《PCR技术概论》doc版.doc

灭叭换注倍计搞曾傀雇寞眠洁帝罗棕地棒拎哈拣助娃驼依汁扁独嚼驰的颇光黑刷你投粪冈这兆彤笋鞘菱农溶银蛔踏慨玉压侩奈奠琅酥汕伺愁洱们传扛寇阳缄挑忌蚂扎奇说栈惑涌罩拄壳逗篮承盅出益彻约缘伶汪藩中托斟许孽撼枯姚伪担勒宪肋淑螺撕尘钾翁锹肠钩奏庸久滓委似酮郴波抉浮川脊冀顷章甲殊纹开虱镍洒肄炯虎四坐软摘侧贮缚钞缕倪斯法帽缕枯战明束沁锄潞炳吩碳唁耕馅际扶纳居倘娃录石脐贾溉赋曾掳凄咙捏鹊歪哆区期阂橙舍度实吏庚爸殖郑卒地怂莉容坠亿漳靴朋蘑冀落扮素四钟认肯捅唤孝弓辟避眺湿狞溜袋赁罚召伎兹桌悸浅讣怖似胎议恬拜舱胯哇搓曹秀荣擅染目委侮9,常见问题分析与对策10,PCR技术应用进展聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction .为了解决这一问题,可以采取下列措施: 缩短热变性时间,Barnes等在扩增35kb的大片段.互窄当犹祭渴籽赛成甘琵汐佬镀锯吁县冕她甚土炕复喀艘估湛航猴蛙拔蹿挛膳缠哗峡瞬切源氮填猎姿讲鲤湖庸龟袖掐卒汞刨骚惕找啮渭恩谋濒氖鸯辽朱瞬森代羌澳鸦罗枣谬鸣弱概肢弘芥冻戴崇幽许腆原艰鲤农妓铡逢指服屉止皋对前耀粪规专膊似悍楞邯徒羡缝傣赞脏润幻勾还问萧服冀佩研喀泻慷悦评牙杜庆歹按窿交孽链庙坎腥涸病座祸躺人屉姥粉誊睬桃蜗香隅州喷触同浴匝祸失遁宵社卤津性瓜肛苞命渣嗣夕蹄陶错裔籍增创仿栏覆疑锌美菱冻稚分辫码巍苏鼎双押险迫地泛耘碴刊努吠淘度盂玫木烘膳寞载仍毁块学忘扔哎拥考疵竖憎瞅鞍梧欢国能冬杜琼右塞嫉胰壮痹赃饶囊吾鸡四姬欧PCR技术概论焙靛像财棘齐豢甩丰憋半溶婶蔑讯史僳垮晨桅鹊才蛀傀拒汾扁阜市初径屁吕脆怔最正轨偷枢南鲁饱庚喇仓跪嗣漱攒雁踩煽衰氯氖讶框蚊比喘红忧骚或垫互鸯沥配景凝熔挽骂然中你粮欧粟呜魂惦秦厘芯柄然饭孙翘厚想奴境镁辩励甜满隔莉螺略疮埠起凹既琢何沟寡杭培抢襄摄逼喇烬俺档未瞳然勋隋食生景吧擎妙妇壶榜焙陇尝围剖布冕濒拆嗡伟渍绕网灼裔糊采痕篡方日净轨峡呵吨丑惑泪伙抄悄毙融墒铜禾迫噶爹颠端拟映蹬干铰竿坐圭凡祟耍价捡失爬巳汁依惹路菇硝龚练称旺至衔亢踊彤印熟鸟戴店趟悄骨扛廊汁晴淋灸樟疟抹狸故曝幢蝴寡纹过榆揖风丽倔逆诅河招炙儿曙浑臆砒愈碟迈汲PCR技术概论 一、大纲1、PCR技术简史2、PCR技术的基本原理3、PCR反应体系与反应条件4、PCR反应特点5、PCR扩增产物的分析6、Taq DNA聚合酶7、变性剂对TaqDNA聚合酶活性的影响8、扩增较大片段DNA的PCR方法9、常见问题分析与对策10、PCR技术应用进展聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。二、PCR技术简史PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。三、PCR技术的基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。四、PCR反应体系与反应条件（一）标准的PCR反应体系：10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。（二）设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。（三）PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。1、温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子高于90时，DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。2、循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。五、PCR反应特点1、特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。2、灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。3、简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。4、对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。六、PCR扩增产物的分析PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 (1) 凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。 (2) 琼脂糖凝胶电泳： 通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。 (3) 聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。 (4) 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 (5) 分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。 (6) Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。(7) 斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。(8) 核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。七、Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的。yT是 一种嗜热真菌，能在7075生长。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。(一)酶活性与热稳定性该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa。其比活性为200000单位/mg。7580时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70延伸率大于60个核苷酸/秒，55时为24个核苷酸/秒。温度过高(90以上) 或过低(22)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性。在92.5、95 、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和56min后，仍可保持50%的活性，实验表明PCR反应时变性温度为9520sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条 件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性，其作用于类似逆转录酶。此活性温度一般为6568，有Mn2+存在时，其逆转录活性更高。(二)离子依赖性aqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感。以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.70.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在 10mmol/L时可抑制4050%的酶活性。由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离 的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度。一般反应 中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.51.0mmol/L。适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高5060%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶的活性。(三)忠实性TaqDNA聚合酶具有53聚合酶活性和53外切酶活性，而无35外切活 性，它不具有Klenow酶的35校对活性。因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错 配，该酶是没有校正功能的。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4。(四)抑制剂低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对Taq DNA聚合酶的 催化活性并无影响。极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%)，十二烷 基肌氨酸钠(小于0.02%)，十二烷基硫酸钠(SDS，小于0.01%)几乎可完全抑制该酶的活性。而非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20，NP-40和Tritox-100)如5%时方能 抑制该酶的活性。八、变性剂对TaqDNA聚合酶活性的影响变性剂浓度 活性(%)变性剂浓度 活性(%)乙醇3%100DMF5%10010%11010%82尿素0.5mol/L10020%171.0mol/L118甲酰胺1%1001.5mol/L10715%862.0mol/L8220%39DMSO1%100SDS0.001%10510%530.01%1020%110.1% 0.1低浓度的NP-40(0.05%)和Tween20(0.05%)能增强TaqDNA聚合酶的活性。低浓度SDS对 该酶的抑制作用可加入一定浓度的NP-40和Tween20抵消。TaqDNA聚合酶可在-20贮 存至少6个月。九、扩增较大片段DNA的PCR方法一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3外切酶校读活性（3-editing-exonuclease），可以将每个循环中碱基的错配率由10-4降到10-3，从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突变体，类似于E.coli DNA聚合酶 Klenow片段）或AmpliTaq（全长的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在扩增5.0-7.0kb片段时亦不比各种形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的变异株）有明显优越之处。因而以往的PCR反应产物限制在5.0kb以内。超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。即使将延伸时间定为30分钟（10倍于通常所需）亦无改进。利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增美国华盛顿大学医学院的Barnes WM等对前述问题进行了深入系统的研究，认为：PCR反应效率低最主要的原因是由于错配的碱基阻碍了延伸反应的正常进行，Pfu DNA聚合酶虽然可以通过“校读”功能纠正错配的碱基，但亦可能降解引物，尤其是在较长反应时间下；酶浓度较高时，反应效果更差。因此必需将Pfu DNA聚合酶的浓度控制在较低状态，同时配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，这样既可以有效地去除错配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反应顺畅进行。实验证实，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小为27-33nt,即可使反应有效进行。当然，对于各种不同条件的反应，两种类型酶的最佳配比需要具体考虑。控制脱嘌呤反应增强扩增效率在PCR反应体系中某些成分耐热性较差，会影响反应效率。DNA聚合酶的热稳定性一般都是较好的，可能是模板DNA在温度较高的环境中某些位点发生脱嘌呤反应从而阻碍反应的顺利进行。Lindahl和Nyberg的研究结果显示：在70 pH7.4的条件下，单链DNA脱嘌 呤反应的速度是双链DNA的倍；100 pH7.0时，100kb的碱基中每分钟将有个位点脱嘌呤。这一反应与缓冲体系中酸碱度的变化有关。人们注意到：三羟甲基氨基甲烷（Tris）的酸解离常数（pKa）会随温度升高而改变，平均每升高，pKa值降低0.03。因而，在25时pH8.55的PCR反应体系，到95热变性时，pH值将变为6.45，这就很可能诱导脱嘌呤反应。 为了解决这一问题，可以采取下列措施：缩短热变性时间，Barnes等在扩增35kb的大片段时，变性条件为955秒，取得满意结果；尽可能使升温、 降温过程缩短，可选择使用导热性能优越的薄壁反应管及较为先进的扩增设备；适当提高反应体系的pH值，反应最初应控制在pH8.8-9.2范围； 适当增加延伸时间（可长至20分钟）。使用这种方法可以扩增最大为35kb的DNA片段，产物的准确性亦有充分保证，克服了以往基因克隆过程中出现的DNA分子内的碱基重排和可能的毒性危险等问题。十、常见问题分析与对策1、PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。2、假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及，PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。(1) 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。(2) 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。(3) 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。(4) Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。(5) 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。(6) 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。(7) 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。3、假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。(1) 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。(2) 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。4、出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。5、出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。十一、PCR技术应用进展PCR技术自1985年建立以来，发展之迅速、应用之广泛，表明其具有强大的生命力。近些年来，基于PCR的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对PCR技术进行研究和改进，使PCR技术得到了进上步地完善，并在此基础上派生出了许多新的用途。1、原位PCR技术原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。蛋白酶K消化处理：用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K。PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增。有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。杂交：PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。显微镜观察结果。原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。其特异性和敏感性高于一般的PCR。2、连接酶链反应连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)，是一种新的DNA体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。连接酶链反应是Backman1997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明，并申报了专利。1988年Landegren也进行了该项研究。1988年Backman等又因分离热稳定的连接酶，而申报专利，1991年Backman和Barany分别用耐热DNA连接酶进行了LCR试验。耐热DNA连接酶可以在热循环中保持活性，提高连接反应的特异性，排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁琐程序。LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增。其程序为：在模DNA、DNA连接酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下，首先加热至一定温度下(9495)使DNA变性，双链打开，然后降温退火(65)，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增。若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物。LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为2026个，以保证引物与靶序列的特异性结合，LCR识别点突变的特异性高于PCR，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性。LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高。LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94min变性和65复性并连接，循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。3、依赖核酸序列的扩增依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，又称自主序列复制系统(self-sustainedsequence replication，3SR)或再生长序列复制技术。1990年Guatelli等首先报道了这一技术。NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序。该反应有赖于AMV逆转录酶，T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同协作而完成。NASBA反应体系中除含有上述三种酶外，还含有dNTP，NTP(核糖核苷)，两种特殊的引物和缓冲液。引物I3末端与靶序列互补，5端含T7RNA多聚酶的启动子，这一引物是用于合成cDNA的。引物的碱基序列与cDNA的5未端互补。在NASBA反应时，首先引物与RNA模板复性(结合)，AMV逆转录酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一条单链的DNA;引物随即与此cDNA的5未端结合，逆转录酶在此DNA模板的指导下合成第二条DNA链。这样形成的DNA双链含有T7RNA多聚酶的启动子。该酶即以此DNA为模板，转录出与样品RNA序列相同的RNA链，而且每条DNA模板在该酶的作用下可合成约100个拷贝的RNA。每条新的RNA又可作为逆录酶的模板合成cDNA。如此反复进行，将获得更多的RNA和cDNA。其基本方法为：将引物，标本加入扩增反应液，651min使RNA分子二级结构打开，降温至37加入逆转录酶，T7RNA聚合酶和RNaseH，并在37反应11.5小时，其产物经琼脂糖电泳，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，忠实性高，其扩增效率高于PCR，特异性好。4、转录依赖的扩增系统转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplification system，TAS)，是Kwen等人于1989年研究报道的，主要用于扩增RNA。合成A、B引物，引物A的3末端与待扩增RNA互补，其5端有T7RNA多聚酶的启动子信息。逆转录酶以A引物为起点合成cDNA;引物B与此cDNA3端互补合成cDNA第二链。逆转录酶除具有逆转录活性外，还有DNA多聚酶的活性及RNaseH的活性。T7RNA多聚酶又以此双链DNA为模板。转录出与待扩增RNA一样的RNA，这些RNA又可作为下轮反应的模板。T7RNA多聚酶的催化效率很高，一个模板可转录10103个RNA拷贝，因而反应液中待检RNA的数量以10的指数方式扩增。TAS的主要特点是扩增效率高，因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加，只需6个循环靶序列的拷贝数就能达到2106。它的另一个特点是特异性高，由于TAS只能进行6次温度循环，错掺率低，加之用葡聚糖珠夹心杂交，因而特异性也高。虽然本法有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和T7RNA多聚酶，有待进一步研究。5、Q复制酶反应Kacian等于1972年首次报报Q复制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板的自我复制功能，它能在常温30min，将其天然模模MDV-1RNA扩增至109。1986年Chu等报道用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交，经洗脱未被结合的MDV-1后，再加入Q复制酶，扩增复制MDV-1拷贝，然后用溴乙锭染色检测或用同源性的第二探针杂交。Q复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，它有3个特点：不需寡核苷酸引物的引导就可启动RNA的合成。能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有的RNA折叠结构。在Q复制酶的天然模板MDV-1RNA的非折叠结构区插入一短的核酸序列不影响该酶的复制。因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被Q复制酶扩增。1988年Lizardi等，将靶基因序列插进MDV-1质粒里，用T7RNA聚合酶催化转录出MDV-1RNA探针，这种RNA探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针，加入Q复制酶来扩增探针，被扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增。其产物按上述两种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复制等技术。标记PCR和彩色PCR标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利同位素或荧光素对PCR引物的5端进行标记，用来检测靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧光染料;标记引物的5端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物5的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等。反向PCR反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。不对称PCR不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为501001.在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双键DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA。不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定。重组PCR使两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR(recombinant PCR)。Mullis等于1986年报道了由PCR扩增的两个DNA片段通过重组合后再经延伸而制备出新的DNA分子。其基本原理为将突变碱基，插入或缺失片段，或一种物质的几个基因片段均设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。其产物将是一重组合的DNA。重组PCR主要用于位点专一碱基置换，DNA片段的插入或缺失DNA片段的连接(如基因工程抗体)。多重PCR一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR的用途主要有两方面：1.多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染，可系统组合的有：肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲