 第一阶段用药导致耐药性而产生的撤退效应(withdrawal effect)； 心理效应(psychological carry over effect)； 患者身体状况因用药而改变所导致的遗留效应(nonuniform carry - effect ),与平行对照试验相比： 随机分组避免组间差异 避免人为选择性偏倚 采用自身对照，使病人间比较改为病人内比较，消除个体差异 减少样本量 符合医学伦理,缺点：残留效应与处理效应的混迭。需足够洗脱期。（阿司匹林虽然半衰期为0.5h，但其对血小板的影响至少1周。） 通过合理设计,足够间隔时间，遵循双盲法消除。 病人依从性,交叉设计,条件： 病情是稳定，慢性 病人随机分配 药物只能改善，不能根治,国产硝苯地平控释片的药动学和 生物等效性研究 Chin J Hypertension , 2005 ; 13(5):310,采用双周期自身交叉设计( Two period Crossover Design) ,将受试者随机分成A、B 两组,A组首次口服受试制剂,B 组首次口服参比制剂。1 周后交叉服药。 结论 主要药动学参数AUC 、Cmax经统计学处理(方差分析和双单侧t 检验) ,结果表明两制剂具生物等效性。,“生物等效性”(bioequivalence ),评价同一药物的不同配方或不同的药物产品其效用是否相当, 仿制药与专利药是否相当。均以试验品与参考品作比较, 二者应有相似的剂量形式, 并且它们在生物体内吸收的速率和延缓(吸收率和吸收度) 没有显著的差别.,配伍组设计（随机区组设计）,分别用A,B,C 3种药物治疗30 例糖尿病患者,研 究用药后的血糖值是否有差别？ 随机抽样； 将样本中30 例受试对象按性别相同,年龄、病情相近者配成10 组； 用随机排列表将每个配伍组中3个受试对象随机分配到A,B,C 3 个处理组中; 临床试验。,用于配伍的因素通常为影响试验效应的主要非处理因素,如将受试对象按年龄、性别、体重等因素进行匹配,其目的是使得各处理组间除欲研究的因素外尽量保持均衡可比,从而提高试验的检验效能。 区组内的非处理因素基本相近 区组间非处理因素可相同或不同 各区组顺序随机排列,特点： 各区组内条件基本相同，抽样误差小，效率高 可分析两因素（药物对肾功能，年龄；药物对癌细胞，细胞类型） 注意事项： 因素的选择 区组的划分 不耐受缺失,氯胺酮、芬太尼、咪唑安定及异丙酚对TNF -/ IL - 10 平衡的影响,成年健康雄性新西兰大白兔(由广西医科大学实验动物中心提供) 30 只,以体重作为划分区组的因素以消除体重对麻醉药物的影响,按配伍组设计分为5组,处理因素分别为氯胺酮、芬太尼、咪唑安定、异丙酚和生理盐水。,拉丁方设计,如果一个方阵是用r 个拉丁字母排成 的r 行r 列,方阵的每行每列中,每个拉丁 字母只出现一次,那么这个方阵就叫r 阶 拉丁方,或r r 拉丁方,受试对象： 四个药物：A B C D 处理因素,用字母表示,另外两个是需要加以控制的因素,分别用行和列表示。 观察4种药物对不同来源动物及不同用药部位的影响,给药 受试对象号 部位 1 A A A A 2 B B B B 3 C C C C 4 D D D D,F给药部位= 1. 5335 , P 0. 05 ; F受试对象间= 0. 6193 , P 0. 05 ; F药物= 7. 1811 ,0. 01 P 0. 05 。,A B C D C B A D B C D A B A D C C D A B 拉丁方随机化 A D C B D A B C D C B A 标准方,多因素实验设计,多因素实验设计与多因素方差分析 多因素实验设计 析因设计(factorial design) 正交设计(orthogonal design) 嵌套设计(nested design) 裂区设计(split-plot design),多因素实验设计析因设计,将两个或两个以上的因素及其各种水平进行排列组合,交叉分组的试验设计。 优点：全面、均衡、效率高，信息多 每个因素的各水平之间是否有差异; 因素间交互作用; 最佳组合。,2 2 析因设计 两个因素A 和B ,每个因素有两个水平: A1 、A2 ,B1 、B2 。 两因素的交互作用称为一阶交互作用。 3 2 4 :A 因素3 水平,B 2 水平,C 4 水平,复方黄黛片中药血清药理学研究方法的建立 第四军医大学学报2005; 26 (17),目的:建立复方黄黛片(CRN IT)中药血清药理学研究方法. 方法:以兔为含药血清的供体,以NB4, K562等人白血病细胞株为研究对象,采用析因设计,观察给药与否、血清灭活与否、血清浓度及培养时间各因素（2 2 52）对白血病细胞株抑制率的影响及四因素间的交互作用.,中药血清药理学,动物经口服给药后的一定时间采血分离血清,用此含药血清进行体外药理实验的一种实验方法。 中药粗提物并不能代表体内环境真正发挥作用的有效成分 中药本身的理化性质(如电解质、酸碱度等) 及杂质成分等,都会对细胞的生长产生一定的影响,从而干扰实验结果,影响实验结论的真实性和可靠性。,特点,克服中药本身的理化性质等因素对实验结果的干扰 不仅反映药物中可吸收部分的直接作用,也可反映药物在机体作用下形成的代谢物和药物诱生的机体内源性物质的间接结果,真实地反映药物在体内的实际作用。,整体动物的选择和给药剂量 罗焕敏等以服用当归芍药散改良方的老年痴呆鼠血清研究了其对体外培养的海马神经元形态变化的影响。 给药剂量应以整体模型动物的有效剂量(即临床成人剂量的818 倍量) 为妥。,给药方案及采血时间 血清灭活与保存 血清的添加量和对照组的设立 血清中含有多种酶、抗体、补体及其生物活性物 质,它们对体外培养的细胞、病毒、病原菌以及直接 用于体外实验的组织器官等会产生影响而干扰。 血清经灭活后可否排除这些干扰因素？ 同时对药效产生如何影响? 含药血清是否可以长期保存?,析因设计是各因素不同水平的全面组合。当因素较多时(4)，由于组合产生的处理数急剧增加而难以实现。如实验涉及7个实验因素，每个因素需考察3个水平，则全部组合数为37=2187,析因设计缺点:需要的实验次数较多 可选用正交设计 析因设计：全面实验 正交设计：非全面实验, 根据专业知识，分析主效应 和部分重要因素的一阶交互作用。,正交设计,利用规格化的正交表-Ln (Km) 安排多因素试验（因素间可能存在交互作用）。 L :正交表, n :正交表的行数, K :各列的水平数, m :列数。,正交表L4（23）,优点： 正交表所确定的“实验点”具:在空间具有“均匀分散性”、在统计分析时具有“整齐可比性”。 大大减少试验次数,是一种高效、快速的多因素试验方法。 用于药物配方、工艺优化、生物体培养条件筛选,多因素重复测量设计,重复测量数据（repeated measurement data)是指每一实验单位至少接受两次以上的不同处理，或接受相同处理后，至少在两个以上不同时间点进行测量并获得相应次数的记录数据,与配对设计区别： 观察出发点不同 由于为同一对象的不同时间点，不具独立性。 相邻的两个数据之间的关系十分密切,相隔越远的两个数据之间的相关程度越低。（相关程度不等的现象）,例：将15 只家兔随机均分成3 组(处理因素A) ,即A1 、A2 、A3 。让全部家兔处于缺氧状态,对接受各种处理的每组家兔中的每1只,分别在缺氧前后的不同时间点(时间因素T , h) 上观测血浆K+ 含量即T1 (缺氧前) 、T2 (缺氧0. 5 h) 、T3(缺氧1 h) 及T4 (缺氧2 h) 。,常见误用情况,重复进行各时间点的t检验（增加假阳性错误） 忽略个体变化,临床研究,平行组对照设计(parallel group design) 交叉设计(cross-over design) 成组序贯设计（group sequential design) 析因设计(factorial design),平行组设计,随机对照试验（Randomized controlled trial ，RCT），随机分配到两个或多个组中的一组, 施以不同的处理（药品的一个或多个剂量,一个或多个对照,如安慰剂或/ 和阳性对照） 优点：避免时间偏倚，常见简单 缺点：工作量大，效率低。,观察期间出现了不良事件(不 良反应) 。该试验是继续下去 或者立即停止? 交叉设计和平行设计难回答.,传统的标准序贯方法,不规定样本量，配对随机分配到两个处理组(或同一受试者先后接受两种处理) ; 每得到一对试验结果就进行一次统计分析, 直至以一定的显著性水平得出拒绝或接受零假设的结论, 即可结束试验。 优点： 减少样本量, 缩短试验周期； 尽早停止较差的处理,符合伦理学的要求。,传统的标准序贯方法,缺点： 不可行的（无规则的不断监测和分析累计数据），不适合多中心 逐对地进入试验，仅适合急性实验（镇痛，止咳，麻醉),成组序贯设计（1977 ）,优点: 分段,期中分析（interim analysis） ，可用于长期试验 不要求配对相配 缺点 双盲试验需多次揭盲,期中分析定义为:在一个临床试验正式完成之前的任何时间内