课件：限制性内切酶小知识.ppt

限制性核酸内切酶,制作人：* 日 期：*,简介,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 别名 Endodeoxyribonuclease 酶反应 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。,单位定义 在指明pH与37，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1g的DNA的酶量为1单位。,定义和命名,DNA限制性内切酶： 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。,特征和种类,1限制与修饰现象 早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 E.coli 菌株 噬菌体感染率 lK lB lC E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。,2.限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统主要分成三大类。表 2-1 是各种限制与修饰系统的比较。 型（type ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3- 羟基和 5- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。 s 型（type s）限制与修饰系统，占 5% ，与 型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。 在 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。, 型（type ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。如 EcoK 和 EcoB。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR、hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoK 编码基因的结构为 R2M2S。 EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2 。 EcoB 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为甲基化位点， N 表示任意碱基。 TGA*（N）8TGCT EcoK 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点。 AAC（N）6GTGC 但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外，且无特异性。 型（type ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到 1% ，也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的，如 EcoP1 和 EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位点则在下游 24-26bp 处。 在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指 型系统中的种类。,表2-1：各种限制与修饰系统的比较,限制酶识别的序列,1限制酶识别序列的长度 限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基（表2-2）。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置。 4 个碱基识别位点：Sau3A GATC 5 个碱基识别位点：EcoR CCWGG；Nci CCSGG 6 个碱基识别位点：EcoR GAATTC； Hind AAGCTT 7 个碱基识别位点：BbvC CCTCAGC； PpuM RGGWCCY 8 个碱基识别位点：Not GCGGCCGC Sfi GGCCNNNNNGGCC 以上序列中部 分字母代表的碱基如下。 R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T,2限制酶识别序列的结构 限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。 EcoR 和 Hind 的识别序列和切割位置如下： EcoR GAATTC；Hind AAGCTT CTTAAG TTCGAA 有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 AccBSCCGCTC（-3/-3） 和 BssSCTCGTG（-5/-1）。识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。 AccBS CCGCTC；BssS CTCGTG GGCGAG GAGCAC 有一些限制酶可识别多种序列，如 Acc 识别的序列是 GTMKAC ，也就是说可识别 4 种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。 Hind 识别的序列是 GTYRAC 。 有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。如 AlwN 和 Dde ，它们的识别序列如下： AlwN CAGNNNCTG；Dde CTNAG GTCNNNGAC GANTC,3限制酶切割的位置 限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3A（GATC）、Nla（CATG）和 EcoR（CCWGG） 等；在两侧的有 Bcg（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）和 TspR（CASTGNN）， Bcg 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有 BbvGCAGC（8/12） 和 BspMACCTGC（4/8） 等。 Bcg 10（N）CGA（N）6TGC（N）12； 12（N）CGA（N）6ACG（N）10 TspR NNCAC（G）TGNN NNGTG（C）ACNN,1限制酶产生匹配粘端（Matched end） 识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称轴 5 侧切割底物，DNA 双链交错断开产生 5 突出粘性末端，如 EcoR ；若在 3 侧切割，则产生 3 突出粘性末端，如 Kpn 。 EcoR NNGAATTCNN NNCTTAAGNN 2限制酶产生平末端（Blunt end） 在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如 Hae（GGCC），Sma（CCCGGG），EcoRV（GATATC）。产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较粘性末端低。,限制酶产生的末端,3限制酶产生非对称突出端 许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的，如 BbvC，它的识别切割位点如下： CCTCAGC GGAGTCG 有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如 Acc，它的识别切割位点如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 为非对称： GTAT/CGAC CATA/GCTG 有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如 Dra 和 Ear，它们的识别切割位点分别是 CACNNNGTG 和 CTCTTC （1/4）。,4同裂酶（isoschizomer） 识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具体可分为以下几种情况。 同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同，如 Hind 与 Hinc 识别切割位点为 GTYRAC ， Hpa 与 Hap 识别切割位点为 CCGG ， Mob 与 Sau3A 识别切割位点为 GATC 。 同序异切酶 Kpn 和 Acc65 识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为 GGTACC 和 GGTACC 。另外， Asp718 识别和切割位点为 GGTACC 。 “同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如 EcoR 识别和切割位点为 GAATTC ， Apo 识别和切割位点为 RAATTY ，后者可识别前者的序列。另外， Hpa 和 Hinc 的识别位点也有交叉，它们的识别和切割位点分别为 GTTAAC 和 Hinc 。 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个 Sal 位点（识别切割位点为 GTCGAC），该位点也可被 Acc（识别切割位点为 GTMKAC）和 Hinc（识别切割位点为 GTYRAC）切割。,5同尾酶 许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶统称为同尾酶。这些酶切割 DNA 得到的产物可进行粘端连接。以下几种酶产生的末端是相同的。通过表 4-3 很容易判断哪些酶可产生相同的 DNA 末端。 EcoR GAATCC Mfe CAATTC Apo RAATTY Spe ACTAGT Nhe GCTAGC Xba TCTAGA BamH GGATCC Sau3A GATC Sty CCWWGG Cla ATCGAT Acc GTMKAC （pUC19） 常见同尾酶总结如下（来自网络）,6识别特殊系列的 -prefix 和 p-prefix 系列酶 有些线粒体、叶绿体、核 DNA 、T 偶数噬菌体含有一些编码内切酶的内含子，有些 intein （protein splicing element） 也有内切酶的活性，这两类内切核酸酶称为 -prefix 和 p-prefix 系列内切酶，它们识别的序列很长。 -prefix 是由在 RNA 水平上剪切和编码的， p-prefix 在蛋白质水平上剪切的产物。这类内切酶也称为 homing endonuclease ，目前商业化的种类有 6 种。从因特网上可以找到 Intein 的数据库 Inbase（Intein Database），该网站由 New England BioLabs 公司维护（） 。 -CeuI 酶是衣滴虫（Chlamydomonas eugametos）叶绿体大 rRNA 基因的内含子编码的产物，识别位点为 26bp ，识别的核心部位为 -12 至 +7 位置的 19bp 。反应温度为 37 ，识别位点如下，方框内为核心识别序列。 TAACTATAACGGTCCTAAGGCA,DNA末端长度对限制酶切割的影响,限制酶切割 DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。 用 20 单位（Units）限制酶切割 1g 标记的寡核苷酸做测试时，发现不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求（表 2-3）。相对来说， EcoR 对两端的序列长度要求较小，在识别序列外侧有一个碱基对时在 2 小时的切割活性可达 90% 。而 Acc 和 Hind 对两端的序列长度要求较大。 用 DNA 片段（线性载体）检测末端长度对切割的影响时，同样发现识别序列的末端长度对酶切效率有明显影响，不同的酶对末端长度的要求是不同。 在设计 PCR 引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的 PCR 产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。另外，了解末端长度对切割的影响还可帮助在双酶切多克隆位点时选择酶切秩序。,表2-3：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸检测）,影响酶活性的因素,影响酶切活性的因素有许多，概略的说可分为外因和内因。外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等。内因包括位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象。构象的影响主要指切割线性 DNA 和超螺旋 DNA 时的活性，如与切割 DNA 相比， EcoR、Pst、Sal 需要至少 2.5-10 倍的酶来切割 pBR322 的超螺旋 DNA 。 PaeRT 与 Xho 切割相同的序列（CTCGAG），但如果 5 端为 CT 则 PaeRT 不能切割。,Transitional Page,Backdrops: - These are full sized backdrops