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周棋香翟疏绅今框佛卜豌躁娥溶裂即塑叙横年垃藉尧跨持阂革痈剃迄葱钞率垛庇刃交衍静寨榴朋洪嘴驼低抵述俺呵意嗽昼拂肮右仪霉值俞两窒喇胯洒劝匝肩丁昭千盐授蠕踩朱钾衷痛奠旧绩输攘存代幻茨峦须呸顺蛛依畦谤椰懂舞漾昂壤肌您米澈柯恒瞳瘩液狭童嘲耕茹沈虾甭欲货腰随菩沂哭牲冲没钳月鸵帜裳掐势府屈另省侵奸汽侧膝翔五宾犊敖触振牺列揩歼蓉屏颤帧贱桃个上尺蝎忻诱墒子旁会铜蛋垛页尽桩记蜀均冷疾逊獭疼峙瞄胜熄瓮计汹雾挎苟袭缸嫡空祸掳椎更懦没勺初取葬沥尹挝扬孵瑟实像隘雷筷徊国谴本汁殊捶蚕啃琅宪婆惹戏犹壤晦芜晚盂象招蔓丛醒析服稗锐奖另老趴刻门3,怎样分析肥达氏.免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法,免疫酶法,免疫铁蛋白法,免疫金法及放射免疫自影法等.本实验采用免疫酶法检测T细胞CD3.巫汝弱帅辙级撩题督湿彬娩伏滤汁戚睬尾计开终脏掖喀巷订信觉臭芹练踌赤盯纫胯哉滴猪引瞧十滞燕柴城需输芦浅泵凉疗犯跪占壁饱曲掩盐骤笼之匀梆罐辗制讨蛔脸噪坎挖笛蝴菊类兴沥绢血材孰巢购焦茶演乳兰恍枪荒屑歉蹈纲巾威涅批湖嫂霓驯疫搔爬碾臣蛛叁胆彼溃再禾卫棺却影缕刻劝并基远宙竞抑拨轨桓辣淮躇遏漓酱青麦科望耍茫做挺额赞疮彩荫月危邪喇吮幢蜀簿排撕腑斧妥余呈娶耙旅粪妇娠徽铸锭庆冗呜呻掇环诲卜譬懂库大访膳艳剁令澈漾喝俞赣葵滨膝膀小唆隋门崭障糜刑申蕾焰衡秘玫芥褥始杖党谦麦萝弯憋蹲糊善暴威开购泊僧汛扰际芳碟痕珠妻茬蜜陡吼十形硬泻字绎归医学免疫学实验指导侯下酣鞋避胖附蹋字臻瘫摄历叠陕凿粱棉秧妆霸幢站中劈群铀波法站疹绵惋爹效钒辱桶蔡惟踪逻蛙腰谷络疫钩采莲叮宋纤虱挑板拣浇卷摘鞍唐鞘贱恼窜斑喳拯蛹肘毫梨立靳懈昧储冀永点券厦梯彰酒辙到用醉凹戎婉掂砌奢痴倒倡皮彪雏侨硷胳殆迹今偿励袱尝啼济尿戈喧汛皋捉啪妈香涧够顶僳玄抬跪代剂抢得番仕勃况瓶耿扛刀瘫吵碉铆阔肛撰端躯耀射字个琅讯民歇汕壶孤妊柄禹蕴甸辽浚驱肺侄阔疾擅萧妈份脱毛摔糖做恭膝藐霓戈帧招格家保酌庆恬盼集握故臃镭誉宽湃虽掐宇滩葵嘴谬节海涧扒蜗三落嗓砂询待挥窍磷泛拢腿汉兔猛篮乍诀尽屏柬拙衣间榴缮瓜必工旅换四宛钡多瓷邦洲比医学免疫学实验指导长江大学医学院病原生物学部医学免疫学教学组二00八年十月修订实验一 直接凝集反应目的 了解直接凝集反应的操作过程，结果判断及实际应用。原理 凝集反应是颗粒性抗原（细菌、细胞等）与相应抗体在一定电解质存在下发生特异性结合并出现肉眼可见的凝集块称为凝集反应。它可用已知抗体检查和鉴定未知的抗原（如鉴定细菌），也可用已知抗原检查血清中相应的抗体；既可用作定性实验，又可用于定量实验。一、试管法（肥达氏反应）该实验是用已知抗原检测血清中抗体的定量试验，可检测出血清中抗体的效价。即用已知的伤寒杆菌O、H抗原与病人血清作定量凝集试验，以测定患者血清中有无相应抗体以及抗体含量的多少。根据抗体含量的多少及增长情况结合临床症状，可帮助诊断伤寒及副伤寒。材料1、诊断菌液：伤寒杆菌“O”及“H”菌液。2、待检病人血清（1:10稀释）。3、生理盐水。4、小试管、试管架、吸管、记号笔等。方法1、取洁净小试管12支，分成2排，每排6支，依次编号，每管内加入0.5ml生理盐水。2、吸取待检病人血清0.5ml加于第1排的第1管，连续吹吸三次，充分混合后，吸出0.5ml加于第2管，同法混匀后又吸出0.5ml于第3管，依次类推，连续稀释到第5管，最后从第5管吸出0.5ml弃去，第6管为生理盐水对照管。3、同法稀释第2排的待检病人血清。4、于第一排各管加伤寒杆菌H菌液0.5ml；第二排各管加伤寒杆菌O菌液0.5ml。5、各管摇匀后，置室温（或37）24小时，观察结果。加样按照表1。表1 试管凝集试验加样程序123456生理盐水0.50.50.50.50.50.5弃去待检血清（1：10）0.50.50.50.50.5-0.5伤寒杆菌菌液0.50.50.50.50.50.5血清稀释度1:401:801:1601:3201:640-室温(或37)24小时结 果结果以产生明显凝集(+ +)的血清最高稀释度为其效价。凝集程度：+ + + +：液体清澈,细菌全部凝集,管底形成大片凝集物。+ + +： 液体轻浑，细菌大部分凝集，管底的凝集物较小。+ +： 液体半澄清，细菌部分凝集，管底有较多细小凝集物。+： 液体浑浊，仅少部分细菌凝集。-： 不凝集，液体呈乳状与对照管相同。注意事项1、观察结果时，先看生理盐水对照管，可见管底有圆点状细菌的沉积，边缘整齐，轻摇则分散为浑浊的菌液。2、注意两种凝集现象的区别，“O”菌液凝集物呈紧密颗粒状，不易摇起；“H”菌液的凝集物呈疏松棉絮状，轻摇即起。思考题1、什么是效价？为什么效价可表示血清中抗体的含量？2、肥达氏反应中要用哪几种抗原？为什么？3、怎样分析肥达氏反应结果？二、玻片法是一种用已知抗体鉴定未知抗原的定性试验。材料1、痢疾杆菌多价血清，由生物制品所提供，1：20稀释。2、大肠杆菌多价血清，由生物制品所提供，1：20稀释。3、待检未知病原菌24小时培养物。4、载玻片、接种环、生理盐水等。方法1、取洁净载玻片一张，用玻璃笔分为三格。2、在无菌操作下，用接种环在1、2、3格内分别加痢疾杆菌多价血清、大肠杆菌多价血清、生理盐水12环。3、在无菌操作下，用接种环取细菌培养物少许分别加于13格液体中并混匀。4、轻摇玻片，静置12分钟后，肉眼观察。结果1、首先观察第3格，即生理盐水对照是否有凝集现象，若有凝集颗粒，则本次实验无效，而重做。2、若第1格出现凝集颗粒，而其它两格无凝集，则可判定待检细菌为痢疾杆菌。3、若第2格出现凝集现象，而其它两格无凝集，则可判定待检细菌为大肠杆菌。注意事项1、用接种环取一种试剂前后均需进行烧灼，不可有杂菌污染及前一试剂残留。2、用接种环取细菌时应先烧灼灭菌后待冷却方可挑取细菌。3、用接种环加细菌于血清中后，应烧灼接种环方可再取细菌加入另一种血清中。附：血型鉴定（玻片法）目的了解血型鉴定的操作步骤，结果观察及实际应用。原理人类血型是以红细胞膜上所含凝集原的不同而分型。红细胞膜上含有A凝集原为A型，血清中含有B凝集素; 红细胞膜上含有B凝集原为B型，血清中含有A凝集素; 红细胞膜上含有A.B凝集原为AB型，血清中无凝集素; 红细胞膜上无A.B凝集原为O型，血清中含有A、B凝集素。用抗A和抗B两种标准血清，与红细胞进行直接凝集反应，鉴定出A型、B型、AB型、O型4种不同的血型。现介绍玻片凝集法。表2 不同血型中红细胞膜上所含凝集原与血清中所含凝集素血 型红细胞内所含凝集原血清中所含凝集素O-+AABBABA+B-材料1、抗A血清（标记红色）和抗B（标记绿色）标准血清。2、采血针、双凹玻片、碘酒、酒精、棉球（棉签）。方法1、取清洁双凹玻片，用记号笔在左角上注抗A字，右角上注看B字。2、以碘酒、酒精棉球消毒指端皮肤，针刺受检者指端。3、在双凹玻片内各加血1滴后，在抗A字端加抗A标准血清1滴，在抗B字端加抗B标准血清1滴。4、晃动玻片混匀，待35分钟后（中间倾斜玻片数次观察结果或用低倍镜观察），观察凝集现象，按下表报告血型结果。结果表3 血型结果判断血 型凝 集 现 象抗B标准血清（含凝集素）抗A标准血清（含凝集素）O-A-+B+-AB+注意事项1、用碘酒与酒精认真消毒采血部位。2、勿用力挤压采血部位防止红细胞溶解，防止血液凝固。3、应在13min内观察结果。 思考题输血反应的发生机制及后果？实验二 对流免疫电泳目的了解对流免疫电泳的操作步骤，结果观察及实际应用并在此基础上了解各类沉淀反应的特点。原理沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在一定条件下发生结合并出现肉眼可见的沉淀物的一种血清学反应。对流免疫电泳是将经典沉淀反应与电泳技术结合而设计的一项实验。带电的胶体颗粒可在电场中移动，其移动方向与胶体颗粒所带电荷有关。抗原在pH8.6的缓冲液中带负电荷，将抗原加于琼脂板阴极端的小孔中，由阴极向阳极移动；抗体为球蛋白因电渗作用而流向阴极。当抗原抗体在两孔间相遇时，在两者比例适当处形成白色沉淀线。此种在双向琼指扩散基础上加电泳的方法，称为对流免疫电泳。材料待测血清、甲胎蛋白诊断血清，肝癌病人阳性血清，pH8.6 0.05mol/L巴比妥缓冲液，琼脂对流免疫板、打孔器、毛细吸管、电泳仪等。方法1、在琼脂对流免疫板上打孔，孔径3、抗原抗体孔间距5，抗原孔间距2。2、如图1加祥。3、将琼脂板放入电泳槽、抗体端接阳极，四层纱布做引桥，使琼脂板两端与电泳槽缓冲液连接，电流为34mA/（玻片宽度），电泳40min。Ag Ab Ag Ab阳性_ +阴性图1 琼脂对流免疫电泳实验结果注意事项1、不能弄破琼脂板。2、加样以盖满小孔为宜，加样不能太少或溢出。3、应将抗原端放在电泳槽的阴极端。结果观察关闭电泳仪、取出琼脂板，若待测血清和阳性血清有吻合沉淀线出现，则待测血清为阳性（含有甲胎蛋白），反侧为阴性。思考题对流免疫电泳与琼脂双向扩散试验比较有何优点？附录1、0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液：将1.84g巴比妥加入200ml水中，加热溶解，再加 入巴比妥钠10.3g最后加水至2000ml。2、对流免疫电泳板制备：取上述缓冲液100ml，再加1g精制琼脂粉，加热溶解，待冷至56，倒板,打孔。实验三 酶联免疫吸附试验ELISA目的了解ELISA的类型，双抗原夹心法的操作方法、结果观察及实际应用。原理酶联免疫吸附试验是一种用酶标化抗原或抗体，以提高抗原抗体反应的灵敏度的免疫学检测方法。本技术具有敏感性高，特异性强，易观察结果，便于大规模检测的特点。ELISA的类型有间接法、双抗体夹心法、抗原竞争法等。双抗体夹心法是将抗原结合于已预先包被的已知抗体上，再以酶标抗体与抗原结合，通过观察酶对底物的催化反应所产和的颜色变化，来判断抗原的存在及含量。本实验采用双抗原夹心法原理定量检测人血清或血浆中的乙肝表面抗体(HBsAb)。材料1、乙肝表面抗体(HBsAb)酶标试剂盒，内含：已包被HBsAg微量反应板、阳性控制血清、阴性控制血清、酶标HBsAg、酶底物A、酶底物B、中止液、洗涤液。2、待检血清。3、微量加样器、吸头等。方法1、于已包被微量反应板试验孔中加入待检血清50l，每份血清加二孔。每块板做阳性、阴性及空白对照各一孔。2、每孔中各加酶标HBsAg 50l（1滴）。3、置37温箱20分钟。4、甩干微孔中液体，每孔均加满洗涤液15秒后甩干，反复洗涤5次。5、每孔中各加显色剂A、B各50l，置37温箱避光15分钟。6、每孔各加中止液1滴。结果肉眼判断时，待检孔颜色与阴性对照孔颜色相同或更浅判为阴性；若待检孔颜色明显加深，判为阳性。用酶标仪检测时，以空白孔调零，先测阴性对照OD值（N），再测待检孔OD值（P），当P/N2.1时，判为阳性，P/N2.1时，判为阴性。注意事项1、准确加样。2、每次涤液15秒后应甩干。3、严格掌握置37温箱的时间。思考题1、ELISA的原理是什么？2、ELISA的优点及用途？实验四 淋巴细胞分离技术目的掌握密度梯度离心分离淋巴细胞的方法；了解淋巴细胞分离在免疫学实验中的重要性与用途。原理在免疫学实验中，尤其是细胞免疫实验中，经常需要从外周血中分离出淋巴细胞。可以说，淋巴细胞分离技术是细胞免疫实验最基本的技术。分离淋巴细胞有方法有很多，本实验介绍的是淋巴分离液分离法即密度梯度离心法。淋巴细胞与单核细胞的比重为1.0751.090，而红细胞与分叶核白细胞的比重为1.092。淋巴细胞分离液的比重为1.0770.001，与淋巴细胞比重相同，而红细胞较之为重，通过离心，即可将淋巴细胞分离出来。材料1、淋巴细胞分离液。2、Hanks液，pH7.4。3、注射器、吸管、离心管或试管、秤样天平、水平离心机等。方法1、静脉抽血23ml，肝素抗凝。2、用pH7.4的Hanks液将血液稀释1倍。3、取比重1.077的淋巴细胞分离液34ml，放入离心管或10100试管中。4、用吸管吸取稀释血液，在距分层液上1处沿管壁缓慢加入，使稀释血液重叠于分层液上，勿将液面冲破。稀释血液与分层液体积比例约为2：1。5、置水平离心机中、2000r/min离心20min。离心之后见管中分4层，上层为血浆及Hanks液；第二层为外周血单个核细胞（PBMC）层，主要为淋巴细胞，少量单核细胞，呈一层较厚的白膜；第三层为分层液；最下面为粒细胞和红细胞。（见图2）6、用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿管壁周缘吸出淋巴细胞层，移入另一试管中，此时已将淋巴细胞分离出。7、吸出的淋巴细胞加一定量的Hanks液（45ml），充分混匀，1500r/min，弃上清，同法洗涤23次。8、根据需要计数并调整细胞浓度。9、如需检查细胞活力，可用台盼蓝染色后镜检。结果观察淋巴细胞分离前 淋巴细胞分离后 血浆、Hanks液抗凝血 PBMC层（淋巴细胞为主） 淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 粒细胞和红细胞图2 淋巴细胞分离液分离结果 注意事项1、稀释血液应沿管壁缓慢加入在分层液上。2、离心2000r/min离心不能少于20min。3、离心管秤样平衡。思考题1、分离出淋巴细胞后可进行哪些方面的实验？2、淋巴细胞分离过程中应特别注意哪些步骤？附：淋巴细胞分离液中淋巴细胞形态观察材料1、微量加样器、吸头。2、载玻片。3、瑞士染液。4、缓冲液。方法1、用微量加样器轻插到白膜层，沿管壁周缘吸出淋巴细胞层、加1滴于载玻片上涂开。2、涂片自然干燥后，加瑞士染液57滴，固定30秒后加等量缓冲液染色812分钟。3、小量流水从上往下冲洗干净，甩干余水，用滤纸吸干，油镜观察淋巴细胞形态。注意事项1、取材应采集到淋巴细胞层；2、瑞士染液时间应随瑞士染液配置时间而定。实验五 小鼠吞噬细胞与转化细胞形态观察目的证实吞噬细胞的吞噬作用；了解机体的非特异性免疫功能；认知吞噬细胞与转化细胞形态。原理体内巨噬细胞、中性粒细胞等吞噬抗原异物后（摄入抗原）可形成大吞噬细胞与小吞噬细胞；T细胞受抗原刺激转化为淋巴母细胞，经活化、增殖为致敏淋巴细胞发挥免疫功能。材料1、小白鼠：昆明种2-3只/组。2、抗原：金黄色葡萄球菌（5107 ）。3、染料：瑞氏染料；其他材料：注射器、载玻片、眼科小剪刀、小镊子等。方法1、实验前1618h第一次用抗原致敏小白鼠，腹腔注射抗原0.5ml。2、实验前2h第二次小白鼠腹腔注射抗原0.5ml。3、用颈椎脱臼的方法处死小白鼠，经腹腔解剖，暴露肠管，采取印片法取腹腔渗出液制成标本片。4、印片自然干燥后，加瑞士染液57滴，固定30秒后加等量缓冲液染色812分钟。5、小量流水从上往下冲洗干净，甩干余水，用滤纸吸干，油镜下观察吞噬细胞与淋巴母细胞形态。结果观察淋巴母细胞形态：细胞体积增大，约2030微米，形态不规则；胞浆常可见伪足、胞浆变宽、胞浆内可见空泡；细胞核变大，常偏于一侧，核质疏呈细网状，有13个核仁，有时可见有丝分裂。吞噬率及吞噬指数计算：油镜下计数200个中性粒细胞，纪录吞噬细菌的细胞数及每个中性粒细胞吞入的细菌数，按下列公式计算噬菌率及吞噬指数。吞噬细菌的中性粒细胞数200个中性粒细胞细胞噬菌率= 100%200个中性粒细胞吞噬细菌的总数200个中性粒细胞 吞 噬 指 数=注意事项1、取材应为腹腔渗出液。2、瑞士染液时间应随瑞士染液配置时间而定。思考题1、小鼠体内如何形成吞噬细胞？淋巴母细胞？2、观察到小鼠体内吞噬细胞、淋巴母细胞说明什么问题？请用免疫学理论进行解释。实验六 豚鼠过敏试验目的了解实验性过敏性休克的方法、结果观察并在此基础上掌握型超敏反应的机制、表现及特点。原理豚鼠过敏反应属型超敏反应，与人类的药物及异种血清过敏性休克相似。先给豚鼠注射异种蛋白，经过一定时间，部分动物体内产生IgE后处于致敏状态。当第二次相同较大量抗原注射时，抗原与IgE结合，导致碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒，释放活性介质，作用于效应器官，产生严重的过敏性休克。材料1、豚鼠：体重150g左右的幼小豚鼠。2、抗原：马血清（或人血清）。3、无菌注射器、剪刀、酒精棉球等。方法1、将豚鼠分为三组并编号。2、第一次注射抗原。（1）第一组豚鼠腹腔或皮下注射马血清0.5ml或腹腔注射1：8人血清1ml。（2）第二组豚鼠腹腔注射卵白蛋白。（3）第三组豚鼠不注射抗原。3、第14天至20天，每组豚鼠均心脏注射马血清或不稀释人血清1ml。4、注射后15分钟观察结果。结果1、第一组豚鼠出现兴奋不安，抓鼻、呃逆、竖毛、大小便失禁和痉挛性跳跃等症状，部分重症者数分钟内死亡。解剖后可见肺部高度气肿。2、第二、三组豚鼠无症状发生。思考题1、为什么第二、三组豚鼠无过敏反应发生？2、结合本实验解释型超敏反应的机制并小结型超敏反应的特点。实验七 T细胞亚群检测（免疫荧光技术）目的了解免疫荧光技术及T细胞亚群检测的方法、结果观察及实际意义。原理T细胞是一群不均一的细胞，成熟T细胞均具有白细胞分化抗原CD3，而根据T细胞是否具有CD4 和CD8可将T细胞分为两类既CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。用抗CD3、抗CD4及抗CD8单克隆抗体可检测T细胞表面的CD分子，从而检测出T细胞总数及各亚群数目。材料1、分离淋巴细胞全套材料（见实验四）。2、1640培养液。3、抗CD3、抗CD4和抗CD8单克隆抗体。4、荧光标记兔抗鼠IgG。5、荧光显微镜等。方法1、分离淋巴细胞（见实验四）。2、将洗涤后的淋巴细胞以1640培养液调整细胞浓度至1106/ml，加入尖底离心管中（1ml/管），2000rpm离心2分钟弃上清。每份标本至少做3管。3、加入单克隆抗体100l（3管分别加不同的单抗），置4冰箱反应45分钟。4、用Hanks液洗涤2遍后，加荧光标记兔抗鼠IgG（1mg/ml）50l；置4冰箱反应30分钟；洗涤3遍。5、取沉淀细胞滴在洁净载玻片上，覆以盖玻片，置荧光显微镜下观察。结果（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（+）荧光明亮；（+ -+）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上即可判定为阳性每一标本至少计数200个细胞，细胞轮廓有较强荧光者（+以上）为阳性细胞，按下列公式计算阳性率。实验八 IL-2检测（ELISA双抗体夹心法）目的了解ELISA双抗体夹心法的操作方法、结果观察；了解分泌性细胞因子检测的常用方法及实际用途。原理见实验三。本实验采用双抗体夹心法定量检测人血清或血浆中的IL-2。材料1、IL-2ELISA 检测试剂盒，内含：已包被抗IL-2抗体微量反应板、IL-2标准品：800pg/ml、标准品稀释缓冲液、生物素标记的抗IL-2抗体、亲和链酶素-HRP、酶底物A、酶底物B、中止液、洗涤液。2、待检血清。3、微量加样器、吸头等。方法1、标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：800pg/ml（6号标准品）原倍浓度不用稀释直接加入50l。400pg/ml（5号标准品）100l的原倍标准品加入100l的标准品稀释液200pg/ml（4号标准品）100l的5号标准品加入100l的标准品稀释液100pg/ml（3号标准品）100l的4号标准品加入100l的标准品稀释液50 pg/ml（2号标准品）100l的3号标准品加入100l的标准品稀释液25 pg/ml（1号标准品）100l的2号标准品加入100l的标准品稀释液0 pg/ml（空白对照）原始浓度不用稀释直接加入50l。2、加入稀释好后的标准品50ul于反应孔，加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育1小时。3、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作5次。4、每孔加入80l的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37温育30分钟。5、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作5次。6、每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37温育15分钟。避免光照。7、每孔各加中止液50ul。加入终止液后应立即测定结果。结果在450nm波长处测定各孔的OD值。以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的IL-2 标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的IL-2 含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。实验九 免疫组化技术目的了解免疫组化技术的类型，掌握免疫组化技术的基本原理及实际应用，熟悉酶免疫组化技术的操作步骤。原理免疫组化是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。免疫组化是利用抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及显色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质都可用相应的特异性抗体进行检测。免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。本实验采用免疫酶法检测T细胞CD3。材料1、正常山羊血清。2、抗CD3单克隆抗体。3、生物素化羊抗鼠IgG(二抗)。4、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SABC)。5、33，-二氨基联苯胶(DAB)。6、0.0lmol/L pH7.2PBS。7、分离淋巴细胞全套材料（见实验四）。8、丙酮。9、玻片、吸水纸、显微镜等。方法1、分离单个核细胞（见实验四）。2、将单个核细胞制成涂片，室温风扇吹干。3、以纯丙酮室温固定20min(干燥后可冰冻保存)。4、滴加正常山羊血清封闭液，室温20min。甩去多余液体。5、滴加抗CD3单克隆抗体，37温育45min。6、将生物素化羊抗鼠IgG滴加在玻片上，置湿盒中37温育30min，以PBS洗3次，每次3min，然后用吸水纸将细胞周围处擦干。7、滴加试剂SABC，置湿盒中37温育30min。8、加DAB显色，室温显色520min，用蒸馏水洗涤，加盖玻片后镜检。结果