课件：分子克隆工具酶 (2).ppt

第二章 分子克隆工具酶,本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！,第一节 限制性内切酶 第二节 甲基化酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 其他分子克隆工具酶,在过去20多年里，生物科学取得的许多革命性进步都直接来源于对基因的进一步认识和操作。基因操作或遗传工程的主要工具就是那些可在DNA分子上催化特异性反应的酶。酶的切割位点可作为DNA物理图的特殊标记，利用限制性内切酶可产生特定大小的DNA片段并使纯化这些DNA片段成为可能，获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质。对DNA进行修饰的工具的出现，为重组DNA的实现创造了条件。,第一节 限制性内切酶,一、限制与修饰 1、限制与修饰现象： 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶（restriction ednonuclease）的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主范围受到限制。 限制作用实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。 修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶（methylase）的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。 修饰作用宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。 甲基化作用：最主要的碱基修饰，使腺嘌呤A成为N6-甲基腺嘌呤，胞嘧啶成为5-甲基胞嘧啶。,2.限制酶的发现 起始于20世纪60年代对细菌的研究。 至2006年2月，共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种，商品化的609种，II型中共有223种特异性。 限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 限制酶存在于细菌中，也存在于一些病毒中，真核生物中没有限制酶。 碱基对（base pair, bp）,限制性核酸内切酶的命名原则 1973年H.O. Smith和D. Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类 限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus); 第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)，正体。 若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示，正体写在第4个字母之后，字母间无间隔。 例：EcoR、Hind、Sal,限制性核酸内切酶的命名原则： 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae strain d 流感嗜血杆菌d株 Hind Hind 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,3.限制性核酸内切酶的种类 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为、型三大类。 型限制酶用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只在单链上产生切口，s型识别序列和切割位置特殊。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,8,二、限制酶识别的序列 1、限制酶识别序列的长度(n)：一般为4-8个碱基对，最常见为6bp。识别位点出现频率：4n 2、限制酶识别序列的结构：多数为回文结构（palindrome）即镜像对称结构。 一些酶可识别多种结构尤其是允许一些碱基是简并的， 还有一些酶识别序列呈间断对称，即回文对称序列之间可以间隔一定长度的任意碱基。 3、限制酶的切割位置：多数在识别序列内部，也有在外部、两端、两侧或单侧的。,三、限制酶的功能和产生的末端类型 限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为P，3端为OH，识别序列一般为46个碱基对，通常是反向重复顺序，具有180的旋转对称性，即回文结构。 限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的末端类型。 1、对称型突出末端：回文结构决定对称，分为5突出和3突出的粘性末端（cohesive/sticky end）两种。 2、平末端（blunt end）：任何平末端酶的酶切产物可以互连，但连接效率比粘性末端低100倍左右。 3、非对称的突出末端：因为识别序列是非回文的、简并的或存在间隔序列，故产生的粘性末端也为非对称的。即使是单酶切限制片段在连接时也具有方向性。,4、同裂酶（isoschizomer）：不同的酶识别序列相同，切割位点可以相同也可以不同，又分为同序同切酶、同序异切酶、同功多位酶和其它类型。 例：Sma(CCCGGG)和Xma(CCCGGG) 5、同尾酶（isocaudarner）：不同限制酶识别序列可以相同，也可以不同，但它们产生的末端是一样的，末端间可以相互连接。同尾酶在基因工程尤其是载体构建中有较大用途。 例：Xho(CTCGAG)与Sal(GTCGAC)、 BamHI(GGATCC)和Bgl(AGATCT) 6、归位内切酶（homing endonuclease）：一些线粒体、叶绿体、核DNA和T偶数噬菌体的内含子编码内切酶（称为I-prefix）或内含肽（intein）具有内切酶活性（称为PI-prefix）。它们识别序列很长，核心识别序列一般为10-12bp，识别位点极少。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,14,四、DNA末端长度对限制酶切割效率的影响 限制性核酸内切酶识别和切割靶序列时需要识别序列两侧具有一定长度的DNA，否则会降低切割效率。 对侧翼长度敏感性较低的酶有EcoR等，只要一个侧翼碱基即保证90%的效率。 对侧翼长度敏感性高的酶有Acc、Hind、Pst等，侧翼3个碱基以上也未必理想。 设计引物、接头等时要考虑适当长度的保护碱基，载体构建时多克隆位点中的相临位置的酶的切割序列的选择也很重要。 限制酶的活性单位（unit）：1个单位的酶是指在建议的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1h，使1g DNA（多用）完全消化所需要的酶的量。,五、位点偏爱 某些限制酶对同一底物中的不同位置的识别位点的切割效率不同，表现出偏爱性，这种现象称作位点偏爱。 某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性不同。噬菌体DNA为48502bp，两端为12bp粘性末端。EcoR酶切割噬菌体中的5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍；EcoR对腺病毒2DNA不同位置切点的切割速率也不同。 由于位点偏爱性， DNA用Hind消化而制备的 Hind DNA marker中4.3kb条带甚至比2.0kb条带还弱。 原因：切割时需要同时与2个识别位点作用（如Nar等），或识别和切割时要求在DNA上有2个明显不同的结合位点，其中1个是另1个的被切割时起激活作用的变构位点。 应对办法：超量用酶、延长切割时间。,六、限制酶的酶切反应条件 1、缓冲液（多数商家提供10贮藏液） 多数II型限酶需要相似的缓冲液，但盐离子强度差异明显： Tris-HCl 50 mmol/L pH7.5 MgCl2 10 mmol/L NaCl 0-100 mmol/L（0、50、100分别为低、中、高） DTT 1 mmol/L 一些限制酶还需要添加BSA（牛血清白蛋白）。 一些公司开发了通用缓冲液，适用于多数不同的限制酶在同一体系中进行双酶切或多酶切，如MBI Fermentas的Tango buffer、Pharmacia的One-Phor-All buffer plus (OPA+体系) ，NEB (New England Biolabs)的U buffer为特殊buffer。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,17,2、体积和温度：反应体系一般用20-100 L，视情况可大可小。 多数限制酶的最佳反应温度为37，一部限制酶在50-65时最高效，少数在25-30时最理想。 3、反应时间：较纯的DNA（如试剂盒提取）在标准酶用量下反应1-4 h后可以达到完全，低的DNA纯度会降低酶切效率，增加酶的用量可缩短酶时间（但会增加星活力风险），延长反应时间可以减少酶的用量，进行部分酶切时要大大缩短反应时间并减少酶的用量，真核生物尤其是植物基因组总DNA完全消化（如Southern）时一般要消化24 h左右。 4、终止酶切反应的方法：添加EDTA、加热法、纯化法。,七、限制酶的星活性(star activity) 在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列不同但相似的序列，降低酶切反应的特异性，这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。 产生原因： 反应体系中甘油的浓度大于5%。 酶用量过大，大于100 U/g DNA。 低离子强度，小于25 mmol/L。 高pH，大于8.0。 含有机剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。 易发生星活性的内切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。 办法：对因改进。,八、单链DNA的切割 多数限制酶很难切割单DNA模板。 部分限制酶除切割双链DNA外，还可切割单DNA，但活性一般都不高。 切口酶虽然识别双链，但只在单链上切口，名称前要加一个N。 九、酶切位点的引入 现代基因工程中通过引物化学合成等方式可以很方便进向目标位置引入设计的酶切位点。 通过不同酶切末端的连接重组也可产生新的酶切位点，对具体情况的分析在设计中有价值： 5突出末端补平后重连； 同尾末端连接； 平末端连接。,十、影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性： 加大酶的用量，1g DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,21,DNA样品的甲基化程度 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、Mbol等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。 采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,22,十一、基因组中酶切位点分布的不均一性 在基因组中酶切位点的分布并不是均一的。 大肠杆菌中六碱基识别的酶Spe平均60kb才出现1次。 酵母中重复序列以外富含GC的识别序列较少。 哺乳动物基因组中CG序列只有随机概率值的1/5，且多数发生胞嘧啶甲基化，Sma位平均约65kb才出现1次。 果蝇和线虫中CG基序虽然少，但不发生甲基化。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,23,限制性核酸内切酶操作的注意事项 商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。 整个操作应在0进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。 当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。 当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。 正确保存、分装和取用限制酶，抽提高质量的DNA。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,24,限制性核酸内切酶的主要用途 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。 建立DNA分子的限制酶图谱。 构建基因文库。 用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。 改建质粒。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,25,第二节 甲基化酶,一、甲基化酶的种类 原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶（methylase），又称甲基转移酶（methyltransferase），大肠杆菌中有3种。 1、Dam甲基化酶 可在GATC序列中的腺嘌呤的N6位置上引入甲基。一般哺乳动物DNA不会发生腺嘌呤的N6甲基化。 一些酶对Dam甲基化敏感，如Bcl、Cla、Xba等。 一些酶对Dam甲基化不敏感，如BamH、SaU3A、Bgl、Pvu等。 2、Dcm甲基化酶 识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置引入甲基。 一些酶对Dcm甲基化敏感，如Acc65、Apa、Eae等。 一些酶对Dcm甲基化不敏感，如Ban、Bgl、Kpn等。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,26,3、EcoK甲基化酶 研究较少。 4、Sss甲基化酶 来自螺旋体，可使CG序列中的C在C5位置上发生甲基化 敏感的酶有：Cla、Xho、Sal等。 不敏感的酶有：BamH、EcoR、Sph、Kpn等 二、依赖于甲基化的限制系统 大肠杆菌中至少有3种依赖于甲基化的限制系统： McrA、McrBC、Mrr。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,27,三、甲基化对限制酶切的影响 1、修饰酶切位点：敏感的酶不能切开。 2、产生新的酶切位点：为依赖于甲基化的限制酶创造切点。 3、对基因组作图的影响：哺乳动物具有较多的m5CG序列具有组织细胞特异性，而且一个细胞内的m5CG甲基化不彻底，所以用m5CG甲基化敏感的限制酶作图时具有可变性，对图的稳定性带来影响。 植物的基因组DNA的甲基化程度高，作图时也要求选用对m5CG甲基化不敏感的限制酶。,第三节 DNA聚合酶,DNA聚合酶（DNA polymerase）的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTPs等情况下）及其相辅的活性。 真核生物有4种DNA聚合酶：、线粒体型。 原核生物有3种DNA聚合酶：、型。,一、大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）,基本用途,二、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment) （1）Klenow酶的基本性质： 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。 Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了5 3核酸外切酶活性。 （2）Klenow酶的基本用途（可被T4 DNA聚合酶代替）： 补平由核酸内切酶产生的3粘性凹陷末端 抹平DNA的3粘性凸出末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列,三、T4 DNA聚合酶(T4 phage DNA polymerase) （1）T4 DNA酶的基本特性： 有35的核酸外切酶活性和53的DNA聚合酶活性。 在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。 在四种dNTPs均存在时，聚合活性占主导地位。,（2）基本用途,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,37,四、T7噬菌体DNA聚合酶(T7 phage DNA polymerase) 持续合成能力最强 有35 外切酶活性是Klenow酶的1000。 可代替T7噬菌体DNA聚合酶的用途。 五、耐热性的DNA聚合酶（第八章详讲） 来自噬高温细菌，如Taq、Pfu等。 高温下具有53 DNA聚合酶活性，一般在72最理想。 有53 外切酶活性。 具35 外切酶活性者具校正（proofreading）功能，如Pfu。否则无校正功能，如Taq。 用于PCR扩增。,六、反转录酶(reverse transcriptase, RTase),反转录酶是依赖于RNA的DNA聚合酶，以RNA为模板聚合cDNA链，具有53的DNA聚合酶活性、53的RNA外切核酸酶活性和RNase H活性，但缺乏35RNA外切核酸酶活性，所以反转录过程中无校正功能。,用于cDNA第一链甚至第二链的合成，构建cDNA文库、RACE、RT-PCR等。 AMV（禽源）适温42，、MMLV（鼠源）适温37 。 野生型反转录酶能双向外切降解DNA-RNA杂合链中的RNA链，基因工程可敲除其RNase H活性。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,40,七、末端转移酶(terminal deoxynucleotide transferase, TdT),是不依赖于模板的DNA聚合酶，催化dNTP加于DNA分子的3羟基端。 可产生同源多聚尾用于连接、引物退火，也可用于末端标记。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,41,第四节 其它分子克隆工具酶,一、依赖于DNA的RNA聚合酶 依赖于DNA的RNA聚合酶ATP（DNA dependent RNA polymerase）包括SP6噬菌体和T4噬菌体RNA聚合酶。 活性：转录活性，无需引物，但识别特异启动子序列。 用途：体外合成RNA分子作探针等。用于表达外源基因的mRNA，然后用于翻译蛋白。,二、DNA连接酶(DNA ligase) DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5-磷酸根和3-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。 1、T4 DNA连接酶的作用机制： ATP + DNA ligase (E) E-AMP + PPi。 E-AMP上的AMP转移到DNA的5磷酸根上，使其活化，释放出酶。 活化的5磷酸根与相邻的3羟基形成3,5-磷酸二酯键，并释放出AMP。,修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键,修复与RNA结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,连接多个平头双链DNA分子：,2、DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50-100mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L ATP 0.5-1mmol/L DTT 5mmol/L Volume 10-20L Temperature 4-25 (16 optimal) Time 4-16h,3、平头双链DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）。 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用。 加入单价阳离子（NaCl）,最终浓度150-200 mmol/L。,三、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）,四、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase),2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,53,五、核酸酶（Nuclease） 1、BAL 31核酸酶 来源于交替单胞菌，从线性DNA两条链的3末端迅速去除单核苷酸，随后从单链内部发挥缓慢的内切酶活性，形成截短的平末端双链DNA及以带有5个核苷酸突出单链的截短分子。 用来从两头缩短DNA，用于构建嵌套缺失体。,2.S1核酸酶 S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌 降解单链DNA速度比降解双链DNA快75000倍 Zn2+必需 最适pH范围为4.0-4.3 需要NaCl 10-300mmol/L 降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍 用于分析DNA:RNA杂交体的结构，去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，打开双链cDNA合成产生的发夹环。 3. 绿豆核酸酶（mung bean nuclease） 类似于S1酶，但比S1酶更温和。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,57,4、核糖核酸酶A（ribonulease A或RNase A） 为内切核酸酶，可特异性攻击RNA上嘧啶残基的3端，不需要Mg2+，用于DNA中RNA的去除，使用前高温加热以去除DNase。 可在高温下活性，不易灭活。 5、脱氧核糖核酸酶（DNase） 为内切核酸酶，优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA，需要Mg2+，用于去除RNA中的DNA、切口平移法探针标记等。 适温为37。,6、外切酶核酸 催化双链DNA的3羟基端逐一去除单核苷酸的反应，用途广泛，如DNA截短、探针合成等。,2019/3/16,西南大学生物技术专业 基因工程,59,7、核糖核酸酶H（RNase H） 是内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RNA链，不降解单核酸、双链DNA和双链RNA，用于cDN